陳勝杰，高 翔，袁戎宇

(廣東怡和科潔科技有限公司，廣東 佛山 528000)

酵母作為最常見的單核真菌，在人類歷史上起到了舉足輕重的作用。在很早以前，人們就懂得利用酵母釀果酒、發(fā)酵面包等[1]。近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，啤酒飲料的消費熱度居高不下，其中的發(fā)酵菌主力就是釀酒酵母[2]。為了滿足大眾的需求和口味，科研工作者們一直致力于研發(fā)更高效穩(wěn)定的工程菌，例如能耐高溫、耐高乙醇的釀酒酵母就是科學(xué)家一直努力的方向[3]。筆者致力于通過分子生物學(xué)基因改造手段，對出發(fā)菌株有目的地加強熱休克蛋白的表達，通過整合質(zhì)粒過表達的形式，對sym1和hsp104兩個基因過表達，觀察改造菌的高溫高乙醇的生物學(xué)性狀，并通過代謝流量分析等手段，評判其改造效果，為以后的研究提供參考。

sym1來自釀酒酵母S288C(S.cerevisiaeS288C)，是編碼釀酒酵母熱休克蛋白的關(guān)鍵基因，在熱休克期間，sym1基因具有耐高溫和耐乙醇的抗性，其功能和壓力誘導(dǎo)的酵母MPV17功能相似[4]。hsp104基因來自馬克思克魯維酵母DMKU3-1042，也是編碼熱休克蛋白的關(guān)鍵基因，能夠在高溫(37～45 ℃)高乙醇脅迫下發(fā)揮作用，抑制細(xì)胞裂解死亡，提高細(xì)胞存活率[5]。Sales等[6]利用缺失突變體實驗已經(jīng)證實了Hsp104p可以直接影響釀酒酵母的乙醇耐性；Sanchez等[5]測試了hsp104突變體的乙醇耐受性與親本菌株的差別，研究結(jié)果證明熱誘導(dǎo)后，親本菌株可耐受20%的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)，而突變株則不能承受該乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試劑盒：均購自北京博邁德科技發(fā)展公司；質(zhì)粒：酵母過表達質(zhì)粒-YCplac33，遺傳標(biāo)記為Ampr，URA3，購自金唯智生物科技有限公司；出發(fā)菌株：釀酒酵母S.cerevisiaeYH，來自筆者公司菌種保藏庫。引物見表1。

表1 引物設(shè)計列表Table 1 Primer design list

注：帶下劃線的斜體部分堿基序列為對應(yīng)的酶切位點序列。

實驗設(shè)備：電擊轉(zhuǎn)化儀，德國eppendorf公司；MiniSpin高速離心機，德國eppendorf公司；電泳儀(DYY-6C)，北京六一儀器廠；數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)，上海天能凝膠成像系統(tǒng)公司；PCR儀，德國eppendorf公司。

1.2 方 法

1.2.1 菌株S.cerevisiaeYH+的構(gòu)建

1) 構(gòu)建過表達質(zhì)粒YCplac33-sym1

根據(jù)酵母染色體上基因Sym1上下游序列進行引物設(shè)計。以S.cerevisiaeS288C染色體DNA為模板，分別以Sym1F和Sym1R兩對引物作為下游引物。按照體系添加到擴增管中進行PCR擴增，所得的PCR產(chǎn)物長度為979 bp(為保證片段的完整性，實際片段長594 bp，對其上下游均延長200 bp設(shè)計引物)，PCR擴增體系見表2。PCR擴增程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸2 min；重復(fù)第2～4步驟，循環(huán)25次；72 ℃延伸10 min；-20 ℃保藏。

表2 PCR擴增體系Table 2 PCR amplification system

用EcoRⅠ和KasⅠ分別對克隆基因Sym1的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒YCplac33載體進行雙酶切消化，然后分別將目的基因片段進行回收純化，將外源PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體按適當(dāng)比例進行連接，然后挑選轉(zhuǎn)化子進行雙酶切驗證得到正確的克隆[7]。雙酶切連接sym1體系見表3。

表3 雙酶切連接sym1體系Table 3 Double enzyme cleavage linkage system of gene sym1

2) 過表達質(zhì)粒YCplac33-sym1-hsp104

根據(jù)馬克思克魯維酵母DMKU3-1042(KluyveromycesmarxianusDMKU3-1042，記作K.marmianusD3)染色體上基因hsp104的上下游序列進行引物設(shè)計。以K.marmianusD3染色體DNA為模板，分別以Hsp104F和Hsp104R作為基因的擴增引物，按照PCR體系添加到擴增管中進行PCR擴增。所得的PCR產(chǎn)物長度為2 933 bp(為保證片段的完整性，實際片段長2 727 bp，對其上下游均延長200 bp設(shè)計引物)。然后雙酶切連接hsp104基因，對應(yīng)的雙酶切位點是Hind Ⅲ、BamHⅠ。采用與sym1類似的辦法，將hsp104基因連接到質(zhì)粒YCplac33載體上，具體的酶切體系見表4。構(gòu)建得到過表達質(zhì)粒YCplac33-sym1-hsp104(記作：Y Cplac33-SH)。

表4 雙酶切連接hsp104體系Table 4 Double Enzyme cleavage linkage system of gene hsp104

3) 構(gòu)建含表達質(zhì)粒YCplac33-SH的菌株S.cerevisiaeYH+。

將構(gòu)建成功的質(zhì)粒YCplac33-SH，電轉(zhuǎn)化入S.cerevisiaeYH的感受態(tài)細(xì)胞中，然后挑選轉(zhuǎn)化子進行PCR驗證，得到正確的陽性轉(zhuǎn)化子。斜面富集培養(yǎng)后，用無菌水沖刷，并與體積分?jǐn)?shù)為30%的無菌甘油溶液1∶1混合于保菌管中，-20 ℃保藏備用[8]，改造菌株記作S.cerevisiaeYH+。

1.2.2 高溫高乙醇脅迫驗證實驗

將改造菌置于不同溫度和不同乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度脅迫下進行測試[9]。其中，溫度梯度實驗在10%乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)下進行，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度實驗在32 ℃下進行。最后選取適當(dāng)?shù)臏囟葪l件(接近50%存活率)，進行乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度存活率實驗。

1.2.3 利用代謝網(wǎng)路分析驗證改造菌的代謝通路變化

代謝通量分析主要采用化學(xué)計量網(wǎng)絡(luò)分析提供可平衡及可計算的代謝反應(yīng)，確定細(xì)胞內(nèi)各代謝物的通量分布。筆者以Nissen等[10]代謝模型為標(biāo)準(zhǔn)，參考曹利民[4]擬穩(wěn)態(tài)方程組，S×r=0。其中S為化學(xué)計量系數(shù)矩陣，r是37個變量的向量，在擬穩(wěn)態(tài)下該模型有27個化合物處于平衡態(tài)，所以該模型的自由度為10。通過測定工程菌株和出發(fā)菌株分批發(fā)酵過程中相關(guān)實驗數(shù)據(jù)，計算在對數(shù)生長期14～15 h各菌株達到的最大比生長速率，計算并比較改造菌和出發(fā)菌株在發(fā)酵前后的通量分布差異，用來考察基因修飾策略是否正確。

2 實驗結(jié)果

2.1 菌株S.cerevisiae YH+構(gòu)建過程中的相關(guān)電泳圖及生長曲線

S.cerevisiaeYH+菌株陽性轉(zhuǎn)化子雙酶切驗證PCR電泳圖如圖1所示。其中，圖(a)為過表達質(zhì)粒YCplac33-sym1的EcoR Ⅰ、KasⅠ雙酶切電泳圖(1 140 bp和5 442 bp，質(zhì)粒大小6 582 bp)；圖(b)為過表達+質(zhì)粒Y Cplac33-SH的Hind Ⅲ、BamH Ⅰ雙酶切電泳圖(2 963 bp和6 552 bp，質(zhì)粒大小9 515 bp)。

M—marker；1—雙酶切后線性質(zhì)粒和sym1基因；2—雙酶切后線性質(zhì)粒和hsp104基因。圖1 S.cerevisiae YH+菌株陽性轉(zhuǎn)化子雙酶切驗證PCR電泳圖Fig.1 PCR electrophoresis strip of S.cerevisiae YH+positive transmutator double enzyme digestion

從雙酶切PCR電泳條帶可以看出：質(zhì)粒Y Cplac33-SH已成功轉(zhuǎn)入菌株S.cerevisiaeYH體內(nèi)，得到改造菌S.cerevisiaeYH+。

測定改造菌株S.cerevisiaeYH+的生長曲線：于37 ℃，200 r/min，250 mL搖瓶裝液量30 mL培養(yǎng)，每4 h取樣一次，共培養(yǎng)36 h，測其OD600值，并繪制生長曲線，結(jié)果如圖2所示。

圖2 改造菌與出發(fā)菌的生長曲線對比Fig.2 Comparison of growth curve of modified bacteria and original bacteria

由圖2可知：改造菌的生長趨勢與出發(fā)菌大致相同，菌株生長的對數(shù)期在8～20 h，OD600最高值為31.7，較出發(fā)菌(33.6)有輕微下降，分析原因，可能是質(zhì)粒導(dǎo)入后，增加了菌株的生長壓力[11]。

2.2 菌株S.cerevisiae YH+的高溫高乙醇脅迫實驗

為了檢驗改造菌的耐高溫高乙醇能力，在不同發(fā)酵溫度梯度和發(fā)酵液中不同的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度條件下，對改造菌進行沖擊測試，考察菌細(xì)胞存活率。其中，溫度梯度實驗在10%乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下進行，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度實驗在32 ℃下進行。最后在接近50%存活率的溫度下，進行乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度存活率實驗。具體的壓力脅迫梯度見表6，具體結(jié)果如圖3，4所示。

表6 脅迫條件梯度表Table 6 Pressure stress ladder

圖3 10%乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，不同溫度對菌株存活率的影響Fig.3 Influences of different temperature on the survival rate of strains under 10% ethanol

圖4 32 ℃下不同乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對菌株存活率的影響Fig.4 Influences of different ethanol concentrations on the survival rate of strains under 32 ℃

由圖3可知：在10%乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)下培養(yǎng)10 h，改造菌在常溫28，32 ℃時，菌株存活率比出發(fā)菌略高，分別為92.7%和89.1%，比出發(fā)菌分別高出7.2%和5.9%，但相差不明顯。而在溫度進一步升高后，即40 ℃和45 ℃時，改造菌的抗高溫能力得到了較好的體現(xiàn)，其細(xì)胞存活率相比出發(fā)菌優(yōu)勢愈發(fā)明顯，具體表現(xiàn)為在40 ℃時，改造菌的細(xì)胞存活率為51.3%，明顯高于出發(fā)菌的36.7%，這一情況在45 ℃時更加明顯，但由于改造菌本身的存活率也只有31.2%左右，故筆者在10%乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，選擇較理想的高溫為40 ℃。

由圖4可知：當(dāng)在32 ℃下培養(yǎng)10 h，小于10%的發(fā)酵液乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對菌體的存活率影響較小，改造菌的存活率在0%和5%乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)時分別為99.5%和96.7%，與出發(fā)菌差別不大(同條件下為99.2%和91.5%)，但當(dāng)進一步提升乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)后，其影響較大。尤其在20%乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)時，改造菌的菌體存活率降低最多，為53.2%，但相比出發(fā)菌(24.8%)仍有很大的提高。

為了進一步研究改造菌在高溫高乙醇下的耐受能力，筆者選擇在40 ℃(存活率高于50%)培養(yǎng)溫度下，依次改變乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)，觀察菌株的生長性狀和菌體存活率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 40 ℃下不同乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù) 對菌株存活率的影響Fig.5 Influences of different ethanol concentrations on the survival rate of strains under 40 ℃

由圖5可知：40 ℃下培養(yǎng)時，即使在0%的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，改造菌和出發(fā)菌的存活率均有較大的下降，分別為62.8%和43.1%，可見溫度對菌體的生理影響較為顯著。當(dāng)溫度聯(lián)合乙醇壓力共同作用菌體時，其破壞影響更為顯著，在20%乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，這一對比最為明顯，改造菌和出發(fā)菌的菌體存活率分別為31.2%和2.1%，可以看出出發(fā)菌在高溫高乙醇的連續(xù)沖擊下，菌株存活率僅為2.1%，接近于0；而改造菌雖然已有較大的菌株死亡，但其菌株存活率仍維持在30%以上，其抗高溫高壓性能提升幅度明顯。

2.3 菌株S.cerevisiae YH+的代謝流量分析

圖6 釀酒酵母代謝網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 The map of metabolic network of S.cerevisiae

通過代謝通量數(shù)據(jù)分析，得到出發(fā)菌和改造菌的代謝流分布數(shù)據(jù)表，結(jié)果如表7所示。

由表7可知：在14～15 h內(nèi)，改造菌株S.cerevisiaeYH+及對照菌株糖酵解途徑的通量r2均顯著大于磷酸戊糖途徑的通量r13，說明糖酵解依然是葡萄糖中心碳代謝的主要途徑；過表達基因sym1(類mpv17蛋白基因)和hsp104兩個熱休克家族蛋白關(guān)鍵基因，能強化r7、r8和r9的代謝流，并減少r10和r16代謝流，從而使碳代謝流向合成乙醇方向增加，增加合成乙醇的通量。

表7 改造菌與出發(fā)菌的代謝通量數(shù)據(jù)Table 7 Metabolic flux of modified bacteria and original bacteria

3 討 論

過表達基因sym1和hsp104，均為熱休克家族蛋白的關(guān)鍵基因，其單獨缺失均可增加細(xì)胞膜的通透性，并提高觸發(fā)高溫防御機制的敏感度[12-13]。研究表明：乙醇還會損傷細(xì)胞內(nèi)的線粒體，從而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的活性氧的產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，過表達熱激蛋白關(guān)鍵基因，可有效提高菌體的抗氧化能力，從而提高菌體的抗高質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇毒害能力，使細(xì)胞存活率在高溫高乙醇環(huán)境下保持理想水平[14-16]；改造菌可能在增加乙醇合成通量的過程中，為了維持菌體內(nèi)部的代謝穩(wěn)態(tài)，觸發(fā)了耐乙醇毒害因子(具體的物質(zhì)需要后續(xù)通過實時的氣質(zhì)聯(lián)用檢測系統(tǒng)對其液態(tài)與氣態(tài)發(fā)酵成分進行檢測確定)的合成與反饋調(diào)節(jié)[17]；據(jù)劉月芹[18]文獻報道，耐高溫高乙醇能力強的菌株，具有有較好的細(xì)胞壁完整性、較高的海藻糖積累量、較強的抗氧化性、乙醇耐受性和能量代謝等特點。

通過代謝流量分析，過表達基因sym1(類mpv17蛋白基因)和hsp104兩個熱休克家族蛋白關(guān)鍵基因，可以增加合成乙醇的關(guān)鍵途徑r7,r8和r9的反應(yīng)，并抑制消耗合成乙醇前提物Pyr(丙酮酸)和Aca(乙醛)的r10和r16的反應(yīng)，從而增加乙醇的合成量。其中，r7為PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)到Pyr(丙酮酸)途徑，r8為Pyr(丙酮酸)到Aca(乙醛)途徑，r9為Aca(乙醛)到Eth(乙醇)途徑；r10為Aca(乙醛)到NADPH途徑，r16為Pyr(丙酮酸)到乙酰輔酶A，進入三羧酸循環(huán)的途徑。整體上刺激碳代謝流向合成乙醇方向增加，增加合成乙醇的通量。

4 結(jié) 論

采用分子生物學(xué)和代謝網(wǎng)絡(luò)分析等手段，優(yōu)化整合釀酒酵母的代謝網(wǎng)絡(luò)，通過過表達關(guān)鍵基因sym1和hsp104，強化熱休克蛋白的表達，使出發(fā)菌釀酒酵母的耐乙醇能力顯著提升，最終使改造菌在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，40 ℃發(fā)酵溫度的條件下，能夠保持接近35%的細(xì)胞存活率，在同等條件下，出發(fā)菌株的存活率僅為2.1%。本研究將為后續(xù)的耐乙醇釀酒酵母工程菌的開發(fā)提供參考價值，但是仍存在一些不足之處，比如未能將質(zhì)粒過表達的形式轉(zhuǎn)化為染色體基因組整合，這樣會使改造菌性能更穩(wěn)定，另外對基因sym1和hsp104的強化表達與增加改造菌抗高溫高藝純的能力之間的深層機理未做過多探究，這些都需要在后續(xù)的實驗工作中著重探討。