李悅明，徐洪清，徐建春，逄瑞蓮，徐炳政

(1.青島瑯琊臺集團股份有限公司，山東 青島 266400；2.青島西海岸新區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 青島 266400；3.青島西海岸新區(qū)市場監(jiān)督管理局，山東 青島 266400)

花生四烯酸(Arachidonic acid，簡稱ARA)，屬于ω-6系列的多不飽和脂肪酸，在體內(nèi)發(fā)揮多種生物功能，它不僅作為一種極其重要的結(jié)構(gòu)脂類廣泛存在于哺乳動物的細胞膜上，而且是人體前列腺素、血栓素和白三烯等活性物質(zhì)合成的前體物質(zhì)。因其功能的多樣性，ARA已在保健食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1]。長期以來，ARA的主要來源是動物肝臟、魚油和豬腎上腺等動物組織，但動物組織中ARA含量低且來源有限，不能滿足市場的需要。微生物法生產(chǎn)ARA具有發(fā)酵周期短、不受季節(jié)和來源限制等特點，受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[2]。目前，高山被孢霉已經(jīng)成為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)ARA的最佳菌株，然而，產(chǎn)量低和成本高仍然是利用高山被孢霉大規(guī)模生產(chǎn)ARA的瓶頸。因此提高ARA在培養(yǎng)過程中的生產(chǎn)效率，成為本領(lǐng)域的研究熱點[3，5]。

直鏈或支鏈羧酸，包括短鏈脂肪酸(SCFA，Short-chain fatty acid)如乙酸、丙酸、丁酸等，可以提供?；o酶A作為脂肪酸合成的起始單元[4]，而用于脂肪酸生物合成的還原力——NADPH的產(chǎn)生則主要取決于蘋果酸酶(ME，Malic enzyme)[7]。研究表明SCFA可以被某些海藻利用[6-8]。筆者研究了包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸(2-甲基丙酸)、戊酸和異戊酸(3-甲基丁酸)在內(nèi)的6種不同SCFAs對高山被孢霉中油脂積累和脂肪酸生物合成的影響。發(fā)酵過程中，將6種SCFAs分別加入不同實驗組的培養(yǎng)基中，嘗試提供各種?；鵆oA底物，通過檢測各組實驗不同階段細胞生長速率差異、脂肪酸組成和ME活性的變化研究高山被孢霉中ARA生物合成的代謝調(diào)控機理。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)條件

實驗菌株為高山被孢霉LYT22(MortierellaalpinaLYT22)，此菌株由野生型菌株高山被孢霉M32222菌株誘變而來，由筆者公司自行保存。

PDA培養(yǎng)基1 L：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g(用于平板保存)。

種子培養(yǎng)基1 L：葡萄糖30 g，酵母提取物6 g，KH2PO43 g，NaNO32.8 g，MgSO4·7H2O 0.5 g。

發(fā)酵培養(yǎng)基1 L：葡萄糖80 g，酵母提取物11 g，蛋白胨10 g，檸檬酸三鈉鹽2 g，KH2PO43.8 g，NaNO33.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g。

乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、三氯甲烷：分析純，購于青島精科儀器試劑有限公司。

種子在25 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)3 d，然后按V(種子量)∶V(發(fā)酵量)=1∶10接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7 d。分批補料發(fā)酵實驗是在5 L Biostat?B發(fā)酵罐中進行，配有pH、溫度、攪拌和溶解氧質(zhì)量濃度(DO)傳感器。初始裝填3 L發(fā)酵培養(yǎng)基，在固定的4.5 L/min氣流速率下自動調(diào)節(jié)攪拌速度為200～500 r/min，使DO保持在20%以上。利用m(葡萄糖)∶V(補料液)=3 g∶10 L的葡萄糖溶液作為補料培養(yǎng)基流加至培養(yǎng)基中，將葡萄糖質(zhì)量濃度維持在10～15 g/L，在排氣口增加水冷系統(tǒng)，以減少蒸發(fā)。

在此發(fā)酵條件下，培養(yǎng)基的pH逐漸升高，因此將乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸或戊酸中的一種短鏈脂肪酸作為pH調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基，將pH控制在6.5，在對照組中添加3 mol/L HCl，保持pH值為6.5。由于某些SCFA(例如丁酸和戊酸)具有強烈的刺激性氣味，因此所有實驗均在通風室內(nèi)進行，并且排出尾氣先經(jīng)5 mol/L NaOH溶液吸收，然后再經(jīng)過填充滿活性炭的柱子吸附后，排放到環(huán)境。

1.2 生物量測定

實驗中生物量以干細胞質(zhì)量(DCW)表示。將細胞懸浮液的樣品(30 mL)在7 000g和4 ℃條件下離心10 min，用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液洗滌2次，將細胞沉淀，在-50 ℃條件下冷凍干燥至恒重。

1.3 脂質(zhì)提取與脂肪酸分析

使用改良的Bligh-Dyer算法計算總脂質(zhì)含量[9]。室溫下，將干燥的細胞提取到10 mL氯仿甲醇混合液(V(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1)中，用無水Na2SO4干燥脂質(zhì)提取物，通過蒸發(fā)除去溶劑，稱重計算總脂質(zhì)。將提取的脂質(zhì)約10 mg溶解在1 mL氯仿中，加入3 mL硫酸-甲醇溶液(V(硫酸)∶V(甲醇)=2∶100)，85 ℃下孵育150 min，獲得脂肪酸甲酯(FAME)。脂肪酸甲酯(FAME)用正己烷萃取，采用氣相色譜法(GC)測定。使用HP-INNOWAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細管柱分離FAME。柱箱初始溫度設(shè)置為100 ℃，持續(xù)1 min，然后以15 ℃/min的速度升至250 ℃，保持5 min。分流比為V(進樣)∶V(分流)=1∶19，用氮氣作載氣，使用氫火焰離子檢測器(FID)進行檢驗，進樣口和火焰離子化口的溫度為260 ℃，進樣量為1 μL。

1.4 細胞裂解液制備

為了制備用于酶活測定的細胞提取物，將收獲的菌體以7 000g離心，先用4 ℃的蒸餾水洗滌沉淀物，然后用洗滌緩沖液(400 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH 7.4，m(甘油)∶V(水)=20 g∶100 L，1 mmol/L 二硫赤蘚糖醇(DTT))洗滌并懸浮。在60 MPa下通過細胞破碎儀(Constant systems)將細胞裂解，裂解液在4 ℃下10 000g離心10 min，將上清液立即用于測定ME活性。使用Bradford方法以牛血清白蛋白(BSA)為標準測定蛋白質(zhì)濃度。

1.5 NADP+依賴的蘋果酸酶酶活分析

在60 MPa下通過細胞破碎儀(Constant Systems)將細胞裂解，將裂解液在4 ℃下10 000g離心10 min，將上清液立即用于測定ME活性。使用Bradford方法以牛血清白蛋白(BSA)為標準測定蛋白質(zhì)濃度。通過分光光度法監(jiān)測25 ℃下NADPH的形成速率進行蘋果酸酶的活性[10]測定。反應(yīng)在包含50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)、0.5 mmol/L NADP+、20 mmol/L L-蘋果酸鹽和10 mmol/L MgCl2的1.0 mL反應(yīng)體系中進行。酶活性(U)的單位定義為每分鐘NADPH的增加量，以O(shè)D340增加0.001/min表示。比活性定義為U/mg蛋白。

1.6 葡萄糖濃度分析

每4 h從發(fā)酵罐中取出25 mL樣品，通過配備有葡萄糖氧化酶電極的生物傳感器(SBA-40E，山東省科學(xué)院生物研究所)對殘留的葡萄糖進行分析。

2 結(jié)果分析

2.1 短鏈脂肪酸對被孢霉細胞生長和脂質(zhì)積累的影響

在發(fā)酵過程中，各實驗組以pH調(diào)控的方式分別加入乙酸354 mL、丙酸261 mL、異丁酸124 mL、丁酸153 mL、異戊酸85 mL或戊酸89 mL，對照組以鹽酸調(diào)控pH。發(fā)酵結(jié)束時，發(fā)酵液中沒有或只有少量的短鏈脂肪酸檢測到，表明本研究中所有測試的短鏈脂肪酸均可被高山被孢霉充分利用。發(fā)酵結(jié)束后的生物量、總葡萄糖消耗量、總酸消耗量和碳轉(zhuǎn)化率如表1所示。

表1 短鏈脂肪酸對生物量、葡萄糖消耗、酸消耗和 碳轉(zhuǎn)化率的影響(總體積為3.5 L)

注：碳的總摩爾數(shù)是葡萄糖消耗中的碳摩爾數(shù)與酸消耗中的碳摩爾數(shù)之和。

添加短鏈脂肪酸時，總葡萄糖消耗量相應(yīng)減少，同時，每mol碳到生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率也因添加短鏈脂肪酸的不同而發(fā)生變化：加入乙酸和丙酸時，細胞內(nèi)油脂含量增加使碳轉(zhuǎn)化率從9.7 g/mol降低到約7.3 g/mol，加入丁酸、戊酸后，被孢霉油脂積累受到抑制，碳轉(zhuǎn)化率逐漸恢復(fù)至9.0 g/mol。

向發(fā)酵體系中流加入各種短鏈脂肪酸時，乙酸和丙酸不影響被孢霉的正常生長，總生物量分別達到53.9 g/L和52.2 g/L，與對照組相仿。但隨著碳鏈長度的增加，短鏈脂肪酸的毒性逐漸增加，被孢霉的生長逐步受到影響，生物量減少，向培養(yǎng)基中加入戊酸時，被孢霉生物量只有37.8 g/L，僅為對照組的75.6%，如圖1(a)所示；短鏈脂肪酸也對高山被孢霉脂質(zhì)的蓄積產(chǎn)生了顯著的影響，如圖1(b)所示。發(fā)酵3 d后，對照組、乙酸組和丙酸組細胞進入脂質(zhì)快速蓄積時期，其他實驗組的脂質(zhì)蓄積受到了抑制，蓄積速率顯著低于前三者。發(fā)酵結(jié)束時，乙酸組和丙酸組的脂質(zhì)質(zhì)量分別為細胞干質(zhì)量的46.8%和40.8%，高于對照組的37.4%，這是由于體系中的乙酸和丙酸不僅可以作為被孢霉生長的碳源，也可以直接為細胞中脂肪酸合成提供底物，從而促進細胞脂質(zhì)的積累[11-12]；丁酸和戊酸組的脂質(zhì)含量顯著降低，其中戊酸處理組中脂質(zhì)質(zhì)量分數(shù)僅為25.5%。實驗結(jié)果表明：隨著短鏈脂肪酸中碳鏈的增長，被孢霉細胞脂質(zhì)的積累受到明顯抑制并急劇減少。

圖1 短鏈脂肪酸對高山被孢霉發(fā)酵過程中細胞生長 和脂質(zhì)積累的影響Fig.1 Effects of short chain fatty acids on cell growth and lipid accumulation during fermentation of Mortierella alpina

已有研究結(jié)果證實蘋果酸酶是脂質(zhì)生物合成中為脂肪酸合酶提供NADPH的關(guān)鍵酶，其他NADPH產(chǎn)生酶，例如NADP+依賴性異檸檬酸脫氫酶、葡萄糖6-磷酸脫氫酶和6-磷酸葡糖酸脫氫酶僅對脂質(zhì)積累過程中NADPH的供應(yīng)起輕微作用[13-14]。為了表征本研究中NADPH的生成，筆者檢測了所有實驗組中蘋果酸酶的活性，結(jié)果如圖2所示。

圖2 短鏈脂肪酸對被孢霉中蘋果酸酶活性的影響Fig.2 The effect of short chain fatty acids on the activity of malic acid enzyme in Mortierella sp.

由圖2可知：除了戊酸和異戊酸處理組外，其他組中的蘋果酸酶活性均具有相似的變化趨勢，在早期脂質(zhì)積累階段(發(fā)酵前3 d)，脂質(zhì)積累很慢，所有ME活性均低于110 U/mg；隨后，在脂質(zhì)快速合成階段(4～6 d)，ME活性迅速增加到250 U/mg以上，促使細胞中大量脂質(zhì)積聚；在整個發(fā)酵過程中，戊酸處理組的ME活性均低于70 U/mg，表明NADPH供應(yīng)不足，最終導(dǎo)致脂質(zhì)在細胞中的積累很少。

2.2 短鏈脂肪酸對被孢霉脂肪酸組成的影響

添加短鏈脂肪酸使高山被孢霉的脂肪酸組成產(chǎn)生了顯著變化。發(fā)酵過程中高山被孢霉脂肪酸的主要變化如圖3所示，發(fā)酵結(jié)束時各組菌株的脂肪酸組成如表2所示。

圖3 發(fā)酵過程中被孢霉脂肪酸組成的主要變化Fig.3 Major changes in fatty acid composition of Mortierella during fermentation

表2 發(fā)酵結(jié)束后各實驗組高山被孢霉的脂肪酸組成
Table 2 Fatty acid composition ofMortierellaalpinain each experimental group after fermentation

脂肪酸脂肪酸質(zhì)量分數(shù)/%對照組乙酸丙酸丁酸異丁酸戊酸異戊酸C14:01.4401.4471.1801.6752.6020.3040.794C15:00.6930.69313.2240.8971.6137.4794.516C16:020.6599.5595.43716.62714.0909.03915.741C17:00.2800.2585.5760.3300.88810.9423.316C18:015.21710.6907.91018.74123.69313.38115.285C18:112.96511.56910.59111.47111.89310.68111.385C18:27.2268.9446.3438.3387.15110.4269.043C18:38.1588.2175.4867.8526.83910.1298.487C20:00.3110.5100.5890.1810.1510.2110.170C20:30.2250.2170.2680.3050.1610.0860.386C20:4(n-6,ARA)32.29847.29842.26732.80830.06426.16829.772C22:00.3150.2300.3680.2200.3050.2550.323

由圖3可知：當添加的脂肪酸碳鏈長度較短時(如乙酸、丙酸)，細胞中可用于脂肪酸合成的還原力NADPH大量增加，促使脂肪酸合成向末端進行，細胞中花生四烯酸(ARA)質(zhì)量分數(shù)顯著上升，分別達到總脂肪酸質(zhì)量的47.3%和42.2%。

當將奇碳鏈脂肪酸(丙酸、戊酸)加入培養(yǎng)基中時，脂肪酸組成發(fā)生了巨大變化。補充丙酸后，細胞脂肪酸中奇數(shù)鏈脂肪酸(十五酸、C15:0、十七酸、C17:0)的質(zhì)量分數(shù)急劇增加，尤其是十五碳酸，可以達到總脂肪酸質(zhì)量的13%以上。此現(xiàn)象可能是由于被孢霉細胞將丙酸轉(zhuǎn)化為丙酰輔酶A并隨后被脂肪酸合酶利用所致[15-16]。在戊酸處理組中，十七酸的質(zhì)量分數(shù)也顯著高于其他組，達到10%左右。

此外，筆者還檢測了戊酸處理對被孢霉脂質(zhì)積累影響過程的沖擊可逆性。實驗在發(fā)酵3 d時停止添加戊酸，改用流加HCl控制pH，結(jié)果如圖4(a，b)所示。

圖4 戊酸對被孢霉發(fā)酵過程中脂質(zhì)積累和蘋果酶活性的可逆影響Fig.4 Reversible effects of valeric acid on lipid accumulation and malic enzyme activity during fermentation of Mortierella

由圖4可知：消除戊酸壓力后，ME活性迅速增加至220.94 U/mg，4 d時被孢霉脂質(zhì)質(zhì)量分數(shù)僅為14.42%，到發(fā)酵結(jié)束時脂質(zhì)質(zhì)量分數(shù)提升32%，說明去除戊酸脅迫后，被孢霉細胞活性得以恢復(fù)，ME活性的增加迅速增強了脂質(zhì)蓄積。

3 結(jié) 論

乙酸和丙酸不影響被孢霉的生長和脂質(zhì)積累，添加乙酸時生物量和油脂質(zhì)量分數(shù)最高分別可達到53.9 g/L和46.8%。隨著碳鏈長度的增加，短鏈脂肪酸的毒性逐漸增加，被孢霉的生長逐步受到影響，導(dǎo)致油脂積累減少；酶活分析結(jié)果證實蘋果酸酶的活性與細胞中脂質(zhì)的積累量呈正相關(guān)關(guān)系，當把奇碳鏈脂肪酸(丙酸、戊酸)加入培養(yǎng)基中時，細胞中奇數(shù)鏈脂肪酸(十五酸和十七酸)質(zhì)量分數(shù)顯著提升，最高可以達到總脂肪酸質(zhì)量的10%以上；此外，研究還證明了山被孢霉的影響是可逆的，移除脅迫后細胞生長可以恢復(fù)。