殷雪翠，湯有才，李 哲， 李恩耀，李元梟， 李璇璇， 鄭鵬遠

1 ) 鄭州大學第五附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州大學第五附屬醫(yī)院兒科 鄭州 450052 3) 鄭州大學第五附屬醫(yī)院兒童康復科 鄭州 450052 4) 鄭州大學第五附屬醫(yī)院河南省康復醫(yī)學重點實驗室 鄭州 450052 5) 鄭州大學第五附屬醫(yī)院河南省慢性肝損傷國際聯(lián)合實驗室 鄭州 450052 6)鄭州大學第五附屬醫(yī)院康復科 鄭州 450052 7)鄭州大學第五附屬醫(yī)院兒童腦癱科 鄭州 450052

肝纖維化的特征是細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)在細胞外間隙中過度積累。多種慢性肝病，包括非酒精性脂肪性肝炎，均可能發(fā)展成肝纖維化。肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)活化是肝纖維化發(fā)展的核心步驟，活化的HSC是α-SMA和膠原蛋白的主要來源。因此抑制HSC活化或誘導其凋亡是有效對抗肝纖維化的途徑。有證據(jù)[1-5]表明細胞內(nèi)脂質(zhì)含量可能影響HSC的活化。Perilipin5(Plin5)也稱富含氧化組織的PAT蛋白，是Perilipin家族一員。Plin5包被在存儲中性脂質(zhì)的脂肪滴表面，在脂質(zhì)代謝旺盛的組織中高度表達，例如棕色脂肪細胞[2]、骨骼肌細胞[3]、心肌細胞[4]和肝細胞[6]等。蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)又稱依賴cAMP的蛋白激酶，其活化可使多種蛋白質(zhì)底物的絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化，進而調(diào)節(jié)靶蛋白活性，影響相關基因的表達。有研究[7]發(fā)現(xiàn)Plin1可通過PKA信號通路參與脂肪細胞的脂質(zhì)調(diào)控;Plin5在體外活化的HSC中表達降低[8]。本研究制備過表達Plin5的HSC，觀察PKA抑制劑H89應用對其增殖能力、凋亡的影響，探討Plin5是否能夠影響肝纖維化過程。

1 材料與方法

1.1細胞及主要試劑鼠肝星狀細胞株HSC-T6購于上海普諾賽(中國)公司，人腎上皮細胞293T由鄭州大學第五附屬醫(yī)院馬歇爾醫(yī)學研究中心保存。包膜質(zhì)粒pHR8.2ΔR和pCMV-VSVG由美國Saint Louis大學實驗室贈送。Lenti-XqRT-PCR慢病毒滴定試劑盒購于美國Clontech Laboratories公司。MTT購于美國Sigma公司。PKA抑制劑H89購于美國MedChen Express公司。t-PKA和磷酸化PKA(p-PKA)、Cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax、β-actin、GAPDH抗體均購于美國Santa Cruz公司。熒光EnzCheck?Caspase-3活性測定試劑盒購于美國Invitrogen公司。QuantScript RT及熒光定量檢測試劑盒購于日本TOYOBO公司。EcoRI、AgeI內(nèi)切酶均購于德國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2大鼠原代HSC的分離將雄性SD大鼠(200～250 g，購于鄭州市惠濟區(qū)華興實驗動物養(yǎng)殖場)以12 h光照、12 h黑暗循環(huán)的方式飼養(yǎng)在溫度控制(23 ℃)設施中，允許隨意獲得正常飲食和水。大鼠應用方案由鄭州大學動物管理和使用委員會批準。大鼠以水合氯醛麻醉，應用原位膠原酶灌注肝臟，灌注液經(jīng)密度梯度離心法分離得原代HSC(HSC-Primary)。

1.3Plin5慢病毒的制備使用Trizol試劑從大鼠肝組織中提取總RNA反轉錄得cDNA。PCR反應體系為25 μL。PCR引物(NCBI參考序列為NM_025874.3)：正義鏈5’-TTGCGAGAATTCACCATG GACCAGAGAGGTGAAGACA-3’，反義鏈5’-GTGGCGACCGGTGCGAAGTCCAGCTCTGGCATCATTG-3’。PCR反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 15 s,共40個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物(1 392 bp)用EcoRI和AgeI酶切后克隆到pFLRu載體中，制備pFLRu-Plin5表達質(zhì)粒。復蘇293T細胞，取指數(shù)生長期細胞，將pFLRu-Plin5、pHR8.2ΔR和pCMV-VSVG共轉染入293T細胞。48 h后收集細胞培養(yǎng)液用0.45 μm濾器過濾,于 4 ℃超速(72 000×g)離心120 min，以濃縮慢病毒。同法制備空病毒。使用Lenti-XqRT-PCR滴定試劑盒定量慢病毒濃度，調(diào)整病毒滴度為5×105Tu/mL。

1.4過表達Plin5的HSC細胞模型的制備將HSC-Primary 和HSC-T6細胞接種到24孔板，每孔1×105個，于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞密度達2×105個/孔。然后，加入5×105Tu/mL的空病毒或Plin5慢病毒液(10 μL/孔)，24 h后于熒光顯微鏡下觀察熒光標簽。應用Ploybrene篩選穩(wěn)定感染Plin5慢病毒的細胞株。

1.5實驗分組將HSC-Primary 和HSC-T6細胞均分為4組：空白對照組(未感染細胞)， 過表達Plin 5組，H89組(用H89處理未感染細胞)和Plin5+H89組(用H89處理過表達Plin5的細胞)。H89劑量為10 mg/L。細胞分組處理48 h后進行后續(xù)實驗。

1.6觀察指標

1.6.1 細胞增殖率 將細胞以1×104個/mL的濃度接種至96孔板，每組3個復孔。培養(yǎng)24 h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)于37 ℃孵育1 h，PBS洗滌細胞，加入DMSO振蕩混勻(使結晶充分溶解)，用酶標儀檢測490 nm波長處的光密度值。以不含細胞的培養(yǎng)液孔為調(diào)零孔。細胞增殖率=(待測組光密度-調(diào)零孔光密度)/(空白孔光密度-調(diào)零孔光密度)×100%。實驗重復3次。

1.6.2 Plin5、t-PKA、p-PKA、Cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax蛋白的表達 采用Western blot法檢測。按照1.5分組處理48 h后收集細胞，用RIPA裂解細胞得總蛋白。制備120 g/L的SDS-PAGE，蛋白上樣量30 μg，100 V下電泳1 h后轉PVDF膜,50 g/L 脫脂奶粉封閉液封閉1 h，分別加Plin5、t-PKA和p-PKA一抗(稀釋度均為1∶1 000)，細胞周期相關蛋白Cyclin D1、P21一抗(稀釋度分別為1∶1 000、1∶250)，凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax一抗(稀釋度分別為1∶500、1∶300)，內(nèi)參β-actin或GAPDH一抗(稀釋度均為1∶1 000) 過夜，TBST洗膜后，加二抗室溫孵育1 h。利用化學發(fā)光凝膠成像儀顯影，使用Image J 分析。以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。以p-PKA與t-PKA表達水平的比值表示PKA磷酸化水平。實驗重復3次。

1.6.3 細胞中Caspase-3活性 按照1.5分組處理48 h后，收集細胞，采用試劑盒檢測Caspase-3活性，按試劑盒說明操作。實驗重復3次。

1.7統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS24.0進行分析。未感染、感染空病毒和感染Plin5慢病毒的細胞中Plin5表達水平及PKA磷酸化水平的比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗，4組細胞增殖率、多種蛋白表達水平、Caspase-3活性的比較采用析因設計的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1過表達Plin5細胞株的鑒定及其PKA磷酸化水平的變化兩種細胞未感染組、空病毒組和感染Plin5慢病毒組細胞中Plin5、t-PKA、p-PKA蛋白的表達見圖1、表1。兩種感染Plin5慢病毒組的細胞中Plin5蛋白表達均高于空病毒組和未感染組(P<0.05)，提示成功構建了過表達Plin5細胞株。感染Plin5慢病毒組細胞中PKA磷酸化水平較未感染組和空病毒組提高(P<0.05)。

圖1 HSC-Primary(A、C)和HSC-T6(B、D)細胞未感染組(1)、空病毒組(2)和感染Plin5慢病毒組(3)Plin5、PKA的表達

表1 兩種細胞不同組別Plin5蛋白表達和PKA磷酸化水平的比較

* ：與未感染組和空病毒組相比，P<0.05

2.2 4組細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達的比較見圖2、表2和3。過表達Plin5組抑凋亡蛋白Bcl-2表達較空白對照組下調(diào)，促凋亡蛋白Bax表達上調(diào)；Plin5+H89組Bcl-2表達較過表達Plin5組上調(diào)，Bax表達下調(diào)(P<0.05)。

2.3 4組細胞中Cyclin D1和P21蛋白表達的比較見圖2、表2和3。過表達Plin5組促細胞周期蛋白Cyclin D1的表達較空白對照組下調(diào)，抑細胞周期蛋白P21表達上調(diào);Plin5+H89組Cyclin D1表達較過表達Plin5組上調(diào)，P21表達下調(diào)(P<0.05)。

2.4 4組細胞增殖率的比較見表2、3。 過表達Plin5組細胞增殖率較空白對照組降低，Plin5+H89組細胞增殖率較過表達Plin5組升高(P<0.05)。

圖2 兩種細胞不同組別Cyclin D1、P21、Bcl-2和Bax蛋白的表達

2.5 4組細胞中Caspase-3活性的比較見表2、3。過表達Plin 5組Caspase-3活性較空白對照組升高，Plin5+H89組Caspase-3活性較過表達Plin5組降低(P<0.05)。

表2 4組HSC-Primary細胞增殖率、Cyclin D1、P21、Bcl-2和Bax蛋白表達水平及Caspase-3活性的比較

表3 4組HSC-T6細胞增殖率、Cyclin D1、P21、Bcl-2和Bax蛋白表達水平及Caspase-3活性的比較

3 討論

HSC被認為是肝纖維化的效應細胞。在健康肝臟中，HSC處于靜息狀態(tài)，胞內(nèi)儲存大量脂滴，因此又稱儲脂細胞。在慢性肝損傷過程中，HSC被多種細胞因子激活,向肌成纖維細胞轉化，同時伴有胞內(nèi)脂肪滴丟失和過量ECM的產(chǎn)生。目前，還不能確定是脂肪滴丟失觸發(fā)了HSC激活，還是HSC激活導致脂肪滴丟失，二者的因果關系有待進一步探討[8-12]。研究[8，13]發(fā)現(xiàn)健康肝臟分離的原代HSC在體外培養(yǎng)超過7 d可自發(fā)性活化，為保持實驗的嚴謹性，本實驗同時選用體外分離的大鼠原代HSC和傳代細胞系HSC-T6進行實驗。

在正常肝細胞中存在著線粒體cAMP-PKA軸，通過增加ROS和誘導凋亡對葡萄糖缺乏產(chǎn)生應答[14]。PKA可通過調(diào)控各種蛋白的磷酸化介導細胞凋亡，如AKT、細胞內(nèi)信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)和STAT3等，在細胞增殖、轉化過程中發(fā)揮重要作用[13,15-19]。有研究[20]報道上調(diào)cAMP-PKA軸可以抑制肝細胞癌來源細胞系的細胞周期和存活能力，而PKA激活劑cAMP能夠抑制多種肝細胞癌細胞系的細胞周期，并導致細胞死亡[21]。這與PKA多向性作用及其在不同環(huán)境下發(fā)揮不同的生物學效應相一致。激活cAMP-PKA被假定為一個明確的抗腫瘤途徑，既抑制細胞周期又誘導凋亡[22-23]?；罨腍SC具有無限傳代的特性，與癌細胞有一定的相似性。

Plin5與脂肪滴高度相關[6,13,24]。Plin5可調(diào)節(jié)肝細胞、心肌細胞、骨骼肌和胰島中的脂質(zhì)代謝、胰島素分泌和線粒體功能[25-26]。該實驗結果顯示，外源性上調(diào)Plin5表達可以提高大鼠HSC中PKA磷酸化水平，降低促細胞周期蛋白Cyclin D1和抑凋亡蛋白Bcl-2的表達，上調(diào)抑細胞周期蛋白P21和促凋亡蛋白Bax的表達，增加細胞凋亡效應蛋白酶Caspase-3的活性，使HSC周期發(fā)生阻滯，細胞增殖受抑。這種作用可被PKA抑制劑H89阻斷或逆轉。提示Plin5可通過激活PKA通路，抑制HSC增殖并誘導細胞凋亡，可潛在促使活化的HSC回到靜息狀態(tài)。但是Plin5是否也是通過cAMP-PKA軸誘導HSC凋亡有待進一步證實。綜上所述，我們的結果為Plin5誘導活化HSC凋亡提供了新的證據(jù)，Plin5有可能成為預防和治療肝纖維化的靶點之一。