劉 翼 ,祝 琳

1)西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 四川瀘州 646000 2)西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 四川瀘州 646000

上皮細胞轉(zhuǎn)化序列2(ECT2)是一種鳥嘌呤核苷酸交換因子，在細胞周期調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用，與細胞增殖關(guān)系密切。越來越多的研究[1-4]發(fā)現(xiàn)，ECT2在非小細胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌和子宮漿液性乳頭狀癌等多種腫瘤中異常高表達，在腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等生物學過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，是一個很有前景的腫瘤靶基因。盡管早期已有研究[5]發(fā)現(xiàn)，ECT2在食管癌組織中高表達，與患者的預后不良關(guān)系密切，發(fā)揮著促進食管癌細胞生長的作用，但其調(diào)控腫瘤細胞增殖的具體機制并不清楚，以ECT2為治療靶點的實驗依據(jù)還不夠充足。因此，本研究采用shRNA介導的RNAi技術(shù)沉默ECT2，觀察對食管癌細胞增殖和裸鼠成瘤能力的影響，旨在從細胞實驗和動物實驗探討ECT2調(diào)控食管癌細胞生長的分子機制。

1 材料與方法

1.1細胞與主要試劑EC109購于美國ATCC公司。BALB/c裸鼠33只(雌性，4～6周齡，體重23～25 g)購于上海斯萊克實驗動物公司。GV148-shRNA-ECT2及其無效對照shRNA-NC慢病毒由蘇州吉瑪基因股份有限公司制備，shRNA-ECT2干擾序列為5’-GGACAUUAAAGUGGGCUUUTT-3’，shRNA-NC序列為5’-AGUACUGCUUACGAUACGGTT-3’。胎牛血清、胰蛋白酶購于美國HyClone公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，CyclinD1、CDK2、ECT2和β-actin抗體購于英國Abcam公司，P21抗體購于美國Cell Signal公司，P53抗體購于美國Santa Cruz公司。辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG 二抗購于中國中杉金橋公司，Trizol總RNA抽提試劑購于美國Invitrogen公司。CCK-8試劑盒和細胞周期檢測試劑盒購于中國碧云天生物技術(shù)研究所，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于北京達科為生物公司，RT-PCR試劑盒購于日本TaKaRa公司，RIPA蛋白裂解液和BCA法蛋白定量試劑盒購于中國碧云天生物技術(shù)研究所，PVDF膜購于美國Millpore公司。

1.2細胞培養(yǎng)于體積分數(shù)50%CO2、飽和濕度和37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中以含有體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)EC109細胞。當細胞幾乎鋪滿培養(yǎng)瓶底部時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。收集生長狀態(tài)良好的EC109細胞進行后續(xù)實驗。

1.3細胞分組與慢病毒感染實驗分為對照組(未感染)、shRNA-NC組(感染shRNA-NC)和shRNA-ECT2組(感染shRNA-ECT2)。收集對數(shù)生長期的EC109細胞，胰蛋白酶消化制成濃度為2.5×106個/mL的細胞懸液。按照每孔500 μL細胞懸液平鋪于6孔細胞板，置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。棄原液后，向細胞中加入900 μL培養(yǎng)基、5 ng Polybrene和2×106TU慢病毒，感染48 h后，加入2 mg/L嘌呤霉素(篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞)繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細胞。

1.4RT-PCR檢測ECT2mRNA的表達收集各組EC109細胞，加入Trizol總RNA抽提試劑提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將cDNA作為模板，進行PCR擴增。20 μL總反應體系:2 μL cDNA、10 μL 2×SYBR Premix Ex Taq、上下游引物各0.4 μL、0.4 μL 50×ROX Reference Dye Ⅱ和6.8 μL ddH2O。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s 、62 ℃30 s，循環(huán)40次。由上海生工生物合成的ECT2引物上游：5’-GCCTTGCTTGTGAGGCCACCAA-3’，下游：5’-TCCACTGAGCCGTGGGATGTCA-3’；β-actin引物上游：5’-GGACCTGACTGACTACCTC-3’，下游：5’-TACTCCTGCTTGCTGAT-3’。以β-actin為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算ECT2 mRNA的相對表達水平。

1.5CCK-8法檢測細胞增殖收集各組EC109細胞，以每孔200 μL細胞懸液(濃度為2×104個/mL)接種于96孔細胞板，每組設(shè)4個復孔，另設(shè)一個空白調(diào)零孔(只加入等體積的培養(yǎng)基)，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)至72和96 h后，加入10 μL CCK-8溶液常溫反應2 h,采用酶標儀檢測490 nm處的光密度(OD)值。實驗重復3次。

1.6細胞周期檢測收集各組EC109細胞，磷酸鹽緩沖液洗滌后，胰蛋白酶消化制成濃度為2×104個/mL的細胞懸液，采用預冷的體積分數(shù)70%乙醇對細胞進行固定。以碘化丙啶染色后，上流式細胞儀進行檢測。實驗重復3次。

1.7裸鼠移植瘤實驗收集各組細胞，制成濃度為1×106個/mL的細胞懸液。將33只雌性裸鼠隨機分為3組，每組11只，分別將對照組、shRNA-NC組和shRNA-ECT2組細胞以每只0.5 mL注入裸鼠右后肢皮下。接種完畢后，將裸鼠放入SPF級動物房中飼養(yǎng)，觀察成瘤情況。接種30 d后處死裸鼠，剝落移植瘤稱重，并以精確到0.02 mm的游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，腫瘤體積=長徑×短徑2/2。取部分移植瘤組織，用于P21和P53蛋白的Western blot檢測。

1.8目的蛋白的Western blot檢測收集待測的EC109細胞和移植瘤組織，加入RIPA細胞裂解液于冰上裂解30 min提取總蛋白。按照BCA蛋白檢測試劑盒說明書步驟測定總蛋白的濃度。將蛋白樣品80 μg加入到120 g/L SDS-PAGE凝膠泳道孔中。電泳分離結(jié)束后，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。將膜放入含50 g/L脫脂奶粉的封閉液中封閉1 h。加入以封閉液1∶1 000稀釋的一抗(CDK2、CylinD1、ECT2、P21和P53)4 ℃孵育過夜。用1×TBST溶液洗膜10 min，3次后，加入封閉液1∶2 000稀釋的二抗，常溫孵育2 h。洗膜后加入化學發(fā)光劑。避光反應5 min，凝膠成像儀掃描拍照，Quantity One軟件分析條帶灰度值，以目的條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。實驗重復3次。

1.9統(tǒng)計學處理采用SPSS 22.0分析，各組EC109細胞ECT2、CyclinD1、CDK2的表達和增殖活力，移植瘤體積、瘤體質(zhì)量以及組織中P21和P53蛋白表達的比較使用單因素方差分析和SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組EC109細胞中ECT2的表達與對照組相比，shRNA-ECT2組細胞中ECT2蛋白和mRNA的表達水平明顯降低，結(jié)果見圖1和表1。

1：對照組；2：shRNA-NC組；3：shRNA-ECT2組

表1 3組EC109細胞中ECT2蛋白和mRNA的表達(n=3)

*：與對照組和shRNA-NC組比較，P<0.05

2.2 3組EC109細胞增殖活力和細胞周期與對照組和shRNA-NC組比較，shRNA-ECT2組細胞的增殖活力明顯降低，G0/G1期細胞百分比明顯升高，而S期細胞百分比降低，結(jié)果見表2。

表2 3組EC109細胞增殖活力和細胞周期的比較(n=3)

*：與對照組和shRNA-NC組比較，P<0.05

2.3 3組EC109細胞中CyclinD1和CDK2蛋白的表達shRNA-ECT2組細胞中CyclinD1和CDK2蛋白的表達水平較對照組和shRNA-NC組明顯降低，結(jié)果見圖2和表3。

1：對照組；2：shRNA-NC組；3：shRNA-ECT2組

表3 3組EC109細胞中CyclinD1和CDK2蛋白的表達(n=3)

*：與對照組和shRNA-NC組比較，P<0.05

2.4 3組細胞體內(nèi)成瘤能力的比較接種3～7 d對照組和shRNA-NC組裸鼠均有肉眼可見的瘤體生成，在接種部位出現(xiàn)了逐漸變大的皮下小結(jié)節(jié)；而shRNA-ECT2組中僅有4只裸鼠瘤體生成，成瘤時間較對照組明顯推遲了12 d。shRNA-ECT2組中瘤體體積和瘤體質(zhì)量均明顯減小，結(jié)果見表4。

2.5 3組裸鼠移植瘤組織中P21和P53蛋白的表達與對照組和shRNA-NC組相比，shRNA-ECT2組移植瘤組織中P21和P53蛋白的表達水平均明顯升高，見圖3和表5。

表4 3組細胞體內(nèi)成瘤能力的比較

*：與對照組和shRNA-NC組比較，P<0.05

1：對照組 ；2：shRNA-NC組；3：shRNA-ECT2組

表5 3組裸鼠移植瘤組織中P21和P53蛋白的表達水平

*：與對照組和shRNA-NC組比較，P<0.05

3 討論

近年來食管癌的發(fā)病率有明顯升高的趨勢，嚴重威脅著人們的身體健康[6-7]。食管癌細胞的惡性增殖是食管癌發(fā)生的重要基礎(chǔ)，而此過程受到多種癌基因和抑癌基因的共同調(diào)控。深入探討食管癌細胞增殖的調(diào)控機制，尋找能夠抑制癌細胞增殖的有效靶點是治療食管癌的重要策略。ECT2被認為是一種重要的癌基因，能夠促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。ECT2在非小細胞肺癌組織中高表達，被認為是導致總體生存不良和復發(fā)的重要因素[8]。ECT2表達上調(diào)與肝癌早期復發(fā)和預后不良關(guān)系密切，敲除該基因可通過抑制Rho/ERK信號通路降低CyclinE/CDK2/Rb的活化，激活P53途徑，抑制腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，還能夠在體內(nèi)減緩腫瘤的生長[9]。ECT2是miRNA-223的靶基因，下調(diào)其表達可誘導P21表達，改變CyclinD1-CDK復合物的活性，導致細胞周期G1期發(fā)生阻滯，影響骨肉瘤細胞周期進展和增殖[10]。此外，ECT2還在肺腺癌、結(jié)直腸癌和胃癌等腫瘤中異常高表達，被作為腫瘤診斷和預后評估的重要標志物[11-13]。

本研究通過慢病毒GV148-shRNA-ECT2感染，成功沉默食管癌EC109細胞中ECT2表達后發(fā)現(xiàn)，EC109細胞的增殖活力明顯減弱，這與Hirata等[5]早期發(fā)現(xiàn)下調(diào)ECT2表達可抑制食管癌TE9細胞增殖的結(jié)果相吻合。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)沉默ECT2表達可使細胞周期阻滯于G0/G1期；進一步檢測發(fā)現(xiàn)，在ECT2沉默的EC109細胞中CyclinD1和CDK2蛋白表達受到抑制。另外，通過建立食管癌裸鼠移植瘤模型發(fā)現(xiàn)沉默ECT2表達能夠明顯抑制移植瘤的生長，上調(diào)移植瘤組織中P21和P53蛋白的表達。已有研究[14-15]證實，P21和P53在食管癌細胞增殖過程中發(fā)揮著重要作用。P21和P53均是細胞周期依賴性激酶抑制劑，可通過調(diào)控G1/S轉(zhuǎn)換的周期蛋白CyclinD1和CDK2的表達，使細胞周期阻滯于G1/G0期，進而抑制細胞增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用[16-18]。本研究結(jié)果提示，沉默ECT2表達可通過促進P21、P53表達，進而下調(diào)CyclinD1、CDK2表達，影響細胞周期進展，抑制EC109細胞的增殖。

綜上所述，沉默ECT2可抑制食管癌EC109細胞增殖和裸鼠成瘤能力，其作用機制可能與促進P21和P53的表達有關(guān)。該結(jié)果進一步豐富了ECT2調(diào)控食管癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，也為以ECT2為靶點的食管癌治療提供了新的實驗依據(jù)。