李超，許宇星，吳志華，方良，張沛健

不同施肥措施對桉樹人工林土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的短期影響

李超，許宇星，吳志華＊，方良，張沛健

(國家林業(yè)和草原局桉樹研究開發(fā)中心，廣東 湛江 524022)

為探索桉樹人工林土壤細(xì)菌群落對不同施肥措施的響應(yīng)特征，本研究利用Illumina高通量測序技術(shù)，分析不同施肥處理下桉樹人工林土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)、多樣性及與土壤環(huán)境因子之間的關(guān)系。結(jié)果表明：(1)高施肥量處理雖然對土壤全氮、磷、鉀含量未產(chǎn)生顯著影響，但顯著增加了土壤速效氮、有效磷、速效鉀含量；隨著施肥量的增加，pH呈現(xiàn)升高趨勢但差異不顯著。(2)桉樹人工林土壤細(xì)菌門水平優(yōu)勢群落主要為綠彎菌門Chloroflexi、變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria和酸桿菌門Acidobacteria，不同施肥處理間土壤細(xì)菌群落多樣性及豐富度均產(chǎn)生顯著差異，施肥處理顯著增加了土壤細(xì)菌豐富度而降低了其細(xì)菌多樣性指數(shù)。(3)施肥處理顯著改變桉樹人工林土壤優(yōu)勢細(xì)菌門類的相對豐度，如綠彎菌門Chloroflexi以及放線菌門Actinobacteria的群落相對豐度。(4)冗余分析表明，全氮TN、全磷TP、pH與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性較強(qiáng)，是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子。放線菌門Actinobacteria對環(huán)境因子變化的響應(yīng)極其敏感，與有效磷AP、有機(jī)質(zhì)OM、全磷TP、全氮TN、全鉀TK、pH、有效鉀AK、有效氮AN均呈顯著的負(fù)相關(guān)。

桉樹人工林；土壤細(xì)菌；施肥；微生物群落結(jié)構(gòu)

桉樹()作為世界三大速生樹種之一，在我國南方廣泛種植。截至2018年，我國桉樹人工林面積達(dá)546.74萬公頃[1]。桉樹實(shí)現(xiàn)了僅用全國2%的林地生產(chǎn)了全國25%的木材的目標(biāo)，對林業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益[2]。近年隨著桉樹人工林的快速增長，長期高強(qiáng)度多代的經(jīng)營模式導(dǎo)致桉樹人工林出現(xiàn)土壤地力衰退、養(yǎng)分過度消耗、林下物種多樣性減少等生態(tài)與環(huán)境問題[3-4]，廣受社會關(guān)注。如何對桉樹人工林土壤質(zhì)量進(jìn)行改善是實(shí)現(xiàn)桉樹人工林生態(tài)系統(tǒng)向良性循環(huán)方向發(fā)展、保障林業(yè)可持續(xù)經(jīng)營的關(guān)鍵[5]。

施肥能夠改變土壤的理化性質(zhì)，改善土壤養(yǎng)分有效性，顯著影響土壤中碳、氮、磷庫以及土壤微生物量，從而影響土壤微生物結(jié)構(gòu)及功能類群，對提高植物生產(chǎn)力具有重要的作用，對生態(tài)系統(tǒng)的生物地球化學(xué)過程產(chǎn)生影響[6-8]。土壤微生物作為土壤肥力和健康程度的重要指標(biāo)，比土壤理化性質(zhì)更能準(zhǔn)確地反映土壤質(zhì)量，能更有效地響應(yīng)土壤質(zhì)量變化[9-10]。合理施肥可顯著影響土壤的微生物群落，從而直接或間接地影響土壤微生物生物量及人工林產(chǎn)量[11]。

施肥作為目前提高桉樹人工林生產(chǎn)力最直接有效的方法[6]，也是森林經(jīng)營中抑制地力衰退的一種有效措施。關(guān)于桉樹施肥效果的研究已有相關(guān)報(bào)道[12-15]，而關(guān)于土壤細(xì)菌群落特征是如何響應(yīng)施肥措施的研究較少。因此，本研究以新建2 a生桉樹人工林土壤為研究對象，通過高通量測序技術(shù)，探索桉樹土壤細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)及多樣性對不同施肥措施的響應(yīng)特征，以及導(dǎo)致土壤細(xì)菌群落差異的影響因子，將有助于對桉樹人工林土壤質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)和改善，對桉樹人工林的科學(xué)施肥及可持續(xù)健康發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于廣東省湛江市南方國家級林木種苗示范基地(21°30′ N，111°38′ E)，屬北熱帶濕潤大區(qū)瓊雷區(qū)北緣，為海洋性季風(fēng)氣候，年平均氣溫23.1℃，極端最低溫為1.4℃，極端最高氣溫為38.1℃，年降雨量1 567 mm，年相對濕度80.4%[16]。試驗(yàn)林前茬為8 a生大花紫薇()林，砍伐后于2018年4月選取長勢均一的尾巨桉()幼苗(20 cm ± 2 cm)造林，初植密度均為2 m × 3 m，每公頃約1 650株。造林后，每年上半年在距離根樁50 cm處完成1次追肥(芬蘭復(fù)合肥N:P2O5:K2O = 15:15:15)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與土壤樣品采集

本次施肥試驗(yàn)共設(shè)置100、300、500 g·株-13個(gè)處理并以鄰近未砍伐大花紫薇林土壤為對照處理（施肥量為0 g·株-1），分別編號為F100、F300、F500、CK。2019年12月，在每個(gè)處理中設(shè)置3個(gè)20 m × 20 m 樣地，每個(gè)樣地間大于50 m，采用多角線多點(diǎn)隨機(jī)采集0 ~ 20 cm表層土壤，在每個(gè)樣地內(nèi)隨機(jī)選取9個(gè)點(diǎn)混合成1個(gè)土樣，每個(gè)處理共計(jì)得到3個(gè)土壤樣品。每個(gè)樣品中，取約10 g新鮮土壤放入滅菌的離心管并立即放入液氮中用于細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析，樣品盡快保存到實(shí)驗(yàn)室-80℃的冰箱中。剩余樣品自然風(fēng)干后過2 mm的篩用于化學(xué)性質(zhì)測定。

1.3 分析方法

土壤pH值采用pH計(jì)進(jìn)行測定(1:2.5土水比)，土壤有機(jī)質(zhì)采用水合熱重鉻酸鉀-硫酸-比色法，全氮TN和速效氮AN分別采用開氏定氮法和堿解擴(kuò)散法，全磷TP和有效磷AP分別采用堿熔-鉬銻抗比色法和硫酸-鹽酸雙酸法，全鉀TK和速效鉀AK均采用火焰光度法[17]。

土壤微生物采用CTAB方法進(jìn)行DNA提取，并利用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA純度及濃度，取適量樣品利用無菌水在試管中稀釋至1 ng·μl-1作為模板，細(xì)菌擴(kuò)增區(qū)域?yàn)?6SV3-V4，所選取引物為341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)-805R(GACTACHVGGGTATC- TAATCC)。使用Bio-rad T100梯度PCR儀(T100TM Thermal Cyeler)進(jìn)行PCR，其產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等濃度混樣，充分混勻后使用1×TAE濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR產(chǎn)物，割膠回收目標(biāo)條帶。產(chǎn)物純化試劑盒使用的是Thermo Scientific公司GeneJET 膠回收試劑盒。使用New England Biolabs公司的NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina建庫試劑盒進(jìn)行文庫的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit 定量和文庫檢測，每個(gè)樣品DNA量取10 ng，進(jìn)行上機(jī)測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Usearch 軟件(Usearch 8.1.1831)將所有樣本序列按照序列間的距離進(jìn)行聚類，后根據(jù)序列之間的相似性將序列分成不同的操作分類單元 (OTU)。通常在97%相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。在OTU聚類結(jié)果的基礎(chǔ)上，獲取OTU聚類中的代表性序列，選擇豐度最高的序列作為OTU的代表性序列，進(jìn)行各類的OTU分析。調(diào)用Mothur軟件，計(jì)算各個(gè)樣品的Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)值。

采用SPSS 17.0對試驗(yàn)期土壤化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行單因素方差分析，并完成LSD檢驗(yàn)。利用R software package v.3.2.3對不同菌群結(jié)構(gòu)間的差異進(jìn)行PCoA分析。同時(shí)利用 SPSS軟件的皮爾森相關(guān)分析(Pearson correlation analysis)和典型相關(guān)分析(Canonical Correlation)，結(jié)合Canoco for windows 軟件(version 4.5)進(jìn)行冗余分析，把握環(huán)境因子同細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及α-多樣性的相關(guān)關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥量桉樹人工林土壤化學(xué)性質(zhì)分析

不同施肥量桉樹人工林土壤化學(xué)性質(zhì)存在顯著差異(表1)。由表1可知，隨著施肥量的增加，pH逐漸升高，但未產(chǎn)生顯著差異。與CK相比，F(xiàn)100處理使土壤有機(jī)質(zhì)含量下降，但隨著施肥量的增加，有機(jī)質(zhì)含量逐漸回升，當(dāng)施肥量達(dá)到500 g·株-1時(shí)，土壤有機(jī)質(zhì)含量恢復(fù)到CK土壤水平。不同施肥處理間土壤全氮、全磷、全鉀含量未產(chǎn)生顯著差異，但高施肥量處理顯著增加了土壤速效氮、有效磷、速效鉀含量。

表1 不同施肥措施下桉樹人工林土壤化學(xué)性質(zhì)

注：1.F100、F300和F500分別表示施肥量為100、300和500 g·株-1

2.同行數(shù)據(jù)后不同小字字母表示P<0.05

2.2 不同施肥措施桉樹人工林土壤細(xì)菌群落α-多樣性分析

本次采用對測序進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，對抽樣序列與所代表OTU數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線(圖1)。圖1顯示4個(gè)處理12個(gè)土壤樣品的稀釋曲線趨于平緩，表明測序數(shù)據(jù)漸進(jìn)合理，更多的測序數(shù)據(jù)對新的OTU貢獻(xiàn)率非常小。

OTU水平的細(xì)菌群落α-多樣性結(jié)果表明(圖2)，不同施肥處理間桉樹人工林土壤細(xì)菌群落多樣性及豐富度均產(chǎn)生顯著差異，施肥處理顯著增加了土壤細(xì)菌豐富度而降低了土壤多樣性指數(shù)。其中，F(xiàn)300處理的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)均高于或顯著高于其他處理和CK，具體順序表現(xiàn)為F300>F500>F100>CK ，而F300和F500處理的多樣性指數(shù)(Shannon和Simpson指數(shù))顯著低于F100和CK處理，按大小表現(xiàn)為Shannon指數(shù)： CK > F100> F300> F500，Simpson指數(shù)：CK

圖1 不同施肥措施下桉樹人工林土壤細(xì)菌稀釋曲線

圖2 不同施肥措施下桉樹人工林土壤細(xì)菌微生物多樣性

2.3 不同施肥措施土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征

基于12個(gè)土壤樣品OTU水平構(gòu)建主坐標(biāo)分析顯示(圖3)，施肥處理的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與CK顯著分開，第一主成分解釋了群落結(jié)構(gòu)差異的42.77%，第二主成分解釋了群落結(jié)構(gòu)差異的34.81%，共同解釋了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異的77.58%。此外，不同施肥處理間桉樹人工林土壤細(xì)菌群落組成存在明顯差異，這表明施肥對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在較大影響。其中，CK、F100和F300處理的細(xì)菌群落相對獨(dú)立，但F500處理的土壤樣本點(diǎn)分布與F300處理樣本點(diǎn)相對集中，說明施肥量從F300增加到F500，并未引起土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的顯著變化。

2.4 不同施肥措施桉樹人工林土壤主要細(xì)菌門水平差異

施肥對桉樹土壤細(xì)菌群落組成及其相對豐度在門水平的影響如圖4所示。由圖4可知，桉樹土壤的優(yōu)勢細(xì)菌為綠彎菌門Chloroflexi (28.97% ~ 40.22%)、變形菌門Proteobacteria(18.07% ~ 23.32%)、放線菌門Actinobacteria(14.18% ~ 21.67%)和酸桿菌門Acidobacteria(13.48% ~ 18.17%)。

圖3 不同施肥措施下桉樹人工林土壤細(xì)菌PCoA分析

圖4 不同施肥措施下桉樹人工林土壤細(xì)菌門水平群落組成餅圖

由圖5可知，綠彎菌門Chloroflexi的群落豐度在CK處理中顯著低于其他3個(gè)施肥處理，其他優(yōu)勢細(xì)菌如放線菌門Actinobacteria、疣微菌門Verrucomicrobia、GAL15、芽單胞菌門Gemmatimonadetes等在4個(gè)處理間也產(chǎn)生了顯著差異。

圖5 不同施肥措施下桉樹人工林土壤細(xì)菌門水平差異

2.5 不同施肥措施土壤化學(xué)性質(zhì)與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征的關(guān)系

土壤各化學(xué)性質(zhì)同各處理門水平細(xì)菌豐度的冗余分析表明(圖6)，全氮TN、全磷TP、pH與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性較強(qiáng)，是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子。其中放線菌門Actinobacteria與AP、OM、TP、TN、TK、pH、AK、AN均呈顯著的負(fù)相關(guān)，綠彎菌門Chloroflexi含量與pH、TK呈顯著正相關(guān)，酸桿菌門Acidobacteria含量與OM、TN、TP、AN呈顯著正相關(guān)，疣微菌門Verrucomicrobia含量與pH、AP呈顯著正相關(guān)，芽單胞菌門Gemmatimonadetes含量與pH、OM、AP、AK呈顯著負(fù)相關(guān)，GAL15含量與pH、TK、AP、 AK呈顯著正相關(guān)，變形菌門Proteobacteria與各環(huán)境因子相關(guān)性不顯著(圖7)。

圖6 不同施肥措施下桉樹人工林土壤細(xì)菌門水平冗余分析

圖7 不同施肥措施下桉樹人工林土壤細(xì)菌與環(huán)境因子相關(guān)性熱圖

3 結(jié)論與討論

(1) 隨著施肥量的增加，pH雖呈現(xiàn)升高趨勢，但未達(dá)到顯著差異。高施肥量處理顯著增加了土壤速效氮、有效磷、速效鉀含量。說明施肥有效提高了土壤可溶性養(yǎng)分含量/肥力，改善土壤酸堿度，這與前人研究結(jié)果一致[18]。

(2) 本研究顯示兩年生桉樹人工林土壤的優(yōu)勢細(xì)菌為綠彎菌門Chloroflexi(28.97% ~ 40.22%)、變形菌門Proteobacteria(18.07% ~ 23.32%)、放線菌門Actinobacteria(14.18% ~ 21.67%)和酸桿菌門Acidobacteria(13.48% ~ 18.17%)。此外，不同施肥處理間土壤細(xì)菌群落多樣性及豐富度均產(chǎn)生顯著差異，施肥處理顯著增加了土壤細(xì)菌豐富度而降低了其多樣性指數(shù)。

(3) 施肥顯著改變桉樹人工林門水平土壤細(xì)菌的相對豐度。其中，綠彎菌門Chloroflexi的群落豐度在CK處理中顯著低于其他3個(gè)施肥處理，表明施肥能顯著增加綠彎菌Chloroflexi的群落豐度。

(4) 冗余分析表明，pH、AN、AP與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性較強(qiáng)，是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子。不同的微生物類群對各環(huán)境因子的響應(yīng)特征各異，其中放線菌門Actinobacteria與AP、OM、TP、TN、TK、pH、AK、AN均呈顯著的負(fù)相關(guān)，表明放線菌門Actinobacteria對土壤環(huán)境因子變化的響應(yīng)極其敏感。放線菌是產(chǎn)生抗生素和酶的重要微生物資源之一，對植物病害的防治具有一定作用[19]。如何讓微生物與植物在生態(tài)系統(tǒng)中更好的互利共生，達(dá)到更加長期穩(wěn)定的生態(tài)平衡，還有待進(jìn)一步研究。

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Short-term Effects of DifferentPlantationFertilization Treatments on Soil Bacterial Community Structure and Diversity

LI Chao, XU Yuxing, WU Zhihua, FANG Liang, ZHANG Peijiang

()

In order to investigate the responses of soil bacterial communities to different fertilization measures inplantations, Illumina high-throughput sequencing was performed in this study. The soil bacterial community structure, diversity and their relationships with various impact factors were analyzed under different fertilization measures. The results showed the following: (1)The contents of available nitrogen, available phosphorus and available potassium in the soil were significantly increased by high rates of fertilizer application; with increasing fertilizer application, pH tended to increase but differences were not significant. (2)The dominant bacteria, at the phylum level, in soils ofplantations were Chloroflexi, Proteobacteria, Actinobacteria and Acidobacteria. The diversity and richness of soil bacterial communities differed significantly among different fertilization treatments, with higher rates of fertilizer being associated with significant increases in soil bacterial richness but decreases in soil bacterial diversity. (3)The relative abundance of dominant bacterial groups, such as Chloroflexi and Actinobacteria communities, inplantation soils differed significantly among different fertilization treatments. (4)Redundancy analysis showed that total nitrogen, total phosphorus and pH had a strong correlation with bacterial community structure, and these were the main environmental factors associated with bacterial community structure. Actinobacteria were found to be extremely sensitive to changes in environmental factors, and their abundance was negatively correlated with available phosphorus, organic matter, total phosphorus, total nitrogen, total potassium, pH, available potassium, and available nitrogen.

plantations; soil bacterial community; fertilization measures;microbial community structure

10.13987/j.cnki.askj.2020.01.002

S154.3

A

中國林業(yè)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資助人才項(xiàng)目(CAFYBB2018QA010)；“十三五”國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題(2017YFD0601202)

李超(1987－ )，女，碩士，工程師，主要從事森林保護(hù)研究，E-mail:d.lichao@163.com

吳志華(1974－ )，男，碩士，副研究員，主要從事林木逆境生理研究，E-mail:wzhua2889@163.com