曹旭東，韓瑞枝，方紅輝，倪曄

1 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122

2 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

(R)-1-(1-萘基)乙胺是一種重要的手性芳香族胺化合物，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、材料等領(lǐng)域[1]。(R)-1-(1-萘基)乙胺是重要的藥物手性中間體，也是其他手性對(duì)映體的常用拆分劑和手性助劑，在手性醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域具有重要用途[2]。例如，(R)-1-(1-萘基)乙胺既可用于制備擬鈣劑鹽酸西那卡塞[3]，又可用于拆分外消旋鄰苯二甲酸單薄荷酯以制備L-薄荷醇[4]。

迄今為止，用于催化合成手性胺的酶主要包括水解酶[5]、氨裂解酶[6]、單胺氧化酶[7]、胺脫氫酶[8]、還原胺化酶[9]、亞胺還原酶[10]、轉(zhuǎn)氨酶[11]等。ω-轉(zhuǎn)氨酶是一種5′-磷酸吡哆醛 (PLP) 依賴性酶，可將氨基從供體分子轉(zhuǎn)移到前手性酮上，生成相應(yīng)的手性胺[12]。目前，ω-轉(zhuǎn)氨酶已廣泛用于合成許多藥物分子，如抗糖尿病藥物西他列汀。Merck和Codexis公司通過蛋白質(zhì)工程策略改造(R) 選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶 (ATA-117)，通過多輪定點(diǎn)飽和突變、組合突變及隨機(jī)突變技術(shù)，開發(fā)出了一種適用于工業(yè)化應(yīng)用的新酶Rd11TA，其催化活性較野生型酶提高28 000倍以上，該酶可將前手性的西他列汀酮轉(zhuǎn)化為西他列汀手性胺分子[13]。與以前的化學(xué)催化工藝相比，該生物催化工藝不僅減少了排廢并消除了對(duì)重金屬的需求，還使總產(chǎn)量提高了10%，生產(chǎn)率提高了53%[14]。

手性(R)-1-(1-萘基)乙胺的制備方法有很多，可分為兩類。第一類是化學(xué)拆分法，即采用(D)-酒石酸作為拆分劑分離外消旋1-(1-萘基)乙胺[15]。但此過程時(shí)間較長，產(chǎn)物的光學(xué)純度低并且產(chǎn)生大量廢物。第二類是生物催化法，其中包括動(dòng)力學(xué)拆分外消旋胺和不對(duì)稱合成手性胺。Matthew等[16]將S型ω-轉(zhuǎn)氨酶ATA113與氨基酸氧化酶組合，動(dòng)力學(xué)拆分手性1-(1-萘基)乙胺，獲得單一構(gòu)型的(R)-1-(1-萘基)乙胺，但動(dòng)力學(xué)拆分存在的問題是得率最高為50%。而不對(duì)稱合成法是直接合成手性產(chǎn)物的方法，這是合成手性藥物最經(jīng)濟(jì)有效的方法。Marx等[17]以1-萘乙酮為底物，采用Codexis公司市售的轉(zhuǎn)氨酶試劑盒催化制備(R)-1-(1-萘基)乙胺，底物濃度20 mmol/L時(shí)轉(zhuǎn)化率為98%，對(duì)映體過量 (ee)值大于99%，證明了轉(zhuǎn)氨酶催化不對(duì)稱合成(R)-1-(1-萘基)乙胺的方法有著一定的應(yīng)用前景。但隨著底物1-萘乙酮濃度的升高，轉(zhuǎn)化率也顯著降低，這嚴(yán)重限制了其工業(yè)化生產(chǎn)。

近年來對(duì)ω-轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造的策略主要有隨機(jī)突變、半理性設(shè)計(jì)和理性設(shè)計(jì)的策略[18-21]。Yun等[22]使用易錯(cuò)PCR技術(shù)構(gòu)建突變文庫，篩選出對(duì)2-氨基庚烷、2-氨基-6-甲基庚烷及2-氨基辛烷活力提高1.7–2.0倍的突變酶。Han等[23]對(duì)酶活性中心附近的氨基酸殘基進(jìn)行丙氨酸掃描并定點(diǎn)飽和突變，獲得了催化活性較野生型酶明顯提高的突變酶W58L。Daniel等[24]通過結(jié)構(gòu)分析、分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬、量子力學(xué)計(jì)算、計(jì)算機(jī)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性研究協(xié)同進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)分析和體外篩選的理性設(shè)計(jì)策略，得到的突變酶不對(duì)稱合成(1S)-1-(1,1′-聯(lián)苯-2-基)乙胺的反應(yīng)速率提高1 716倍以上，并且ee值大于99%。

本研究對(duì)節(jié)桿菌屬 (Arthrobactersp.) 來源的ω-轉(zhuǎn)氨酶ARTA[25](WT) 進(jìn)行隨機(jī)突變和半理性設(shè)計(jì)相結(jié)合的突變策略，旨在獲得催化效率和熱穩(wěn)定性提高的突變酶，以期能夠催化1-萘乙酮合成(R)-1-(1-萘基)乙胺，并為生物催化法制備(R)-1-(1-萘基)乙胺的工業(yè)化應(yīng)用提供潛在生物催化劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株與質(zhì)粒：表達(dá)質(zhì)粒pET28a、表達(dá)宿主大腸桿菌Escherichia coliBL21(DE3)、重組質(zhì)粒pET28a/ BmGDH和pET28a/LpLDH為實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建保存。pET28a/ARTA由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

LB培養(yǎng)基 (g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，氯化鈉10。

酶、試劑、引物和DNA序列測定：限制性核酸內(nèi)切酶和膠回收試劑盒購自TaKaRa公司。Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自生工生物工程(上海) 股份有限公司。引物合成和DNA測序由天霖生物科技有限公司完成。

1.2 易錯(cuò)PCR構(gòu)建隨機(jī)突變文庫

以pET28a/ARTA為模板，使用引物P1和P2(表1) 進(jìn)行目的片段擴(kuò)增。在PCR混合體系中加入100 μmol/L MnCl2用于控制突變概率[26]，使得每個(gè)基因有1–3個(gè)突變位點(diǎn)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化后，并與NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切得到的線性化pET28a載體連接，然后通過一步克隆法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中。

1.3 高通量篩選方法

挑選單菌落接種至96深孔板中，每孔含300 μL LB培養(yǎng)基和50 μg/mL卡那霉素。37 ℃、120 r/min孵育12 h，取其中50 μL培養(yǎng)物接種至新的96深孔板中，每孔含有600 μL LB培養(yǎng)基和50 μg/mL卡那霉素。37 ℃、120 r/min培養(yǎng)2 h后，加入終濃度為0.2 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)，25 ℃、120 r/min再培養(yǎng)8 h后，4 ℃、4 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞。

向收集細(xì)胞的96深孔板中加入200 μL溶菌酶溶液 (10 mmol/L磷酸鈉 (PBS) 緩沖液，pH 8.0，含有750 mg/L溶菌酶和10 mg/L DNase)，37 ℃、120 r/min振蕩1 h，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，上清即為酶液。

500 μL反應(yīng)體系包括：100 μL酶液，2 mmol/L 1-萘乙酮，20 mmol/L丙氨酸，0.15 mmol/L PLP，4 U/mL LpLDH酶液，0.2 mmol/L NADH，2 U/mL BmGDH酶液，2 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L PBS緩沖液 (pH 8.0)，5%乙醇助溶。

30 ℃、120 r/min反應(yīng)12 h后，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，取上清100 μL到酶標(biāo)板中，并加入100 μL的1 mmol/L酚紅后測定OD560，并計(jì)算出ΔOD560(ΔOD560=OD560(WT)?OD560(Mutant))，由于ΔOD560的數(shù)值間接表示為突變酶相比于WT活力的大小[27]，因此△OD560越高即說明該突變酶酶活力越高。

1.4 半理性設(shè)計(jì)突變酶的構(gòu)建

ω-轉(zhuǎn)氨酶的催化過程與底物和輔酶PLP都存在一定的相互作用[28]，利用Discovery Studio軟件(BIOVIA，美國) 的虛擬氨基酸突變模塊，以PDB:3wwi (ω-轉(zhuǎn)氨酶ARTA同源性大于99%) 為模板進(jìn)行虛擬氨基酸突變得到ARTA-WT，并通過分子對(duì)接模塊對(duì)接底物1-萘乙酮，選擇底物1-萘乙酮周圍6 ?范圍及PLP周圍4 ?范圍內(nèi)共同的氨基酸殘基Tyr67、Trp192、Gly224、Phe225，并對(duì)這4個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行丙氨酸掃描及定點(diǎn)飽和突變，設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變引物如表1所示。

表1 易錯(cuò)PCR及定點(diǎn)突變引物Table 1 Primers for error-prone PCR and site-directed mutagenesis

以重組質(zhì)粒pET28a/ARTA為模板，采用全質(zhì)粒PCR方法進(jìn)行定點(diǎn)突變，經(jīng)DpnⅠ消化PCR模板后，將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，挑選正確的突變體用于表達(dá)。

1.5 WT與突變酶的表達(dá)與純化

將重組大腸桿菌BL21/pET28a/ARTA接種到40 mL LB培養(yǎng)基中 (含50 μg/mL卡那霉素)，并于37 ℃、180 r/min培養(yǎng)到至OD600為0.6–0.8，加入終濃度為0.2 mmol/L IPTG，25 ℃、180 r/min繼續(xù)培養(yǎng)10 h。將培養(yǎng)液于4 ℃、4 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞。

將收集的細(xì)胞溶解在結(jié)合緩沖液 (0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，20 mmol/L PBS緩沖液、5%甘油，pH 7.4) 中，并通過超聲處理破碎，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，通過0.45 μm過濾器過濾上清液，并用10倍柱體積平衡Ni-NTA親和層析柱，取10 mL破碎的上清液上樣，用10倍柱體積的結(jié)合緩沖液洗滌非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，用15倍柱體積的洗脫緩沖液 (0.5 mol/L NaCl，100 mmol/L咪唑、100 mmol/L PBS緩沖液，5%甘油，pH 7.4) 洗脫蛋白質(zhì)。收集樣品通過超濾管除去殘留的咪唑，并用PBS緩沖液 (100 mmol/L，pH 7.0) 置換。通過SDS-PAGE分析鑒定蛋白質(zhì)樣品，使用Bradford方法測定蛋白濃度。

1.6 比活力的測定

酶活力單位 (mU) 定義為：30 ℃、pH 7.0條件下，以1-萘乙酮為底物，每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol的(R)-1-(1-萘基)乙胺所需的酶量。所有酶活性測定結(jié)果均為3次重復(fù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值。

500 μL反應(yīng)體系中包括：0.2 mg/mL ARTA酶液，2 mmol/L 1-萘乙酮，20 mmol/L丙氨酸，0.15 mmol/L PLP，4 U/mL LpLDH酶液，0.2 mmol/L NADH，2 U/mL BmGDH酶液，2 mmol/L葡萄糖，100 mmol/L PBS緩沖液 (pH 7.0)，5%乙醇助溶。

30 ℃、120 r/min反應(yīng)30 min后，煮沸5 min終止反應(yīng)，通過HPLC測定底物1-萘乙酮和產(chǎn)物(R)-1-(1-萘基)乙胺的濃度。對(duì)于初始速率測量，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率限制在小于20%，并根據(jù)酶活力的定義及蛋白濃度計(jì)算出比活力。

HPLC檢測方法為：用0.22 μm過濾膜將反應(yīng)液過濾后進(jìn)行HPLC測定，色譜柱為Diamonsil C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)，流動(dòng)相為：乙腈︰水︰乙醇胺=70︰30︰0.05，流速為1 mL/min，UV檢測波長為210 nm。

1.7 酶學(xué)性質(zhì)的測定

1.7.1 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測定

將1-萘乙酮濃度梯度設(shè)定在0–40 mmol/L的底物濃度范圍內(nèi)，同時(shí)固定丙氨酸濃度為20 mmol/L，其他條件根據(jù)1.6中描述的方法測量純化后的WT及突變酶的比活力，通過Origin以底物1-萘乙酮濃度為橫坐標(biāo)、比活力為縱坐標(biāo)作圖計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)的kcat、Km和kcat/Km值。

1.7.2 溫度對(duì)反應(yīng)的影響

測定純化后的WT及突變酶在20–50 ℃(20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、50 ℃) 下的比活力，分析WT及其突變酶的最適反應(yīng)溫度。

1.7.3 pH對(duì)反應(yīng)的影響

測定純化后的WT及突變酶在不同pH值 (pH 5.0–9.0) 下的緩沖液中的比活力，分析WT及其突變酶的最適反應(yīng)pH。其中緩沖液分別為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液 (pH 5.0、5.5、6.0)、PBS緩沖液(pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液 (pH 8.0、8.5、9.0)。

1.7.4 熱穩(wěn)定性測定

將純化后的WT及突變酶分別在30 ℃、40 ℃溫度下保溫不同時(shí)間后，測定其殘余的比活力，分析WT及其突變酶的熱穩(wěn)定性。

1.8 酶催化10 mmol/L 1-萘乙酮反應(yīng)

1 mL反應(yīng)體系中包括：100 mU/mL WT或突變酶液，10 mmol/L 1-萘乙酮，100 mmol/L 丙氨酸，0.5 mmol/L PLP，10 U/mL LpLDH酶液，1 mmol/L NADH，5 U/mL BmGDH酶液，10 mmol/L 葡萄糖，100 mmol/L PBS緩沖液 (pH 7.0)，5%乙醇助溶。

30 ℃、120 r/min反應(yīng)24 h，期間分別于20 min、40 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h時(shí)取樣檢測轉(zhuǎn)化率。通過HPLC測定不同時(shí)間樣品的底物1-萘乙酮和產(chǎn)物(R)-1-(1-萘基)乙胺的濃度，并計(jì)算出反應(yīng)轉(zhuǎn)化率繪制反應(yīng)進(jìn)程。

1.9 分子對(duì)接與分子動(dòng)力學(xué)分析

利用Discovery Studio軟件的虛擬氨基酸突變模塊，以1.4中ARTA-WT為模板進(jìn)行虛擬氨基酸突變得到ARTA-F225M/C281I。通過分子對(duì)接模塊將ARTA-WT和ARTA-F225M/C281I分別對(duì)接底物1-萘乙酮，分別分析野生型和F225M/C281I與1-萘乙酮之間的相互作用力。通過分子動(dòng)力學(xué)模擬模塊對(duì)ARTA-WT和ARTA-F225M/C281I分別進(jìn)行時(shí)長為100 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬，并分析均方根偏移 (RMSD) 和均方根波動(dòng) (RMSF)。

2 結(jié)果與分析

2.1 隨機(jī)突變提高ω-轉(zhuǎn)氨酶活力

采用易錯(cuò)PCR方法對(duì)WT進(jìn)行隨機(jī)突變，以1-萘乙酮作為底物進(jìn)行高通量篩選，最終從10 000個(gè)突變體中獲得了一株催化活力提高的突變體，測序結(jié)果為C281I。純化后測得突變體C281I的比活力為 (8.78±0.25) mU/mg，相比于WT的比活力((5.59±0.14) mU/mg) 提高了約57%。

2.2 半理性設(shè)計(jì)構(gòu)建突變酶

對(duì)Tyr67、Trp192、Gly224、Phe225這4個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行丙氨酸掃描，相比于WT，發(fā)現(xiàn)只有F225A的比活力有所提升，而Y67A、W192A、G224A的比活力下降明顯 (圖1A)。因此，對(duì)Phe225進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變，獲得19種突變酶。

對(duì)WT和19種突變酶進(jìn)行酶活測定，結(jié)果表明，突變體F225M比活力最高 (圖1B)，為(10.07±0.49) mU/mg，與WT相比提高了約80%。將F225M與隨機(jī)突變篩選到的C281I突變體進(jìn)行組合突變得到突變體F225M/C281I，其純酶比活力為 (9.37±0.55) mU/mg，相比WT提高了67%，因此選擇突變體F225M、C281I和F225M/C281I為對(duì)象進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 WT與突變酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析

將純化后的突變酶F225M、C281I和F225M/C281I進(jìn)行酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析 (表2)，與WT相比，突變體F225M、C281I和F225M/C281I的kcat分別提高了110%、55%和85%，Km分別下降了44%、49%和56%，催化效率kcat/Km分別提高了2.81倍、2.08倍和3.42倍。突變體F225M、C281I和F225M/C281I相比于WT均表現(xiàn)出較低的Km值和較高的kcat值，這表明突變體的催化效率提高歸因于酶與底物親和力的增強(qiáng)[29]。

如表2所示，與WT相比，突變體在30 ℃和40 ℃的半衰期雖有一定提高，但提升并不顯著，其中提升最多的F225M/C281I在30 ℃和40 ℃的半衰期分別僅提高了0.64 h和0.33 h。因此，分子改造并未對(duì)酶的熱穩(wěn)定性造成顯著的影響，仍保持與野生酶相當(dāng)?shù)陌胨テ凇?/p>

以上結(jié)果表明，獲得的3個(gè)突變酶 (特別是F225M/C281I) 對(duì)1-萘乙酮底物親和力以及催化效率均有提高，并保持與野生型相當(dāng)?shù)臒岱€(wěn)定性。

2.4 反應(yīng)溫度及pH對(duì)WT和突變酶的影響

反應(yīng)溫度對(duì)WT與突變酶F225M、C281I和F225M/C281I的影響如圖2A所示。WT和突變酶的最適反應(yīng)溫度均為30 ℃，在20–30 ℃時(shí)，比活力隨著反應(yīng)溫度升高而上升；在30–50 ℃時(shí)，比活力隨著反應(yīng)溫度升高而下降。其中在30–35 ℃范圍內(nèi)，WT和突變酶比活力均維持在最高比活力的70%以上。

pH對(duì)WT與突變酶反應(yīng)的影響如圖2B所示。WT與突變酶F225M、C281I和F225M/C281I最適反應(yīng)pH均為7.0。在pH 5.0–7.0范圍內(nèi)時(shí)，WT與突變酶比活力隨著反應(yīng)pH的增高而上升；當(dāng)緩沖液在pH 7.0–8.0范圍內(nèi)，比活力隨著反應(yīng)pH的增高而下降。在pH 6.5–7.5范圍內(nèi)，WT與突變酶比活力均維持在70%以上。

圖1 WT及突變體酶比活力 (A：丙氨酸掃描；B：定點(diǎn)飽和突變與組合突變)Fig.1 Specific activities of WT and its mutants.(A) Alanine scanning.(B) Site-directed saturation mutagenesis of Phe225 and combinatorial mutation.

表2 WT及突變體酶學(xué)特性Table 2 Enzymatic characterization of WT and its mutants

圖2 WT及突變體的最適反應(yīng)溫度 (A) 和最適反應(yīng)pH (B)Fig.2 Optimum reaction temperature (A) and pH (B) of WT and its mutants.Buffers include sodium citrate buffer(pH 5.0–6.0),PBS buffer (pH 6.0–8.0) and Gly-NaOH buffer (pH 8.0–9.0) were used.

2.5 酶催化10 mmol/L 1-萘乙酮的反應(yīng)進(jìn)程

在10 mmol/L的1-萘乙酮底物濃度下，采用0.1 U/mL WT和突變酶。如圖3所示，在前2 h反應(yīng)速率最快，從2 h開始反應(yīng)開始變緩，到12 h反應(yīng)基本趨于穩(wěn)定。反應(yīng)24 h，突變酶的轉(zhuǎn)化率均較WT有所提高，突變酶F225M、C281I和F225M/C281I的轉(zhuǎn)化率分別為76.79%±1.69%、69.81%±0.70%、78.87%±2.06%，其中突變酶F225M/C281I比WT (64.41%±2.58%) 提高22%。

圖3 WT及突變酶不對(duì)稱還原10 mmol/L 1-萘乙酮的反應(yīng)進(jìn)程Fig.3 Time course of asymmetric reduction catalyzed by WT and its mutants at 10 mmol/L 1-acetonaphthone.

2.6 突變體的結(jié)構(gòu)模擬分析

為解析突變體催化效率與穩(wěn)定性提高的機(jī)制，通過Discovery Studio進(jìn)行分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬。首先模擬了突變體F225M/C281I突變位點(diǎn)的改變，并進(jìn)行了與底物1-萘乙酮的分子對(duì)接，作用力模擬分析表明 (圖4)，WT與1-萘乙酮12個(gè)氨基酸殘基之間分別存在9個(gè)范德華力、1個(gè)碳?xì)滏I和2個(gè)Pi-烷基作用力。而突變體F225M/C281I與1-萘乙酮之間除了存在12個(gè)范德華力、1個(gè)傳統(tǒng)氫鍵、1個(gè)Pi-烷基作用力，還存在著2個(gè)Pi-Pi T形相互作用力，并且與1-萘乙酮之間存在相互作用力的氨基酸殘基增加到16個(gè)。因此，相比于WT，突變體F225M/C281I除了由于其親和力增加了對(duì)底物1-萘乙酮的結(jié)合之外，底物似乎在結(jié)合口袋中更加穩(wěn)定了，更有利于催化反應(yīng)的進(jìn)行[30]。模擬結(jié)果與實(shí)驗(yàn)測得酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km下降一致，進(jìn)一步解釋了突變體酶活力提高的原因。盡管225位點(diǎn)和281位點(diǎn)遠(yuǎn)離酶活性中心，不直接參與底物的結(jié)合和催化反應(yīng)，但它們?cè)诖呋^程中也會(huì)起較大的輔助作用，并在酶催化過程中對(duì)酶的構(gòu)象變化起一定作用。

圖4 分子對(duì)接分析WT (A、B) 及突變體F225M/C281I (C、D) 與底物1-萘乙酮之間的作用力Fig.4 Molecular docking analysis of interactions between WT,variant F225M/C281I and substrate 1-acetonaphthone.(A–B) 3D and 2D views of the interactions between WT and 1-acetonaphthone.(C–D) 3D and 2D views of the interactions between F225M/C281I and 1-acetonaphthone.

分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果 (圖5) 表明，雖然突變酶F225M/C281I與WT的RMSD沒有明顯變化，但是突變酶F225M/C281I的134–139位點(diǎn)殘基的RMSF比WT明顯降低。RMSF值通常反映分子動(dòng)力學(xué)模擬過程中單個(gè)殘基的波動(dòng)，通過對(duì)RMSF數(shù)值高的氨基酸殘基進(jìn)行突變也是一種常見的提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的方法[31]。因此RMSF的降低與熱穩(wěn)定性呈正相關(guān)，在此猜想突變體F225M/C281I半衰期略微提高可能是由于Met225和Ile281影響了另一條鏈的Loop 134–139區(qū)的剛性。

圖5 分子動(dòng)力學(xué)模擬分析WT及突變酶F225M/C281IFig.5 Molecular dynamics simulation analysis of WT and variant F225M/C281I.(A) RMSD.(B) RMSF.

3 結(jié)論

本研究采用隨機(jī)突變和半理性設(shè)計(jì)相結(jié)合的策略，對(duì)來源于Arthrobactersp.的ω-轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造，篩選得到對(duì)1-萘乙酮具有高催化效率的突變酶F225M、C281I和F225M/C281I。其中F225M/C281I提升最為明顯，與WT相比，其kcat提高了85%，Km下降了56%，相應(yīng)的催化效率kcat/Km提高了3.42倍。在底物1-萘乙酮濃度提高至10 mmol/L時(shí)，F(xiàn)225M/C281I反應(yīng)24 h轉(zhuǎn)化率為78.87%±2.06%，較WT提高了22%。通過Discovery Studio進(jìn)行分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬，分析了突變體F225M/C281I相比于WT催化效率提高的原因是增加了與底物1-萘乙酮之間的Pi-Pi T形相互作用力。突變體F225M/C281I的loop區(qū)134–139位點(diǎn)殘基的均方根波動(dòng)RMSF相比WT明顯降低，與其半衰期略微提高相關(guān)。