李閏婷，陳龍欣，張麗萌，何海迎，王泳，楊若晨，段春輝，劉月琴，王玉琴，張英杰

1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071001

2 鄭州師范學(xué)院 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450044

3 河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽 471023

粒細(xì)胞集落刺激因子 (Granule cell stimulating factor，GCSF) 是集落刺激因子中糖蛋白生長因子中的一員，能支持造血祖細(xì)胞的增殖[1-3]。GCSF可刺激特定骨髓前體細(xì)胞增殖以及分化成粒細(xì)胞，延長中性粒細(xì)胞系各個(gè)階段的祖細(xì)胞的存活時(shí)間，刺激多能干細(xì)胞的增殖和分化，誘導(dǎo)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的形成，誘導(dǎo)成熟中性粒細(xì)胞產(chǎn)生更多的中性粒細(xì)胞并提高其存活率，維持其表型，但是該蛋白的半衰期較短[1-6]。有資料顯示GCSF的表達(dá)量差異可能與某些動(dòng)物的抗病能力密切相關(guān)，有研究通過體外注射GCSF提高牛和狗的免疫力、提高輔助生殖率及治療乳房炎等的報(bào)道[7-17]，但尚無該蛋白用于羊的繁育方面的研究。

卵泡的生長和發(fā)育，受到來自顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞和卵母細(xì)胞自分泌或者旁分泌的基因、激素以及生長因子的作用和調(diào)控[18]。有研究提示細(xì)胞集落刺激因子參與了卵泡發(fā)育和排卵的生理過程，這種炎癥性細(xì)胞因子可能以自分泌和旁分泌的方式參與到卵泡周期的調(diào)控當(dāng)中，在發(fā)育的卵泡周圍存在著巨噬細(xì)胞，這些細(xì)胞通過分泌內(nèi)皮生長因子和其他細(xì)胞因子起到促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖的作用[18]。研究發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B，PKB/AKT) 和肝激酶B1 (Liver kinase B1，LKB1)/AMP活化蛋白激酶 (AMPactivated protein kinase，AMPK) 信號(hào)通路相關(guān)因子共同參與調(diào)控卵泡顆粒細(xì)胞增殖、卵泡直徑變化、成熟和周期性排卵等過程[19]。有報(bào)道顯示GCSF在PI3K/AKT通路中起到重要作用[20-21]。

本研究通過分子克隆的方法，原核表達(dá)羊GCSF蛋白，并將純化的GCSF蛋白添加到體外培養(yǎng)的綿羊顆粒細(xì)胞中，通過細(xì)胞活力試驗(yàn)、細(xì)胞周期試驗(yàn)和凋亡試驗(yàn)，研究GCSF對(duì)顆粒細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為GCSF作為分子靶點(diǎn)用于提高綿羊免疫力的分子遺傳育種研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

宿主菌大腸桿菌Escherichia coliXL1-Blue、原核表達(dá)載體pET28a均由鄭州師范學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。DMEM/F12培養(yǎng)基為Gibco產(chǎn)品。E.coliBL21(DE3) 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞、TransGen質(zhì)粒提取試劑盒、Anti-His Mouse Monoclonal Antibody、HRP標(biāo)記的Goat Anti-Mouse IgG(H+L)、6× Protein Loading Buffer及DNA marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。DNA膠回收試劑盒為QIAgen產(chǎn)品。Ni-NTA凝膠購自南京金斯瑞生物科技有限公司。ECL發(fā)光液試劑盒購自晶彩公司。Annexin-V FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)。胰酶替代物 (不含EDTA)和AlamarBlue?HS Cell Viability Reagent購自賽默飛世爾科技 (中國) 有限公司。碘化丙啶(Propidium iodide，PI) 購自Life technologies。限制性內(nèi)切酶購自NEB北京。其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 羊GCSF的克隆

根據(jù)羊GCSF的C-末端的序列 (GenBank登錄號(hào)：L07939)，由GENEWIZ公司進(jìn)行合成并連接到pUC57載體上。

pUC57-GCSF與載體質(zhì)粒pET28a分別進(jìn)行BamH Ⅰ和NcoⅠ雙酶切后回收目的大小的DNA片段，用T4 DNA連接酶將兩個(gè)片段連接后42 ℃熱激60 s轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coliXL1-Blue中，涂布于含有50 μg/mL卡那霉素和100 μg/mL四環(huán)素的2×YT固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。次日挑取單克隆增菌培養(yǎng)后用TransGen質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定、PCR鑒定及序列測定 (GENEWIZ) 分析，將轉(zhuǎn)化獲得的陽性重組質(zhì)粒命名為pET28a-GCSF。以熱休克法 (42 ℃熱激60 s) 將重組質(zhì)粒pET28a-GCSF轉(zhuǎn)化宿主菌E.coliBL21(DE3) 中，重組菌命名為BL21(DE3)/pET28a-GCSF。

1.3 羊GCSF的表達(dá)

取重組菌BL21(DE3)/pET28a-GCSF接種于2 mL的LB培養(yǎng)基 (含50 μg/mL卡那霉素) 中，37 ℃培養(yǎng)至OD600約為0.6時(shí)，加IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)劇烈振蕩培養(yǎng)5 h后，取1 mL菌液，10 000×g離心，棄上清，在沉淀中加入70 μL PBS、20 μL 6×蛋白上樣緩沖液和10 μL 1 mmol/L DTT后，煮沸5 min，取10 μL用于SDS-PAGE。同時(shí)，設(shè)未誘導(dǎo)重組菌作為對(duì)照。確定重組羊GCSF能夠表達(dá)后，進(jìn)行大量搖菌表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)方法同上。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，用50 mL離心管收集全部培養(yǎng)物，8 000 r/min離心20 min收集菌體沉淀。

1.4 羊GCSF的純化與鑒定

上述菌體沉淀加入20 mL的PBS溶液 (按照1︰20稀釋)，充分重懸菌體沉淀。對(duì)重懸液中的菌體進(jìn)行冰浴超聲破碎20 min，超聲破碎程序：超聲5 s，暫停5 s。超聲后12 000 r/min離心收集上清。上清中的重組蛋白用Ni-NTA凝膠裝填的重力柱進(jìn)行純化，詳細(xì)的溶液配方與操作步驟參考Ni-NTA凝膠說明。主要包括2 mL的填料裝填到25 mL的空柱中，依次用ddH2O和結(jié)合緩沖液各10 mL對(duì)柱子進(jìn)行平衡；超聲破碎后的上清全部過柱；之后用20 mL的結(jié)合緩沖液分兩次洗滌柱子；待結(jié)合緩沖液全部流出后，用洗脫緩沖液洗脫柱子上結(jié)合的蛋白，并收集流出液。將所有收集的流出液用3 kDa的超濾管進(jìn)行超濾濃縮，并用PBS替換其中的含有咪唑的溶液。濃縮后的樣品用分子篩Superdex75 10/300 GL在AKTA蛋白純化系統(tǒng)中進(jìn)行精細(xì)純化，收集進(jìn)樣后12 min出峰的溶液，最后再經(jīng)3 kDa的超濾管進(jìn)行超濾濃縮，濃縮液即為純化的GCSF蛋白質(zhì)溶液。

純化的GCSF蛋白溶液用NanoDrop2000C測量濃度后進(jìn)行分裝。取2 μg用于SDS-PAGE和Western blotting檢測。Western blotting檢測采用硝酸纖維素膜，90 V轉(zhuǎn)膜30 min，5%脫脂乳 (含有0.05%的Tween20的PBST配制) 室溫封閉2 h，一抗為Anti-His Mouse Monoclonal Antibody，室溫孵育1 h，二抗為HRP標(biāo)記的Goat Anti-Mouse IgG(H+L)，室溫孵育1 h，ECL發(fā)光液顯色，用多色熒光化學(xué)發(fā)光凝聚成像系統(tǒng)拍照保存結(jié)果。其余蛋白儲(chǔ)存于?80 ℃?zhèn)溆?。使用時(shí)用DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋至需要的濃度。

1.5 羊GCSF的活力驗(yàn)證

M-NSF60細(xì)胞是一種用于檢測GCSF活力的細(xì)胞。從液氮中取出的M-NSF60細(xì)胞迅速在37 ℃的水浴中融化，立即轉(zhuǎn)移到37 ℃預(yù)熱的含10%FBS、1%雙抗、2 nmol/L β-巰基乙醇、62 ng/mL hMCSF的RPMI1640培養(yǎng)基中重懸浮細(xì)胞，用白細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個(gè)細(xì)胞/mL，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h后離心收集細(xì)胞傳代。進(jìn)行GCSF生物學(xué)活性檢測前，離心收集細(xì)胞，加入RPMI1640培養(yǎng)基(含10% FBS、1%雙抗、2 nmol/L β-巰基乙醇) 洗滌細(xì)胞3次后，加入終濃度為0、0.03、0.30、3.00、30.00、300 ng/mL GCSF或62 ng/mL hMCSF的RPMI1640培養(yǎng)基 (含10% FBS、1%雙抗、2 nmol/L β-巰基乙醇) 中用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)48 h后，每孔分別再加入10 μL AlamarBlue? HS細(xì)胞活力試劑溶液在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育3 h，用EnVision?多標(biāo)記微孔板檢測儀在Ex/Em分別為560 nm/590 nm進(jìn)行吸光值檢測。

1.6 羊顆粒細(xì)胞的體外培養(yǎng)

從唐縣瑞麗肉食屠宰場收集1歲左右的小尾寒羊卵巢，分別用醫(yī)用酒精和生理鹽水各沖洗表面3次后，立即放入盛有約37 ℃的生理鹽水 (含1%的雙抗) 的保溫瓶中，3 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。將采回的卵巢用醫(yī)用酒精沖洗3次，再用37 ℃預(yù)熱的DPBS (Gibco) 緩沖液清洗3次，用已滅菌的小剪子剪掉卵巢外筋膜，將卵巢放在盛有37 ℃預(yù)熱的含10% FBS (Gibco)、1.5%雙抗 (Gibco) 的DMEM/F12 (Gibco) 培養(yǎng)基中，洗滌2次。用滅菌的刀片將卵泡直徑為3–7 mm的卵泡逐個(gè)割破，用滅菌的小鑷子將卵泡液擠壓出來，然后將全部培養(yǎng)液吸至15 mL離心管中，吹打后垂直靜置10 min，使卵母細(xì)胞和其他小組織沉淀，吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的無菌15 mL離心管，100×g離心10 min，棄掉上清。加入DMEM/F12培養(yǎng)基 (含10% FBS、1%雙抗) 重懸細(xì)胞，離心洗滌 (100×g，10 min)后棄掉上清，重復(fù)3次。重懸浮細(xì)胞使之成為單細(xì)胞懸液，用白細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個(gè)細(xì)胞/mL，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)液，去除未貼壁的細(xì)胞。貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞即為顆粒細(xì)胞，加入DMEM/F12培養(yǎng)基 (含10% FBS、1%雙抗) 繼續(xù)培養(yǎng)。

1.7 細(xì)胞增殖檢測

待顆粒細(xì)胞長滿至培養(yǎng)瓶的80%時(shí)用胰蛋白酶消化，并按1×105個(gè)細(xì)胞/mL分別接種于96孔板中，每孔100 μL，分成2個(gè)處理組：對(duì)照組 (不添加GCSF只添加DMEM/F12培養(yǎng)基) 和添加了不同濃度GCSF蛋白的DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋液的試驗(yàn)組 (600 ng/mL、60 ng/mL、6 ng/mL、0.6 ng/mL和0.06 ng/mL)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，連續(xù)培養(yǎng)2 d，每天定時(shí)加入10 μL AlamarBlue?HS細(xì)胞活力試劑溶液后在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育3 h，用EnVision?多標(biāo)記微孔板檢測儀在Ex/Em分別為560 nm/590 nm進(jìn)行吸光值檢測。

1.8 細(xì)胞周期檢測

待顆粒細(xì)胞長滿至培養(yǎng)瓶的80%時(shí)用胰酶替代物 (不含EDTA) 消化，并按2×105個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種4 mL于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，分成2個(gè)處理組：對(duì)照組 (不添加GCSF只添加DMEM/F12培養(yǎng)基) 和添加了60 ng/mL GCSF蛋白的DMEM/F12稀釋液的試驗(yàn)組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。顆粒細(xì)胞處理24 h后，用胰酶替代物 (不含EDTA) 消化處理細(xì)胞3 min，100×g離心3 min收集細(xì)胞。PBS重懸細(xì)胞100×g離心3 min洗滌一次。細(xì)胞用1 mL的PBS重懸后，加入?20 ℃預(yù)冷的無水乙醇4 mL，邊加邊混勻，避免細(xì)胞結(jié)團(tuán)。固定細(xì)胞過夜后，離心收集細(xì)胞，用含有2%FBS的PBS重懸細(xì)胞。加入終濃度為1 μg/mL的PI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，避光室溫孵育15 min。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，每次計(jì)數(shù)最少2×104個(gè)細(xì)胞，結(jié)果用NovoExpress軟件進(jìn)行細(xì)胞周期擬合分析。

1.9 細(xì)胞凋亡檢測

待顆粒細(xì)胞長滿至培養(yǎng)瓶的80%時(shí)用胰酶替代物 (不含EDTA) 消化，并按1×105個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種2 mL于6孔板中，分成2個(gè)處理組：對(duì)照組 (不添加GCSF只添加DMEM/F12培養(yǎng)基)和添加了60 ng/mL GCSF蛋白的DMEM/F12稀釋液的試驗(yàn)組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h后，用胰酶替代物 (不含EDTA) 消化處理細(xì)胞3 min，加入含10% FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，將細(xì)胞輕輕吹打下來轉(zhuǎn)入無菌的2 mL離心管中，100×g離心5 min。用含2% FBS的PBS洗滌細(xì)胞2次，100×g離心5 min，棄上清。加入500 μL結(jié)合緩沖液使細(xì)胞懸浮，分別單獨(dú)或同時(shí)加入Annexin-V FITC 5 μL和PI染液5 μL，輕輕吹打混勻，室溫 (25 ℃) 避光反應(yīng)15 min后采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示。P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊GCSF的克隆、表達(dá)與純化

擴(kuò)增得到的GCSF基因片段分別經(jīng)雙酶切后，回收目的片段，連接到同樣經(jīng)過雙酶切的pET28a載體上并轉(zhuǎn)化到E.coliXL1-blue宿主菌株中后，分別提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR、酶切和測序鑒定，結(jié)果均與預(yù)期相符，其中測序結(jié)果與之前用L07939的序列繪制的質(zhì)粒圖譜比對(duì)結(jié)果如圖1所示，測序得到的序列與預(yù)期序列完全一致。鑒定正確的質(zhì)粒命名為pET28a-GCSF。

圖1 GCSF基因片段的測序比對(duì)結(jié)果Fig.1 Alignment of GCSF sequence.The residues that match the pET28a-GCSF were hidden as“.”.

經(jīng)鑒定正確的pET28a-GCSF轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3) 中，將重組菌命名為BL21(DE3)/pET28a-GCSF。分別培養(yǎng)重組菌OD600達(dá)到0.6后，用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)并純化后進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting檢測 (圖2)。

圖2 SDS-PAGE和Western blotting檢測純化的GCSF蛋白Fig.2 SDS-PAGE and Western blotting analysis of purified GCSF protein.

2.2 羊GCSF的生物學(xué)活性檢測

羊GCSF的生物學(xué)活性如圖3所示。在0.03–300.00 ng/mL的終濃度范圍內(nèi)，隨著加入GCSF蛋白濃度的增加，M-NSF60細(xì)胞的熒光強(qiáng)度逐漸升高。添加了羊GCSF的試驗(yàn)組中的M-NSF60細(xì)胞的熒光強(qiáng)度與陽性對(duì)照組趨勢一致。證明本研究純化的蛋白有GCSF生物學(xué)活性。

圖3 GCSF蛋白的生物學(xué)活性檢測結(jié)果Fig.3 Bioassay of GCSF protein.The data were averaged across subjects and tested for significance by pair-samples t-test.The P value of GCSF group vs PBS group.**:P<0.01.

2.3 GCSF對(duì)綿羊顆粒細(xì)胞增殖的影響

本實(shí)驗(yàn)室前期研究顯示，體外培養(yǎng)的綿羊卵巢顆粒細(xì)胞，第1天顆粒細(xì)胞處于貼壁生長期，細(xì)胞緩慢生長，培養(yǎng)第2–4天細(xì)胞處于分裂高峰期，細(xì)胞開始大量增殖進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，第4–5天之后，細(xì)胞開始走向衰老退化[17]。本研究中，顆粒細(xì)胞中添加了不同濃度的GCSF后，連續(xù)2 d，每天定時(shí)加入10 μL AlamarBlue?HS細(xì)胞活力試劑溶液后在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育3 h，用EnVision?多標(biāo)記微孔板檢測儀在Ex/Em分別為560 nm/590 nm進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖4所示，在培養(yǎng)時(shí)間24 h和48 h、GCSF濃度0.06–600.00 ng/mL的范圍內(nèi)，隨著加入的GCSF終濃度增加，熒光強(qiáng)度增大。其中在24 h添加GCSF濃度為6.00 ng/mL和60.00 ng/mL時(shí)與對(duì)照組相比差異極顯著 (P<0.01)，濃度為 0.60 ng/mL和600.00 ng/mL時(shí)與對(duì)照組相比差異顯著 (P<0.05)；48 h添加GCSF濃度為60.00 ng/mL和600.00 ng/mL時(shí)與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。細(xì)胞活力與熒光強(qiáng)度成正比。

圖4 GCSF對(duì)綿羊顆粒細(xì)胞增殖的影響Fig.4 The effection of GCSF on proliferation of sheep granulosa cells.The data were averaged across subjects and tested for significance by pair-samples t-test.The P value of GCSF group vs Ctr group.*:P<0.05;**:P<0.01.

2.4 GCSF對(duì)綿羊顆粒細(xì)胞周期的影響

外源添加GCSF培養(yǎng)顆粒細(xì)胞24 h后，細(xì)胞周期擬合結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組相比試驗(yàn)組G1期細(xì)胞比例由 (63.98±1.32)%變?yōu)?(65.45±2.39)%，略有增加，差異不顯著；S期細(xì)胞比例由(26.88±2.62)%變?yōu)?(15.53±1.72)%，顯著減少(P<0.05)，G2/M期細(xì)胞比例由 (9.37±0.84)%變?yōu)?16.94±2.06)%，顯著增多 (P<0.05)。

圖5 細(xì)胞周期比較圖Fig.5 Cell cycles analysis.(A) Cell cycle histogram of the flow cytometry.(B) The statistical analysis of GCSF group vs Ctr group was based on the values of each phase.Note:The data were averaged across subjects and tested for significance by pair-samples t-test.The P value of GCSF group vs Ctr group.* P<0.05.

2.5 GCSF對(duì)綿羊顆粒細(xì)胞凋亡的影響

顆粒細(xì)胞經(jīng)GCSF處理后，經(jīng)過AnnexinVFITC/PI染色如圖6所示，檢測結(jié)果將凋亡細(xì)胞(早期凋亡和晚期凋亡)、正常活細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)分開。24 h時(shí)對(duì)照組 (Ctr) 和試驗(yàn)組 (GCSF) 的凋亡率分別是 (7.02±0.35)%和(6.49±0.32)%。48 h時(shí)對(duì)照組和試驗(yàn)組的凋亡率分別是 (10.25±0.51)%和(8.09±0.41)%。試驗(yàn)組凋亡率和對(duì)照組相比，24 h檢測時(shí)凋亡率差異不顯著，48 h檢測時(shí)凋亡率顯著降低 (P<0.05)。

圖6 GCSF處理后綿羊顆粒細(xì)胞凋亡圖Fig.6 Treatment with GCSF on apoptosis in cultured sheep granulosa cells.Q2-4:early apoptotic cells;Q2-2:late stage apoptotic cells;Q2-3:normal living cell;Q2-1:dead cells.

3 討論

GCSF可刺激粒細(xì)胞分化，延長中性粒細(xì)胞系各個(gè)階段的祖細(xì)胞的存活時(shí)間，誘導(dǎo)成熟中性粒細(xì)胞增殖并提高其存活率，維持其表型，但是該蛋白的半衰期較短，體內(nèi)研究中其他物種來源的GCSF半衰期一般在24 h以內(nèi)[1-6]。持續(xù)時(shí)間越長，添加到培養(yǎng)基中的GCSF的剩余濃度越小，相對(duì)應(yīng)的生物學(xué)活性也會(huì)隨之降低。本研究表達(dá)純化的羊GCSF蛋白用于活力檢測時(shí)，參考了以往的研究報(bào)道[6]，選擇了在培養(yǎng)基中添加羊GCSF蛋白后的48 h這一時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測；在對(duì)顆粒細(xì)胞的影響的研究中，也選擇了48 h以內(nèi)的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測。GCSF對(duì)綿羊顆粒細(xì)胞增殖的影響中，24 h結(jié)果中GCSF組與對(duì)照組相比有兩對(duì)是差異極顯著的，而48 h結(jié)果中僅為差異顯著，這也很可能是由于添加到培養(yǎng)基中的GCSF蛋白被代謝消耗后濃度降低造成的。GCSF作為一種生物大分子，需要與其受體GCSF-R (granulocyte colony stimulating factor receptor) 結(jié)合，相互作用后將信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞。羊GCSF-R在羊顆粒細(xì)胞表面是否存在及存在量多少尚未得到驗(yàn)證，有待繼續(xù)研究。本研究中使用的顆粒細(xì)胞為同一羊的卵巢中統(tǒng)一條件下分離用于后期實(shí)驗(yàn)，可以排除細(xì)胞實(shí)驗(yàn)條件的差異。此外，細(xì)胞增殖、凋亡和周期檢測的結(jié)果可以互相印證羊GCSF促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡活性。

有研究表明GCSF有助于由化療引起的大鼠卵泡嚴(yán)重?fù)p失的恢復(fù)[22-23]。卵泡從生長到成熟期包括募集、選擇、優(yōu)勢化和閉鎖幾個(gè)重要環(huán)節(jié)，僅有少部分卵泡可以在發(fā)育過程之后成熟，大部分在卵泡發(fā)育的不同階段逐漸閉鎖退化[24]。在哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育的各個(gè)時(shí)期受到一些與之相關(guān)的分子及信號(hào)通路的調(diào)控[24]。吳正中等發(fā)現(xiàn)使用GH組與未使用GH組卵相比，泡液GH與IGF-1含量及卵泡液E2濃度和卵巢顆粒細(xì)胞上GHR mRNA、IGF-1R mRNA和STAR mRNA的表達(dá)水平均顯著正相關(guān)[25]。本研究結(jié)果表明GCSF的添加促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖。作為集落刺激因子的糖蛋白生長因子中的一員，可能以與GH相同的方式發(fā)揮作用，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

細(xì)胞進(jìn)入分裂期后，會(huì)嚴(yán)格執(zhí)行細(xì)胞周期各階段的程序及分子事件。細(xì)胞分裂周期主要分為3個(gè)階段，包括：G1期，主要是細(xì)胞器的復(fù)制，細(xì)胞增大；接著，細(xì)胞進(jìn)入S期，主要是DNA的復(fù)制；最后細(xì)胞進(jìn)入G2/M期，細(xì)胞將各組分平均分配到各個(gè)子細(xì)胞中。通過流式細(xì)胞術(shù)可以很容易地檢測細(xì)胞周期的不同階段。如本研究圖3所示，顆粒細(xì)胞經(jīng)GCSF處理后，流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，S期細(xì)胞顯著減少，G2/M期細(xì)胞顯著增加，處于分裂狀態(tài)的細(xì)胞顯著增加，在GCSF的動(dòng)員下，顆粒細(xì)胞分裂速度加快，細(xì)胞周期的分布顯著改變。

卵巢顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡在卵泡閉鎖中起重要的作用[26]。在發(fā)育卵泡中，10%的顆粒細(xì)胞凋亡將注定卵泡閉鎖[23]。細(xì)胞凋亡是一種程序化的細(xì)胞自主死亡過程，在細(xì)胞凋亡的不同階段具有不同的生物化學(xué)變化和細(xì)胞形態(tài)特征[27]。細(xì)胞凋亡有死亡受體通路、線粒體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路3條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。顆粒細(xì)胞的凋亡主要參與兩個(gè)途徑(線粒體途徑和死亡受體途徑)，這兩個(gè)途徑都能交匯Caspase家族的信號(hào)分子。顆粒細(xì)胞凋亡是由Caspase-3酶的活性、促凋亡和抗凋亡蛋白決定的[21]。有研究顯示，GCSF可以在大鼠腦溢血模型中通過PI3K/AKT通路顯著調(diào)高抗凋亡因子B細(xì)胞淋巴瘤-2 (B cell lymphoma-2，Bcl-2) 和血管內(nèi)皮生長因子 (Vascular endothelial growth factor，VEGF) 的表達(dá)，抑制促凋亡因子Caspase-3的表達(dá)，從而影響細(xì)胞生長和凋亡[20,28-29]。本研究的結(jié)果顯示，外源添加的GCSF可能以相同的方式影響細(xì)胞周期的分布，促進(jìn)了顆粒細(xì)胞的增殖，抑制了顆粒細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而可能影響卵泡的發(fā)育及排卵，其分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究驗(yàn)證。