朱依凡，于少雄，仇華吉，王翀

1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心 廣東省農(nóng)業(yè)動(dòng)物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642

2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069

外泌體是一類絕大多數(shù)細(xì)胞皆可分泌的小型細(xì)胞外囊泡[1]。20世紀(jì)90年代，美國華盛頓大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)和加拿大麥吉爾大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)相繼發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的胞外環(huán)境中存在囊泡[2-3]。二十多年后，匈牙利科學(xué)家Gy?rgy將所有在細(xì)胞外部且具有脂質(zhì)雙層膜封閉結(jié)構(gòu)的物質(zhì)定義為“細(xì)胞外囊泡 (Extracellular vesicles，EVs)”[4]。EVs有兩種不同的亞型，它們的形成途徑和直徑大小有所不同[5]。一種是由質(zhì)膜向外擠壓出芽產(chǎn)生的微囊泡(Microvesicles，MVs)，其直徑范圍在100–1 000 nm[6]；另一種是在1987年被Johnstone正式命名為“外泌體 (Exosomes)”，其直徑為40–150 nm[7]。外泌體的形成涉及多泡體(Multivesicular bodies，MVBs) 與質(zhì)膜的融合 (圖1)。最初細(xì)胞內(nèi)體向內(nèi)凹陷形成腔內(nèi)囊泡 (Intralumenal vesicles，ILVs)，ILVs接著聚集成為MVBs，最終MVBs與質(zhì)膜融合通過胞吐作用將ILVs釋放到細(xì)胞外空間，這些被釋放的囊泡即為外泌體[8-9]。

起初外泌體被發(fā)現(xiàn)時(shí)并未引起人們的重視，它僅僅被看作細(xì)胞垃圾的“搬運(yùn)工”[2-3]。然而在過去的幾十年里，隨著研究的深入，隱藏在外泌體背后的重要功能被逐步揭開。由于具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，外泌體被細(xì)胞釋放后能夠穩(wěn)定存在于細(xì)胞外環(huán)境中，并且可以包裹蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等生物活性分子，跟隨體液循環(huán)到達(dá)機(jī)體各處。外泌體是發(fā)揮信息傳遞的重要載體[10-12]。

病毒是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生物，必須在細(xì)胞內(nèi)才能完成復(fù)制周期從而產(chǎn)生新的感染性病毒粒子。病毒復(fù)制周期指病毒入侵宿主細(xì)胞在其內(nèi)部完成增殖的全過程，主要涵蓋病毒的入侵、病毒蛋白的翻譯合成、基因組的復(fù)制、病毒粒子的組裝和釋放。病毒粒子的組裝以及ILVs分選進(jìn)入MVBs都需要胞內(nèi)囊泡的參與，此后新合成的病毒粒子和MVBs可以通過胞吐作用釋放至細(xì)胞外(圖1)。這些共用胞內(nèi)囊泡的方式，為病毒“挾持”外泌體提供了可能性。早在2003年就有學(xué)者提出，逆轉(zhuǎn)錄病毒可以利用外泌體形成與分泌的既有途徑合成新的感染性病毒粒子[13]；2013年發(fā)表在Nature上的一項(xiàng)研究報(bào)道顯示，甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus，HAV) 本身不具有囊膜結(jié)構(gòu)，但它可以在復(fù)制時(shí)通過類似途徑合成具有膜結(jié)構(gòu)的病毒顆粒——“有囊膜的HAV”(Enveloped HAV，eHAV)[14]。以上研究表明，外泌體參與病毒的復(fù)制過程。

圖1 病毒復(fù)制與外泌體產(chǎn)生 (改編自參考文獻(xiàn)[8-9,15])Fig.1 The virus life cycle and formation of exosomes (adapted from references [8-9,15]).ER:endoplasmic reticulum;ILVs:intralumenal vesicles;MVBs:multivesicular bodies.

病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)建立有效感染，產(chǎn)生新的子代顆粒。與此同時(shí)，宿主細(xì)胞被病毒感染后，固有的穩(wěn)態(tài)被打破，外泌體遭病毒“挾持”。只有重新控制外泌體并將病毒清除，宿主細(xì)胞才能恢復(fù)至正常的生理狀態(tài)。在這場雙方的博弈中，病毒是如何通過“挾持”宿主外泌體傳播感染？而宿主又是如何利用外泌體抵抗病毒感染？本文將討論病毒操縱外泌體與宿主抗病毒機(jī)制斗爭的動(dòng)態(tài)過程。

1 病毒“挾持”外泌體

與正常細(xì)胞的外泌體相比，由病毒感染的細(xì)胞釋放出的外泌體包含許多宿主不具備的病毒成分，包括病毒的蛋白質(zhì)、基因組及其他遺傳物質(zhì)。例如由人類免疫缺陷病毒 (Human immunodeficiency virus，HIV) 感染的細(xì)胞釋放的外泌體中包含病毒Nef和Tat蛋白[16-17]。在Ⅰ型單純皰疹病毒 (Herpes simplex virus 1，HSV-1) 感染的細(xì)胞中也存在類似的現(xiàn)象，被HSV-1感染的細(xì)胞釋放的外泌體裝載著病毒gB糖蛋白與人白細(xì)胞抗原DR (Human leukocyte antigen DR，HLA-DR) 復(fù)合物[18]。又如細(xì)胞被丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV) 感染后，會(huì)分泌包裹病毒胞膜蛋白E1和E2、病毒RNA及病毒IgG的外泌體[19-21]。除此之外，病毒的其他遺傳物質(zhì)如卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒 (KS-associated herpesvirus，KSHV) 編碼的microRNA也可以富集于感染細(xì)胞的外泌體[22]。通過“挾持”外泌體并將自身成分裝入其中，病毒可以逃避宿主的免疫應(yīng)答，促進(jìn)其在細(xì)胞間的傳播。

1.1 “逃逸”中和抗體

中和抗體 (Neutralizing antibodies，NAbs) 能夠阻斷病毒感染，是常用的抗體治療手段。由于被“挾持”的外泌體能夠在一定程度上替代病毒抵抗NAbs的中和作用，從而導(dǎo)致中和抗體保護(hù)力不足。例如，經(jīng)質(zhì)譜和逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)鑒定分析，口蹄疫病毒 (Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV) 感染的PK-15細(xì)胞所分泌的外泌體包含除L、2A和3B外的所有病毒蛋白以及除UTR外的基因組RNA。由于外泌體將大部分的病毒蛋白和病毒基因組從感染細(xì)胞運(yùn)送至其他細(xì)胞，所以即使游離的FMDV經(jīng)過特異性NAbs的處理后不再具有感染性，被FMDV感染的PK-15仍可通過釋放外泌體促進(jìn)FMDV在細(xì)胞間的傳播[23]。外泌體也在豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV) 逃逸宿主免疫反應(yīng)的過程中發(fā)揮重要的功能。在PRRSV感染的PK-15CD163細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體中，同樣存在M、N及GP5這3個(gè)病毒結(jié)構(gòu)蛋白以及病毒的基因組RNA，并且感染細(xì)胞的外泌體可介導(dǎo)PRRSV在未感染的易感細(xì)胞甚至非易感細(xì)胞中的感染，同樣這種傳遞方式不被NAbs阻斷[24]。此外，E2蛋白是HCV的重要囊膜糖蛋白，在其入侵及復(fù)制過程中發(fā)揮核心作用。E2蛋白的特異性抗體可以阻斷游離HCV粒子的感染，但不影響含有病毒基因組RNA的外泌體介導(dǎo)HCV在細(xì)胞間的感染；與之相對應(yīng)的是，E2蛋白包被的外泌體與HCV在細(xì)胞內(nèi)平行組裝、被釋放至胞外，E2包被的外泌體可隔離NAbs對HCV的中和作用，使HCV保持感染性[25-26]。

1.2 傳遞免疫抑制因子

病毒“挾持”外泌體后通過多種方式抑制宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)。被“挾持”的外泌體可以抑制宿主細(xì)胞抗病毒基因的表達(dá)。分離被新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV) 感染的細(xì)胞所分泌的外泌體，并將其與未感染細(xì)胞共孵育，導(dǎo)致未感染細(xì)胞中的白介素1β (Interleukin 1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α (Tumor necrosis factor α，TNF-α)、干擾素β (Interferon β，IFN-β) 等抗病毒細(xì)胞因子的mRNA水平顯著下降[27]。當(dāng)B細(xì)胞被愛潑斯坦-巴爾病毒 (Epstein-Barr virus，EBV) 感染，其釋放的外泌體包裹著病毒的miR-BART15，被未感染細(xì)胞內(nèi)化后，miR-BART15靶向結(jié)合核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3 (NLR family pyrin domain containing 3，NLRP3) mRNA的區(qū)，抑制NLRP3的轉(zhuǎn)錄和翻譯。由于NLRP3炎性小體的減少，宿主的抗病毒活性也隨之降低[1,28]。此外，為削弱宿主的免疫防御，病毒憑借“挾持”的外泌體誘導(dǎo)宿主免疫細(xì)胞發(fā)生大量凋亡。如裝載埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV) VP40蛋白的外泌體進(jìn)入免疫細(xì)胞后，通過下調(diào)細(xì)胞中RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC) 的Dicer、Drosha、Ago 1等蛋白的表達(dá)，解除miRNA對基因的沉默作用，誘導(dǎo)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞凋亡[29-30]。與之類似的是，HIV的Nef蛋白能夠刺激T細(xì)胞分泌外泌體誘導(dǎo)旁觀者T細(xì)胞凋亡。因此，除了病毒對感染細(xì)胞直接的細(xì)胞毒性作用外，外泌體引發(fā)的未感染的旁觀者T細(xì)胞凋亡也可能是T細(xì)胞耗竭的原因之一[31]。

2 宿主利用外泌體抵抗病毒感染

盡管外泌體介導(dǎo)的病毒成分轉(zhuǎn)移可能有利于傳播病毒感染，但是宿主也可憑借外泌體的運(yùn)輸作用激發(fā)細(xì)胞建立抗病毒狀態(tài)。

2.1 誘導(dǎo)抗病毒因子的表達(dá)

病毒核酸通常會(huì)觸發(fā)感染細(xì)胞的先天免疫反應(yīng)，而包裹病毒核酸的外泌體可在受體細(xì)胞中發(fā)揮相同的作用。HCV能夠在HCV亞基因組復(fù)制子(Subgenomic replicon，SGR) 細(xì)胞中復(fù)制但不產(chǎn)生具有感染性的病毒粒子。HCV SGR細(xì)胞被HCV感染后，分泌的外泌體攜帶病毒RNA成分并將其傳遞至未感染的漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞 (pDC)，激活pDC且誘導(dǎo)其表達(dá)干擾素α (Interferon α，IFN-α)，從而產(chǎn)生抗病毒反應(yīng)[20]。呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV) 感染的細(xì)胞分泌的外泌體含有病毒RNA，載有RSV核酸的外泌體誘導(dǎo)人單核細(xì)胞和氣管上皮細(xì)胞釋放TNF-α、RANTES等細(xì)胞因子和趨化因子，激活細(xì)胞的先天免疫應(yīng)答[32]。

2.2 遞送抗病毒因子

作為抵抗病毒感染的主要宿主防御系統(tǒng)，干擾素家族可誘導(dǎo)抗病毒基因的表達(dá)，啟動(dòng)有效的抗病毒反應(yīng)[33]。外泌體包裹干擾素刺激基因(Interferon-stimulated genes，ISGs) 在細(xì)胞間傳播，增強(qiáng)細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)。

干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白3 (IFN inducible transmembrane protein 3，IFIM3) 是重要的抗病毒因子，能夠在病毒感染的早期抑制病毒侵入細(xì)胞[34]。細(xì)胞被登革熱病毒 (Dengue virus，DENV)感染后，胞內(nèi)干擾素表達(dá)量增加，促進(jìn)下游的IFIM3高表達(dá)來抵御病毒侵入。同時(shí)，細(xì)胞將IFIM3裝載進(jìn)外泌體并釋放至胞外。外泌體在細(xì)胞間運(yùn)輸IFITM3，將其從被DENV感染的細(xì)胞遞送至未感染的細(xì)胞，賦予未感染細(xì)胞同等的抵抗DENV侵入的能力[35]。

此外，IFN-α可誘導(dǎo)HepG2.2.15細(xì)胞表達(dá)人胞苷脫氨酶 (APOBEC3G，A3G) 抵抗乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV) 的感染[36]。通過熒光標(biāo)記試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在IFN-α的刺激下，肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞能夠通過釋放外泌體，將A3G遞送至被感染的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，恢復(fù)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的抗病毒能力[37]。A3G還是細(xì)胞固有免疫系統(tǒng)針對HIV-1和其他逆轉(zhuǎn)錄病毒的關(guān)鍵抗病毒蛋白。載有A3G的外泌體進(jìn)入被HIV-1感染的細(xì)胞，可抑制HIV-1的反轉(zhuǎn)錄及病毒蛋白的合成，阻止HIV-1復(fù)制[38]。來自健康男性的精液外泌體被受體細(xì)胞內(nèi)化后，釋放其內(nèi)包裹的抗病毒因子APOBEC3來抑制HIV-1的RNA逆轉(zhuǎn)錄，阻礙其復(fù)制[39]。

2.3 抑制病毒傳播

外泌體通過阻礙病毒對宿主細(xì)胞的入侵來抑制病毒感染。陰道上皮細(xì)胞是HIV在性傳播途徑中最早接觸的細(xì)胞，HIV-1能夠通過胞吞作用進(jìn)入其中，而精液來源的外泌體可引發(fā)這一過程的阻滯，進(jìn)而降低HIV-1從陰道上皮細(xì)胞向靶細(xì)胞傳播的效率[40-41]。HIV還可通過結(jié)合細(xì)胞表面的受體進(jìn)行入侵。樹突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞間粘附分子3-結(jié)合非整合素 (Dendritic cell specific intercellularadhesion-molecule-3 grabbing nonintegrin，DCSIGN) 是樹突狀細(xì)胞重要的模式識(shí)別受體，可以與HIV-1結(jié)合，而來自健康女性乳汁的外泌體表面帶有DC-SIGN的配體——可溶性粘蛋白1(MUC1)，因此乳汁外泌體能夠在單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞 (Monocyte-derived dendritic cells，MDDC) 上與HIV-1競爭性結(jié)合DC-SIGN受體，從而抑制HIV-1的復(fù)制并減少病毒向CD4+T細(xì)胞的傳播[42]。

3 總結(jié)與展望

外泌體是宿主重要的物質(zhì)及信息傳遞工具，它本身是中立的存在，其內(nèi)容物的包裹取決于它的供體細(xì)胞，而在它的受體細(xì)胞上則體現(xiàn)內(nèi)容物的功能。當(dāng)病毒感染宿主時(shí)，外泌體的功能表現(xiàn)出兩面性 (表1)。一方面，外泌體由于病毒的“挾持”而協(xié)助病毒逃逸中和抗體及抑制宿主的免疫應(yīng)答。另一方面，外泌體也輔助宿主誘導(dǎo)產(chǎn)生和傳遞抗病毒因子，建立抗病毒的防御機(jī)制。外泌體功能的兩面性是病毒與宿主博弈的結(jié)果，但目前尚不明確病毒或宿主對外泌體控制權(quán)的具體因素，可能與病毒的感染時(shí)期、病毒的感染水平以及外泌體靶細(xì)胞的特性等有關(guān)。此外，病毒感染會(huì)引起宿主外泌體內(nèi)容物的改變，最明顯的差異在于外泌體內(nèi)出現(xiàn)了外源性的病毒成分，既有病毒基因組，也有病毒蛋白。不同的病毒其遺傳物質(zhì)、形態(tài)結(jié)構(gòu)、種屬特征迥異，外泌體對病毒成分的包裹是否具有傾向性還有待探討。

表1 外泌體在病毒感染和免疫應(yīng)答中的作用Table 1 Various functions of exosomes in viral infections and immune responses

近年來研究外泌體的熱潮只增不減。然而迄今為止，有關(guān)外泌體調(diào)控病毒感染宿主細(xì)胞的機(jī)制研究占比較少，主要原因在于學(xué)者們面臨如何高效、便捷地將外泌體與病毒粒子分離開來并同時(shí)保留外泌體生物活性的技術(shù)瓶頸。由于病毒與外泌體的大小相近，通過超速離心法、聚合物沉降法、凝膠排阻法等分離未感染細(xì)胞的外泌體(后簡稱“未感染外泌體”) 的方法來分離感染細(xì)胞的外泌體 (后簡稱“感染外泌體”)，得到的產(chǎn)物往往是外泌體與病毒粒子摻雜在一起的混合物[43-44]?，F(xiàn)已證明，聯(lián)合使用密度梯度離心或免疫磁珠吸附的方法可以從混合物中純化出感染外泌體(表2)。密度梯度離心法的使用成本較低，但存在耗時(shí)久、介質(zhì)洗脫困難等問題；而免疫磁珠由外泌體標(biāo)記蛋白(CD63或CD81)的抗體包被，可以特異性吸附外泌體，因此通過該法獲得的外泌體的純度高，然而也存在抗體對于不同物種來源的外泌體可能不通用以及磁珠處理通量小等問題[44]。外泌體的純化方法有待進(jìn)一步優(yōu)化。目前，建立病毒感染細(xì)胞模型的技術(shù)已經(jīng)十分成熟，純化外泌體有助于建立內(nèi)化感染外泌體的細(xì)胞模型，以便開展病毒感染宿主細(xì)胞的機(jī)制研究，為探索阻斷病毒感染的防控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

表2 不同病毒感染細(xì)胞外泌體的純化方法Table 2 Methods for purifying exosomes released from virus-infected cells

病毒感染細(xì)胞引起細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等生物活性分子的表達(dá)發(fā)生變化。外泌體包裹這些分子釋放至胞外，被未感染細(xì)胞內(nèi)化后釋放包裹的分子發(fā)揮調(diào)控作用。外泌體不僅調(diào)節(jié)病毒感染的致病機(jī)制，還影響宿主的抗病毒免疫反應(yīng)。研究外泌體有助于為抗擊病毒感染提供新的思路。