蘇海蘭,鄭梅霞,陳 宏,單寄坪,朱育菁
(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所,福建 福州 350003;2.福建承天農(nóng)林科技發(fā)展有限公司,福建 南平 354100)
重樓為我國(guó)瀕危珍稀中藥材,具有鎮(zhèn)痛、止血、抗炎和抗腫瘤等活性,是云南白藥和片仔癀等260多種中成藥的主要原料[1—4]。七葉一枝花(別名華重樓)(Paris polyphyllavar.chinensis)和云南重樓(別名滇重樓)(P.polyphyllavar.yunnanensis)是歷版《中國(guó)藥典》收載的2 種重樓基原藥材。近年來,福建、江西和浙江等南方低山丘陵區(qū)重樓種植面積不斷擴(kuò)大,但存在藥材依賴采挖野生資源、缺乏主栽品種、引種云貴高原重樓種質(zhì)資源失敗等問題,同時(shí),南方低山丘陵區(qū)相關(guān)重樓資源適應(yīng)性評(píng)價(jià)尚未見有報(bào)道。黎華君等[5]對(duì)野生重樓資源的種類、分布情況及形態(tài)特征進(jìn)行了歸納,對(duì)百宜野生重樓資源的保存和利用等提出了建議。尹鴻翔等[6]對(duì)川、滇地區(qū)重樓屬的資源、開發(fā)利用情況和瀕危狀態(tài)開展了實(shí)地調(diào)查,并依據(jù)《中國(guó)藥典》重樓藥材的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)對(duì)該地區(qū)50 份重樓藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。蘇澤春[7]等采用TOPSIS 法與聚類分析法對(duì)23 份云南重樓資源的親緣關(guān)系進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),其中有12 份云南重樓資源具有優(yōu)勢(shì)種源的特性,且在4 個(gè)聚類群中均有分布。對(duì)南方低山丘陵區(qū)重樓資源適應(yīng)性的研究報(bào)道尚少,導(dǎo)致盲目引種和栽培不當(dāng)?shù)痊F(xiàn)象時(shí)有發(fā)生,嚴(yán)重制約重樓種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本文搜集全國(guó)各地120 份重樓資源,并統(tǒng)一栽植在福建省光澤縣,通過對(duì)其物候期、農(nóng)藝性狀和重樓皂苷含量等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定和分析,對(duì)在該地生長(zhǎng)較好的七葉一枝花資源進(jìn)行適應(yīng)性評(píng)價(jià),為篩選優(yōu)良品種和選擇適宜的種質(zhì)資源提供參考。
重樓資源120 份,其中福建省67 份,云南省16 份、江西省9 份、四川省9 份、湖北5 份、湖南4 份、貴州省3 份、安徽省3 份、廣州2 份和河南省2 份(表1)。每份資源10~300 株,于2014 年栽植于福建省光澤縣承天重樓基地。海拔266 m,年平均氣溫17.6 ℃,平均降雨量1876.4 mm。供試土壤為砂質(zhì)壤土,土壤pH 5.1,有機(jī)質(zhì)29 g·kg-1,全氮0.146%,全磷0.43%,全鉀3.67%,土粒密度2.48 g·cm-3。
1.2.1 資源鑒定
用形態(tài)學(xué)和分子標(biāo)記技術(shù)鑒定方法對(duì)搜集的重樓資源進(jìn)行鑒定。
1.2.2 物候期觀測(cè)
對(duì)120 份資源根據(jù)重樓植株的外部形態(tài)變化,記錄重樓從出苗至倒苗的時(shí)間,包括重樓出苗期、開花期、結(jié)果期和倒伏期。各物候期連續(xù)觀測(cè)2 年,若有資源第二年不出苗,則以第一年觀測(cè)數(shù)據(jù)為準(zhǔn)。
出苗期:記錄20%資源出苗的日期,分析時(shí)折算成農(nóng)歷初一到出苗所需的天數(shù);
開花期:從出苗期至20%植株開花所需的天數(shù);
結(jié)果期:從出苗期至20%植株果實(shí)開始膨大所需的天數(shù);
倒伏期:從出苗期至20%植株倒伏所需的天數(shù)。
1.2.3 七葉一枝花農(nóng)藝性狀測(cè)定和田間病害調(diào)查
選取第二年有出苗或長(zhǎng)勢(shì)較好的資源,經(jīng)鑒定均為七葉一枝花,于7 月進(jìn)行地上部農(nóng)藝性狀及田間病害觀測(cè),11 月挖取相應(yīng)的植株測(cè)量地下部性狀,每份資源調(diào)查5 株。農(nóng)藝性狀測(cè)定包括株高、莖粗、葉長(zhǎng)、葉寬、葉片數(shù)量、葉柄長(zhǎng)、根莖長(zhǎng)、根莖直徑、根系長(zhǎng)、刻痕數(shù)、根系鮮重和根莖鮮重。田間病害調(diào)查包括莖腐病、葉斑病和灰霉病,對(duì)發(fā)病情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并計(jì)算發(fā)病率。
1.2.4 七葉一枝花皂苷含量測(cè)定
根據(jù)2015 年版《中國(guó)藥典》方法,采用HPLC法對(duì)其中長(zhǎng)勢(shì)較好的49 份七葉一枝花資源的重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅱ和重樓皂苷Ⅰ進(jìn)行測(cè)定,并計(jì)算四種重樓皂苷的總含量。
1.2.5 數(shù)據(jù)處理
采用Excel 2007 進(jìn)行常規(guī)分析,采用DPS 18.10軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,獲得最小值、最大值、平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù),采用系統(tǒng)聚類法歐氏距離對(duì)各資源的特征數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。
120 份重樓資源的來源見表1,前期以形態(tài)學(xué)分類為基礎(chǔ),并利用DNA 條形碼技術(shù)對(duì)搜集的重樓資源進(jìn)行鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有七葉一枝花、云南重樓、亮葉重樓(Paris nitida)、球藥隔重樓(P.fargesii)、凌云重樓(P.cronquistii)、毛重樓(P.mairei)、狹葉重樓(P.polyphyllavar.stenophylla)和北重樓(P.verticillata)。利用ITS2條形碼鑒別及遺傳變異位點(diǎn)分析,云南重樓長(zhǎng)度范圍是457~665 bp,七葉一枝花序列長(zhǎng)度范圍是457~663 bp;區(qū)分云南重樓和七葉一枝花的序列位點(diǎn)共計(jì)8 處;七葉一枝花樣本之間遺傳距離是0~0.004,云南重樓樣本之間的遺傳距離是0~0.054。ITS2序列的遺傳位點(diǎn)和聚類分化與品種有關(guān),資源的地理位置越接近,其相對(duì)遺傳距離越小,說明不同地域環(huán)境是影響重樓遺傳序列變化的重要因素。
不同重樓資源在福建省光澤縣氣候條件下出苗、開花、結(jié)果及倒苗的物候期性狀差異顯著,各物候期性狀的變異系數(shù)分別為93.3%、47.8%、63.2%和18.1%,其中出苗期的變異系數(shù)最大;開花期和結(jié)果期的變異系數(shù)均超過35%;倒苗期的變異系數(shù)最小,但也超過15%。重樓資源間的出苗期最大相差3 個(gè)多月,廣東省資源出苗時(shí)間最早(2018 年2月1 日),云南省資源出苗時(shí)間最晚(2018 年5 月13日),福建本地資源一般于2018 年2 月上中旬出苗。
各資源物候期通過主成分分析(圖1),結(jié)合聚類分析結(jié)果(表2),可分成六類。第1 類群有82 個(gè)資源,占68.3%,2 月出苗,地上部植株年生長(zhǎng)時(shí)間平均276 d,主要為福建、江西和廣東的重樓資源。第2 類群有31 個(gè)資源,占25.8%,4 月底至5 月中旬出苗,第一年地上部植株生長(zhǎng)時(shí)間平均160 d,主要為云南、四川及貴州的重樓資源,花期與展葉期相近,果實(shí)基本上沒有膨大,即沒有完整的物候期。第3 類群有1 個(gè)資源,占0.8%,為湖北的重樓資源,地上部植株年生長(zhǎng)時(shí)間最短(47 d)。第4 類群有3 個(gè)資源,占2.5%,為四川的重樓資源,4 月出苗,地上部植株年生長(zhǎng)時(shí)間為58 d,病害發(fā)生較嚴(yán)重,地上部植株提前倒伏。第5 類群有1 個(gè)資源,占0.8%,為湖南的重樓資源,2 月出苗,地上部植株年生長(zhǎng)時(shí)間僅82 d。第6 類群有2 個(gè)資源,占1.6%,為河南的重樓資源,4 月上旬出苗,地上部植株年生長(zhǎng)時(shí)間平均233 d,有完整物候期。各地重樓資源在福建種植后,原產(chǎn)地海拔越高的資源出苗時(shí)間越晚。由于環(huán)境因素影響,云南、四川和貴州等地區(qū)的重樓資源在福建省種植的第一年有現(xiàn)蕾,但沒有果期;種植的第二年沒有現(xiàn)蕾,80%沒有出苗,20%的出苗期推遲至5 月1 日后,植株地上部8 月枯萎,重樓資源的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)狀態(tài)不良。與福建南平光澤基地同一緯度及地形地貌相似地區(qū)的重樓資源具有完整物候期。
表2 不同類型重樓資源物候期Table 2 Growth period indicators of different group of Rhizoma Paridis
主成分分析如表3 所示,4 個(gè)主要物候期中,前2 個(gè)特征根的累積貢獻(xiàn)率達(dá)88.480%,說明4 個(gè)主要物候期的絕大部分相關(guān)信息可由這前2 個(gè)主成分來概括。第1 主成分的特征值是2.684,貢獻(xiàn)率為67.106%,以出苗期的特征向量值最大,其次是開花期。說明出苗期對(duì)第1 主成分的影響最大,其次是開花期,因此將第1 主成分稱為物候期因子。增大第1 主成分值,可以使物候期增長(zhǎng)。第1 主成分的結(jié)果期和倒伏期的特征向量為負(fù)值,說明倒伏期越早,物候期越短。第2 主成分的特征向量中,載荷較高的是倒伏期,故出苗期和倒伏期這2 種物候期可作為低山丘陵區(qū)域重樓資源的主要物候期。
圖1 重樓資源物候期主成分分析圖Fig.1 Principal component analysis of phenological periods of Rhizoma Paridis
表3 物候期相關(guān)矩陣的特征根、貢獻(xiàn)率及累計(jì)貢獻(xiàn)率Table 3 Characteristic root,contribution rate and cumulative contribution rate of the phenological phase correlation matrix
120 份重樓資源中第二年長(zhǎng)勢(shì)較好的有49 份七葉一枝花資源,對(duì)其田間葉斑病、莖腐病和灰霉病的發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查。南方低山丘陵區(qū)域春夏季節(jié)多雨,七葉一枝花地上部植株的主要病害種類有葉斑病、莖腐病和灰霉病。七葉一枝花資源病害的變異系數(shù)如表4 所示,灰霉病的變異系數(shù)最大(250.1),葉斑病和莖腐病的變異系數(shù)次之,但均超過50%,說明七葉一枝花資源病害變異豐富,可作為良種篩選的有效指標(biāo)。
主成分分析如表5 所示,3 個(gè)主要病害前2 個(gè)特征根的累積貢獻(xiàn)率達(dá)77.038%,說明3 個(gè)主要病害的絕大部分相關(guān)信息可由這前2 個(gè)主成分來概括。第1 主成分的特征根是1.380,方差貢獻(xiàn)率為46.011%,以葉斑病的特征向量值最大,其次是灰霉病,兩者特征向量值相近,說明葉斑病和灰霉病對(duì)第1 主成分的影響大。第2 主成分的特征根是0.931,方差貢獻(xiàn)率為31.027%,以莖腐病的特征向量值最大,說明莖腐病對(duì)第2 主成分的影響最大。將第1和2 主成分稱為抗病性因子,增大第1 主成分值,可以增大七葉一枝花資源的抗病性。
表4 七葉一枝花資源病害發(fā)生情況及變異系數(shù)Table 4 The disease occurrence and its variation coefficient of Paris polyphylla var. chinensis resources
表5 七葉一枝花資源抗病性主成分分析Table 5 Analysis of principal component on disease resistance of Paris polyphylla var. chinensis resources
移栽2 年后,80%重樓資源的果實(shí)為無效果,故沒有測(cè)定生殖性狀。七葉一枝花資源農(nóng)藝性狀相關(guān)性如表6 所示。七葉一枝花資源的莖粗性狀比較特別,與株高、葉數(shù)、葉寬、葉柄長(zhǎng)均為極顯著負(fù)相關(guān),與根系重、根莖重和葉長(zhǎng)亦為負(fù)相關(guān),有待持續(xù)和大量觀測(cè);地上部性狀均與根莖鮮重成正相關(guān),根莖直徑和根系重量與根莖鮮重呈極顯著正相關(guān);刻痕數(shù)與農(nóng)藝性狀均為正相關(guān),刻痕數(shù)是反映重樓生長(zhǎng)年限的一個(gè)指標(biāo),說明在一定范圍內(nèi),生長(zhǎng)年限越長(zhǎng),各指標(biāo)值越大。該結(jié)果可用于指導(dǎo)生產(chǎn)。種植地土壤疏松和有機(jī)質(zhì)含量高有利于七葉一枝花根系生長(zhǎng),提高產(chǎn)量。
表6 七葉一枝花資源農(nóng)藝性狀相關(guān)性Table 6 Correlation of agronomic traits of Paris polyphylla var. chinensis resources
七葉一枝花資源的農(nóng)藝性狀變異系數(shù)如表7,不同資源的農(nóng)藝性狀有明顯的區(qū)域性差別。各個(gè)農(nóng)藝性狀的變異系數(shù)從大到小依次為根莖鮮重>根鮮重>葉柄長(zhǎng)>株高>葉長(zhǎng)>莖粗>根系長(zhǎng)>葉寬>根莖長(zhǎng)>根莖直徑>刻痕數(shù)>葉片數(shù),根莖鮮重的變異系數(shù)最大,葉片數(shù)的變異系數(shù)最小。
表7 七葉一枝花不同種質(zhì)資源的農(nóng)藝性狀變異系數(shù)Table 7 Coefficients of variation of agronomic characteristics of different Paris polyphylla var.chinensis resources
主成分分析如表8 所示,12 個(gè)主要農(nóng)藝性狀前4 個(gè)特征根的累積貢獻(xiàn)率達(dá)80.080%,說明12 個(gè)主要農(nóng)藝性狀的相關(guān)信息可由前4 個(gè)主成分概括。第1 主成分的特征根是4.073,方差貢獻(xiàn)率為33.938%,株高的特征向量值最大,其次是葉寬,說明株高和葉寬對(duì)第1 主成分的影響大(表9)。第2 主成分的特征根是2.787,方差貢獻(xiàn)率為23.227%,根莖直徑的特征向量值最大,其次是根系長(zhǎng),說明根莖直徑和根系長(zhǎng)對(duì)第2 主成分影響最大(表9)。第3 主成分的特征根是1.656,方差貢獻(xiàn)率為13.800%,根莖長(zhǎng)的特征向量值最大,其次是葉數(shù),說明根莖長(zhǎng)和葉數(shù)對(duì)第3 主成分的影響最大(表9)。第4 主成分的特征根是1.094,方差貢獻(xiàn)率為9.115%,以刻痕的特征向量值最大,其次是葉長(zhǎng),說明刻痕和葉長(zhǎng)對(duì)第4主成分的影響最大。第1、2、3 和4 主成分為產(chǎn)量因子,增大4 個(gè)主成分值,可以增加七葉一枝花資源的產(chǎn)量。
表8 七葉一枝花資源農(nóng)藝性狀相關(guān)性主成分分析Table 8 Analysis of principal components of agronomic traits correlation of Paris polyphylla var. chinensis resources
表9 前4 個(gè)主成分對(duì)應(yīng)的特征向量Table 9 The feature vector corresponding to the first 4 principal components
前期已測(cè)定第二年長(zhǎng)勢(shì)較好的49 份七葉一枝花資源的重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ以及4 種重樓皂苷的總含量,不同重樓資源的皂苷種類及含量沒有明顯的區(qū)域性區(qū)別,來自四川省峨眉山市、貴州省貴陽市花溪桐木嶺、福建省三明市泰寧縣大田鄉(xiāng)、福建省三明市建寧縣均口鎮(zhèn)、福建省三明市明溪縣蓋洋鎮(zhèn)、福建省龍巖市連城縣宣和鄉(xiāng)、福建省龍巖市長(zhǎng)汀縣館前和福建省光澤縣寨里鎮(zhèn)8 處的資源可以檢出4 種重樓皂苷。符合2020 年版《中國(guó)藥典》重樓皂苷總含量的資源有27 份,占55%,資源編號(hào)分別是3、7、8、10~21、27、29、32、40~43、45~47、49、113。重樓皂苷Ⅶ、Ⅵ、Ⅱ和Ⅰ的變異系數(shù)分別為57.52%、246.82%、170.50%和296.83%,說明七葉一枝花資源根莖重樓皂苷含量變異豐富,選擇范圍較大(表10)。
表10 七葉一枝花資源根莖重樓皂苷含量變異系數(shù)Table 10 Coefficient of variation of Rhizoma Paridis saponin content
2.6.1 評(píng)分項(xiàng)目與計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)
根據(jù)上述各性狀主成分分析和聚類分析結(jié)果,取物候期、抗病性、農(nóng)藝性狀、有效成分中對(duì)主成分影響較大的12 個(gè)性狀作為評(píng)價(jià)指標(biāo),每個(gè)指標(biāo)分級(jí)計(jì)分如表11。
每份種質(zhì)資源的總得分越高則適應(yīng)性越強(qiáng),適宜推廣;反之則弱,不宜推廣種植。適應(yīng)性分級(jí)如下:
1 級(jí):總計(jì)評(píng)分≥54 分(共12 個(gè)指標(biāo),總分60分),適應(yīng)性較強(qiáng),可直接大面積推廣。
2 級(jí):總計(jì)評(píng)分介于48~53 分,適應(yīng)性較強(qiáng),可開發(fā)利用。
3 級(jí):總計(jì)評(píng)分介于36~47 分,適應(yīng)性中等,有些個(gè)別項(xiàng)目不符合標(biāo)準(zhǔn),可根據(jù)其具體的特點(diǎn),或采取一定措施,在適宜其生長(zhǎng)的環(huán)境中應(yīng)用。
4 級(jí):總計(jì)評(píng)分<36 分,適應(yīng)性較差,有較多指標(biāo)都比較差,不適宜推廣。
2.6.2 綜合評(píng)分
根據(jù)本文建立的七葉一枝花適應(yīng)性綜合評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),在福建種植期間,綜合評(píng)分大于50 分的資源有6 份,經(jīng)鑒定均為七葉一枝花(表12)。其中有4 份資源≥54 分,說明適應(yīng)性較強(qiáng),可根據(jù)具體情況直接利用。
表11 七葉一枝花資源適應(yīng)性評(píng)價(jià)性狀指標(biāo)及計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)Table 11 Character index and scoring standard of adaptability evaluation for P.polyphylla var.chinensis resources
表12 綜合評(píng)分大于50 分的6 份資源Table 12 Six resources with comprehensive evaluation score greater than 50 points
引種七葉一枝花栽培成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)是在本地種植年限在2 年以上,可正常開花結(jié)果和越冬,即種群可以自然更新。相似經(jīng)緯度及地形地貌的資源才能夠正常生長(zhǎng),具有完整物候期。不同區(qū)域重樓資源在福建省種植時(shí)物候期和農(nóng)藝性狀表現(xiàn)差異性最大,華南地區(qū)重樓資源2 月上旬開始出苗,植株地上部年生長(zhǎng)時(shí)間為290 d 左右,有完整的物候期,農(nóng)藝性狀也能表現(xiàn)出資源在原產(chǎn)地的特性。云南、四川和貴州等地的重樓資源在福建省種植第二年有80%沒有出苗,20%的出苗期推遲到5 月1 日后,植株地上部長(zhǎng)勢(shì)弱且過早枯萎,兩至三年后地下部根莖腐爛,全株死亡。經(jīng)多年實(shí)地調(diào)研及生產(chǎn)實(shí)踐摸索分析導(dǎo)致南方低山丘陵區(qū)域引種云貴川品種失敗的主要原因有:1)重樓資源對(duì)環(huán)境條件和種植技術(shù)要求較高;2)閩贛浙南方低山丘陵區(qū)域與云貴高原和四川盆地在地形、氣候和環(huán)境因子上差異較大,陳士林等[9]研究發(fā)現(xiàn)云南重樓的最大生態(tài)相似度區(qū)域主要包括云南、四川、貴州、湖北和湖南等省;3)閩贛浙夏季高溫多雨、春季低溫多雨和土壤有機(jī)質(zhì)少且黏性重等原因?qū)е履戏降蜕角鹆陞^(qū)域的重樓病蟲害較多,且病蟲害種類及發(fā)生規(guī)律、物候期和管理技術(shù)等方面與云貴川地區(qū)具有較大差異。
49 份資源的皂苷種類及含量差異較大,符合2020 年版《中國(guó)藥典》的重樓皂苷總含量有27份資源,占55%,有8 份資源含有重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ4 種重樓皂苷,其中46 份資源的偏諾皂苷總含有量占總皂苷比例的50%以上。陳鐵柱等[10]研究發(fā)現(xiàn)四川、湖北和廣西等21 個(gè)產(chǎn)地七葉一枝花中皂苷含量符合《中國(guó)藥典》的僅占14.3%,有18 個(gè)產(chǎn)地的七葉一枝花的偏諾皂苷總含有量占總皂苷比例的50%以上;李海濤等[11]研究發(fā)現(xiàn)滇東南、滇南、滇西和滇中22 個(gè)產(chǎn)地的云南重樓中皂苷含量符合《中國(guó)藥典》的僅占27.3%;周愛存等[12]研究發(fā)現(xiàn)浙江省七葉一枝花的重樓皂苷含量符合《中國(guó)藥典》的低于50%。
七葉一枝花資源的病害(灰霉病、葉斑病和莖腐病)、農(nóng)藝性狀(根莖鮮重、根系鮮重和葉柄長(zhǎng))和重樓皂苷含量(重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ和Ⅵ)存在著廣泛的變異,變異系數(shù)均超過50%,說明七葉一枝花資源的這些指標(biāo)變異豐富,可作為良種篩選的有效指標(biāo)。各性狀主成分分析和聚類分析結(jié)果表明影響較大的4 項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)是物候期、抗病性、農(nóng)藝性狀和重樓皂苷含量,分別列出5 個(gè)評(píng)分等級(jí)(5、4、3、2、1 分),每份種質(zhì)資源的總計(jì)得分越高,說明適應(yīng)性越強(qiáng),越適宜推廣。南方低山丘陵區(qū)域選擇七葉一枝花種質(zhì)資源時(shí),應(yīng)綜合考慮資源的生物學(xué)特性和自然條件(海拔、光照、濕度和土壤等)等,篩選獲得適宜當(dāng)?shù)胤N植的優(yōu)質(zhì)七葉一枝花品種,培育道地藥材。