張雁云 王戎疆 杜 軍 范六民 佟向軍

（1 北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100875 2 北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100871 3 中國人民大學(xué)附屬中學(xué) 北京 100080）

總分：100 分 時間：120 min

本實驗考試在2 h 內(nèi)完成2 個問題。請按照給出的順序完成任務(wù)，第2 題中的幼蟲將在考試開始后30 min 提供。

問題1：識別蠅幼蟲的組織（45 分）。

任務(wù)1a 和b：識別幼蟲的體軸（7 分）；

任務(wù)1c、d 和e：解剖紅頭麗蠅（Calliphora vicina）幼蟲，分離和識別組織（38 分）。

問題2：幼蟲心臟的生理學(xué)（55 分）。

任務(wù)2a、b 和c：解剖紅頭麗蠅幼蟲暴露搏動的背血管（幼蟲心臟）（10 分）；

任務(wù)2d、e 和f：設(shè)計并完成實驗，已確定作用于背血管的3 種藥理學(xué)試劑的活性（45 分）。

本實驗測試解剖技能、觀察和實驗設(shè)計能力。

重要提示：

●請記住在給定的框中寫下你的姓名、學(xué)生代碼和國家；

●請在答題紙上寫下答案，將你的解剖標(biāo)本置于6 孔顯微鏡載玻片上，答題紙和載玻片都將會被收走；

●確定已收到列出的所有材料和設(shè)備；如果缺少任何物品，請立即舉紅卡示意；

●實驗過程中，請確保妥善處理設(shè)備和用具；由于你自己的原因造成溶液潑灑或損壞設(shè)備，將不予補充；

●在考試結(jié)束哨聲響起時，請立即停筆；

●將你的繪圖紙和白紙用夾子夾在答題紙上，并放入提供的信封中；確保將你的身份識別小標(biāo)簽貼在6 孔顯微鏡載玻片的白色部分上；

●不得將任何紙張、材料或工具等帶出實驗室；

●英文原件可應(yīng)要求提供。

材料和工具

1 臺體視顯微鏡（解剖鏡）；1 個臺燈；2 把解剖鑷子；1 把精細(xì)鑷子，用于移動幼蟲；管中有10條死的幼蟲，已用乙酸乙酯處理過夜（任務(wù)1）；如果需要，可提供更多；玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)有10 只麻醉的幼蟲（任務(wù)2），已用乙酸乙酯處理1 h；這些幼蟲將在需要時提供；2 個底部裝滿黑色硅膠的塑料解剖盤；每個解剖盤邊緣約有20 個細(xì)針，使用時用解剖鑷子移動并將其插入黑色硅膠；1 支1 000 μL 移液器及吸頭；1 支200 μL 移液器及吸頭；3 個1.5 mL Eppendorf 管，標(biāo)記為A、B 和C，分別裝有乙酰膽堿、腎上腺素和章魚胺；1.5 mL Eppendorf 管用于裝稀釋液；100 mL PBS（磷酸緩沖液）；Gelvitol 膠液（襯托介質(zhì)）；計數(shù)器；1 個定時器；有6 個疏水孔的載玻片，疏水孔標(biāo)記為1～6（不要接觸疏水孔）；紙巾；1 支記號筆；1 張繪圖紙；1 張白紙；1 個曲別針；1 面紅旗（若色盲癥識別為深色）；1 面綠旗（若色盲癥識別為淺色）。

問題1：識別幼蟲的器官

前言：

麗蠅科（Calliphoridae）是典型雙翅目類群。幼蟲的形態(tài)特征雖然通常與成蟲不同，但也有許多與成蟲類似的結(jié)構(gòu)特征。在第1 組實驗中，你需要鑒定紅頭麗蠅幼蟲階段中的組織。

圖1 紅頭麗蠅三齡幼蟲（發(fā)育階段）的側(cè)面觀，左側(cè)是前面

肛區(qū)前面是氣門區(qū)，有一對棕色環(huán)形的氣門，里面有一些棕色裂縫，空氣從此進入氣管系統(tǒng)。

在體視顯微鏡下進行解剖，可觀察到幼蟲內(nèi)部組織的結(jié)構(gòu)，如圖2所示。對實驗1 重要的結(jié)構(gòu)有神經(jīng)系統(tǒng)、脂肪體、消化系統(tǒng)、氣管系統(tǒng)和成蟲盤。成蟲盤是離散的上皮細(xì)胞片，在變態(tài)后形成成體的外骨骼。

圖2 高度衍生的雙翅目幼蟲前端內(nèi)部結(jié)構(gòu)的側(cè)面觀

圖3 一種雙翅目幼蟲的背面觀（不是紅頭麗蠅）

在上圖中，脂肪組織未顯示。圖4顯示了2 個用所給材料不完全制備的標(biāo)本，給出的解剖標(biāo)本中沒有顏色和陰影。

圖4 原位解剖

任務(wù)1a

圖1和圖5顯示了紅頭麗蠅的外部形態(tài)。將死的幼蟲置于黑色硅膠解剖盤上，觀察外部結(jié)構(gòu)。通過你的觀察和上述圖表，確定幼蟲的前、后端及上部（背面）和下部（腹側(cè)）。

任務(wù)1b

i）在圖5相關(guān)的方框中，分別填入一個識別數(shù)字（1，2，3 或4），用來表明圖中幼蟲的身體位置。數(shù)字可重復(fù)使用：1=腹面前部，2=腹面后部，3=背面前部，4=背面后部。

ii）將2 個圖片中間的3 個符號（i，ii 和iii）與2 圖中對應(yīng)的結(jié)構(gòu)劃線連接起來（1 個符號對應(yīng)1個圖中的結(jié)構(gòu)即可）。

圖5 紅頭麗蠅幼蟲外部結(jié)構(gòu)

任務(wù)1c

識別相關(guān)結(jié)構(gòu)，簡單測量后，將特定的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移至六孔載玻片上。建議在體視解剖鏡下使用鑷子完成所有操作。

重要提示：移動細(xì)針只能在體視解剖鏡下觀察并使用鑷子完成。當(dāng)將細(xì)針插入組織時，要確保鑷子靠近細(xì)針的銳端而非上部，否則容易導(dǎo)致細(xì)針彎曲，而難以完成操作。始終使用2 把鑷子操縱幼蟲和細(xì)針。

保護好鑷子和標(biāo)本。不要插入幼蟲太深，也不要總是向側(cè)方或上方從標(biāo)本上撕離組織。看起來如圖4A 所示。

一般解剖說明：

1）使用任務(wù)1a 中的幼蟲或用1 只新的蟲子，將幼蟲背面朝上置于黑色硅膠盤上，體視解剖鏡下觀察和解剖。使用解剖鑷子夾取一根細(xì)針，將其插在氣門之后幼蟲后端的肛部。用鑷子輕輕地拉伸幼蟲的前端，將針插在口器之后。

2）使用2 把鑷子夾起最后2 個后刺帶間的體壁并撕開，第1 次撕裂是最難的。可把幼蟲身體后端朝向你，用2 把鑷子將其撕開。

3）通過移液器輕輕將PBS 液體覆蓋制備標(biāo)本。

4）用鑷子沿中線撕開體壁，從后向前撕。仔細(xì)地將每個鑷子的2 個尖端分別放在體壁之下和之上，通過夾緊和拉動輕輕撕裂體壁。在每撕開一個體節(jié)的體壁后，重新調(diào)整鑷子的位置。最后將解剖盤轉(zhuǎn)過來，同樣撕開體壁，直至身體后部插針的部位。

5）將體壁伸展開，并釘在黑色硅膠上，暴露出內(nèi)部結(jié)構(gòu)。用一把鑷子拉住體壁和肌肉，用另一把鑷子將針插上。這時看起來像圖4B。

6）去除多余的脂肪，注意不要破壞腦和腸。用一把鑷子夾起脂肪，將其從組織上移除，或取出置于解剖盤的一側(cè)。

注意：為準(zhǔn)備下一步實驗，在載玻片的每個疏水孔中加1 滴gelvitol 膠液。從解剖盤轉(zhuǎn)移組織至載玻片時，要讓組織保持浸潤在一些液體中，液體的表面張力作用會在鑷子的尖端留一些液體。在載玻片疏水孔gelvitol 膠液中打開鑷子，組織會轉(zhuǎn)移至gelvitol 膠液中。

任務(wù)1d

1）取下嗉囊，加在載玻片的位置1 上。在表1中填寫出嗉囊是在腦的前方還是后方連接至消化系統(tǒng)上。

2）找到唾液腺，取出其中的一個置于載玻片位置2 中，估計唾液腺長度與體長的比值，并將其填寫在表1中。

3）輕輕地解剖出腦，去除氣管并斷開周圍附著的神經(jīng)。將腦置于載玻片的位置3，計數(shù)腦發(fā)出的神經(jīng)總數(shù)，將其填寫在表1中。

4）解剖出1 個后部氣門，要連著一小段氣管。置于載玻片的位置4，在表1中填寫一個氣門上狹縫數(shù)量。

5）取出口器，仔細(xì)剝離多余的肌肉，將口鉤與口器其他部分彼此分開。將2 個口鉤置于加有一滴膠液的載玻片位置5。利用透射光仔細(xì)觀察一個口鉤上的齒數(shù)，記錄在表1中。

6）找到并解剖1 個翅原基，小心地將其置于載玻片位置6。

7）重要信息：你必須將識別標(biāo)簽牢固地黏貼在載玻片的白色區(qū)域，載玻片將在考試結(jié)束時收集并給分。

任務(wù)1e

將依據(jù)膠液中放置的組織是否正確、是否完好無損及下表中的答案給分。

表1 幼蟲組織識別記錄表（38 分）

問題2：幼蟲心臟的生理反應(yīng)

前言：在玻璃培養(yǎng)皿中的幼蟲已被致死劑量的麻醉劑處理過。但在短時間內(nèi)，這些動物的組織仍可對一些藥物產(chǎn)生反應(yīng)，反應(yīng)方式類似于哺乳動物，但也會有所不同。你需要證實下列3 種藥物對于背血管搏動的作用：乙酰膽堿（A）、腎上腺素（B）和章魚胺（C）。在昆蟲中背血管推動血淋巴在開管系統(tǒng)中的循環(huán)，所以相當(dāng)于哺乳動物的心臟。有類似的基因在昆蟲和哺乳動物的發(fā)育中都是需要的。一些哺乳動物激素和神經(jīng)遞質(zhì)可通過同源的受體蛋白而直接在昆蟲組織上產(chǎn)生作用。

任務(wù)2a

準(zhǔn)備好后，舉起綠旗，助教會給你一個裝有10 只剛麻醉的幼蟲的玻璃培養(yǎng)皿。在解剖鏡下，用針固定幼蟲使其腹面向上。首先，在其尾部插針固定，握住其頭部或口器用力拉直幼蟲，不要讓它扭曲或翻轉(zhuǎn)，然后在偽頭后插針固定。

任務(wù)2b

利用與問題1 相同的解剖方法，這次腹面向上。解剖開后，小心地?fù)軇幽c道和馬氏管，用針固定在一旁。同樣可將脂肪移動至一旁或去除。撥動這些組織時，你需要小心地?fù)軘嘁恍┪夤?。背血管是沿著背中線走行的管（圖1和圖6）。在移除其他組織時，不要去除腦和太多的氣管，不要直接或間接地用鑷子碰觸或損傷背血管。所有這些觸碰或損壞都可能阻止“心臟”跳動。如果PBS 由于脂滴而渾濁，則使用1 000 μL 移液器和吸頭小心吸出并更換PBS。

圖6 紅頭麗蠅幼蟲的腹面解剖圖

任務(wù)2c

觀察背血管，應(yīng)該觀察到2 條平行的線。如果背血管正在跳動，2 條線會在橫向方向上向相反的方向脈動／移動，而后一起同步返回，這是一次心跳。當(dāng)對你的準(zhǔn)備滿意時，請舉起綠旗，助教將在這張表上簽名，并確認(rèn)：1）背血管已正確暴露；2）背血管完好無損，且能跳動。

如果背血管未被暴露，助教會向你出示紅旗；如果背血管暴露出來，但不能跳動，助教向你出示紅旗和綠旗；如果背血管成功暴露出來，且能跳動，助教會向你出示綠旗。

該部分解剖，你有10 次試驗／嘗試機會，一旦你已成功暴露一個條跳動的背血管，并已給助教展示過（他們將在考試紙上寫一個特定的代碼），你就可進入任務(wù)2d。

如果你的時間或幼蟲用完，或不想再做進一步解剖，你必須在表格下方簽名，才能跳至任務(wù)2d 結(jié)束考試，否則任務(wù)2d 將不會給分。

助教代碼正確暴露出背血管但沒有搏動（5 分）或正確暴露背血管且搏動（10 分）

如果助教已簽字，且你想進入下一個任務(wù)，請在下面簽字。

任務(wù)2d

觀察：哺乳動物心率受到許多藥劑的影響。神經(jīng)遞質(zhì)例如乙酰膽堿可降低心跳強度（負(fù)離子性）和速率（負(fù)變時性）；相反，激素例如腎上腺素可增加心跳強度（正離子性）和速率（正變時性）。

假設(shè)：從這些觀察結(jié)果可提出如下假設(shè)：假設(shè)H1，乙酰膽堿會降低紅頭麗蠅背血管每分鐘跳動次數(shù)（bpm）；假設(shè)H2，腎上腺素會增加紅頭麗蠅背血管每分鐘跳動次數(shù)（bpm）。在圖7上繪制單線圖，以顯示使用藥物A、B 和W（PBS 沖洗）的預(yù)期結(jié)果，實驗是在單一幼蟲樣本上進行的。確保正確顯示出背血管每分鐘跳動次數(shù)（bpm）在實驗時間中的變化。

圖7 給紅頭麗蠅背血管添加乙酰膽堿（藥物A）、腎上腺素（藥物B）和PBS 沖洗液（W）的預(yù)期結(jié)果的線圖（7 分）

1）你需要設(shè)計并完成實驗檢驗假設(shè)H1 和H2，以揭示昆蟲激素和章魚胺（C）如何作用于在任務(wù)2b 中分離、任務(wù)2c 中確認(rèn)的背血管。

2）下面的長條塊表示你在單一幼蟲樣本上進行實驗理想的持續(xù)時間。將該長條塊分成幾段，表示你分別使用的藥物溶液（A、B 和C）和PBS 沖洗液（W）的順序，實驗對象是任務(wù)2c 中制備的一個幼蟲樣本。在每段中寫入相應(yīng)的字母，前2 步的字母已經(jīng)為你填寫了。

3）在設(shè)計實驗時，你需要考慮并有效地指出組織的洗滌和重復(fù)等。

圖8 實驗設(shè)計：PBS 沖洗液和藥物的添加計劃（12 分）

任務(wù)2e

1）配制新鮮的PBS（W），記錄每分鐘心跳次數(shù)（bpm）的基準(zhǔn)。

2）3 個eppendorf 管分別標(biāo)有A、B 和C，里面有藥物儲存液：A=2×10-2mol／L 乙酰膽堿，B=2×10-2mol／L 腎上腺素，C=2×10-2mol／L 章魚胺。醫(yī)用方瓶中有100 mL PBS 溶液。臨使用前，在1 mL eppendorf 管中將A、B 和C 溶液用PBS 稀釋到工作濃度5×10-3mol／L。在表2中記錄每種藥物稀釋時的體積（單位用μL）。

3）根據(jù)你理想的實驗設(shè)計（圖8），考慮剩余時間，評估藥物A、B、C 和W 對單一解剖標(biāo)本的影響。將靜息狀態(tài)背血管的平均每分鐘跳動次數(shù)和藥物A、B 和C 處理后的平均每分鐘跳動次數(shù)的原始數(shù)據(jù)和平均數(shù)填入表2。

4）根據(jù)你的數(shù)據(jù)，選擇表中bpm 對應(yīng)的響應(yīng)，例如增加、變化不超過10%或減少。

5）從你的數(shù)據(jù)說明每種藥物的受體是否表現(xiàn)出活性，有活性記為1，無活性記為0，填在第4行的對應(yīng)列中。

表2 靜息狀態(tài)的每分鐘跳動次數(shù)，藥物A、B 和C 的效應(yīng)，以及藥物的鑒定（12 分）

任務(wù)2f

1）根據(jù)你實驗獲得的隨時間變化的原始數(shù)據(jù)，在所給的繪圖紙上，畫出一個合適的圖。記住這將代表應(yīng)用于單個實驗的數(shù)據(jù)。

2）對于該實驗，假設(shè)H1 是紅頭麗蠅背血管對乙酰膽堿的響應(yīng)是負(fù)變時性，假設(shè)H2 是背血管對腎上腺素的響應(yīng)是正變時性的，像哺乳動物的心臟一樣。

3）你需要根據(jù)你的數(shù)據(jù)作出決定，接受或拒絕這些假設(shè)。

下面圈出你的決定（2 分）：

H1 接受 拒絕

H2 接受 拒絕