劉 濤，曾 立，謝 曉，高天賜，鄧 研，萬金霞

(1.成都大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106;2.成都大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 610106)

0 引 言

金銀花為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或帶初開的花[1]，夏初花開放前采收并干燥，有清熱解毒與疏散風(fēng)熱的功效，表現(xiàn)出抗炎、抗菌及抗病毒等多種藥理學(xué)活性.據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，有500種以上的中藥制劑含有金銀花[2].現(xiàn)代藥理研究表明，綠原酸是金銀花的主要化學(xué)成分，也是金銀花主要有效成分之一，具有較強(qiáng)的藥理活性.

中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下依據(jù)臨床湯劑煎煮方式規(guī)范化進(jìn)行煎煮、固液分離、濃縮并干燥制得的，為衡量中藥配方顆粒與臨床湯劑是否基本一致的標(biāo)準(zhǔn)參照物.本研究選用15批金銀花飲片制成標(biāo)準(zhǔn)湯劑，以綠原酸含量為指標(biāo)，對(duì)金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行探討.

1 材 料

1.1 儀 器

TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Ichrom5100高效液相色譜儀，大連依利特分析有限公司；TJ270-30A型傅里葉變換紅外光譜儀，天津拓普儀器有限公司；DZTW電子調(diào)溫電熱套，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；FA2004分析電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；HS-3120超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司.

1.2 試 藥

15批金銀花將其進(jìn)行編號(hào)(JYH1～JYH15)，經(jīng)成都大學(xué)藥學(xué)院劉濤研究員鑒定，檢查項(xiàng)均符合文獻(xiàn)[1]中規(guī)定；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純；水為怡寶水.

2 方法與結(jié)果

2.1 方 法

據(jù)文獻(xiàn)[3]中相關(guān)要求，制定工藝流程，稱取金銀花飲片100 g，加12倍水，浸泡30 min，回流提取30 min，趁熱濾過，藥渣加10倍水回流提取20 min，趁熱過濾，合并濾液，減壓濃縮至密度1.1左右，冷凍干燥至粉末狀，即得.

2.2 結(jié) 果

2.2.1 出膏率測(cè)定

金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑經(jīng)濃縮和冷凍干燥后精密稱定質(zhì)量，計(jì)算實(shí)際出膏率如表1所示.

表1 金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率及轉(zhuǎn)移率

2.2.2 金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉中綠原酸的測(cè)定

2.2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

采用Global Chromatography C18 柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為0.4%磷酸溶液-乙腈(87∶13)，檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm，柱溫為30 ℃，體積流量為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，如圖1所示.

2.2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉末0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密移取50%甲醇50 mL后，密塞，稱重，超聲30 min，取出，放冷，稱重，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，精密移取5 mL續(xù)濾液于25 mL容量瓶中，用50%甲醇定容，即得.

2.2.3 對(duì)照品溶液

取綠原酸對(duì)照品適宜，精密稱定，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成質(zhì)量濃度為40 μg/mL的溶液，即得.

2.2.4 精密度考察

取金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉(JYH9)，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，按“2.2.2.1”項(xiàng)下方法連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得綠原酸峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.70%，可知儀器精密度良好.

2.2.5 重復(fù)性考察

取金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉(JYH9)，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，結(jié)果顯示綠原酸平均含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.39%，可知該方法重復(fù)性良好.

2.2.6 穩(wěn)定性考察

取金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉(JYH9)，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液后 0、2、4、8、12、24 h 時(shí)，按“2.2.2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，結(jié)果表明綠原酸峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.11%，可知供試品溶液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

2.2.7 樣品測(cè)定

取15批金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑及其凍干粉，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并于“2.2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算綠原酸的轉(zhuǎn)移率，如表1所示.

3 指紋圖譜分析

3.1 金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉的HPLC指紋圖譜分析

3.1.1 HPLC指紋圖譜色譜條件

流動(dòng)相為水(0.1%甲酸)A：乙腈(0.1%甲酸)B；0～8 min，B(10%～15%)；8～20 min，B(15%～20%)；20～25 min，B(20%～25%)；25～31 min，B(25%～29%)；31～36 min(29%～40%)；36～40 min，B(40%～60%);柱溫為30 ℃，體積流量為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm.

3.1.2 方法學(xué)考察

取金銀花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑(JYH13)，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制得供試品，按“3.1.1”項(xiàng)下條件持續(xù)進(jìn)樣6次，可得其相對(duì)時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.25%、0.24%、0.19%、1.8%、1.5%及0.19%，相對(duì)峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.77%、4.62%、3.33%、4.27%、4.54%及4.78%，表明儀器精密度良好.取金銀花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑(JYH13)，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品，按“3.1.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，結(jié)果表明其平均含量相對(duì)保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.28%、0.23%、0.24%、0.29%、0.25%及0.30%，平均含量相對(duì)峰相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.75%、1.68%、0.88%、4.41%、2.28%及4.58%，可得該方法重復(fù)性良好.取金銀花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑(JYH13)，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制得供試品后0、2、4、6、8及12 h 時(shí)，按“3.1.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明相對(duì)保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.31%、0.25%、0.12%、0.47%、0.33%及0.43%，相對(duì)峰相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.97%、3.86%、3.25%、4.19%、2.58%及3.08%，顯示供試品溶液在制備后12h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

3.2 金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉的紫外指紋圖譜分析

3.2.1 供試品溶液制備

稱取金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密量取純凈水50 mL，超聲處理(功率100 W，頻率40 kHz)至溶解，冷卻后，稱重，用純凈水補(bǔ)重，搖勻，過濾，精密移取續(xù)濾液1 mL，置100 mL棕色容量瓶中，用純凈水定容，搖勻，即得.

3.2.2 光譜掃描條件

以純化水為空白對(duì)照，減少實(shí)驗(yàn)誤差.光譜條件如下：光度模式為Abs，掃描范圍為 200～400 nm，速度為快，信息采集間隔為5.0 nm.

3.2.3 方法學(xué)考察

按“3.2.1”項(xiàng)所述方法取金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑(JYH10)凍干粉制備供試品，按“3.2.2”項(xiàng)方式持續(xù)測(cè)定6次，得到紫外圖譜在325、305、240、275、255及290 nm 處吸光度值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.11%、0%、0%、0.13%、0%及0%，可知儀器精密度良好.取同一批次金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑(JYH10)，按照“3.2.1”項(xiàng)所述方法平行制備供試品 6 份，按“3.2.2”項(xiàng)條件測(cè)定紫外光譜圖，計(jì)算所得紫外譜圖在 325、305、240、275、255及290 nm 處平均含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.21%、1.13%、1.12%、1.16%、1.23%及1.06%，可得該方法重復(fù)性良好.取同一批次金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑(JYH10)，按“3.2.1”項(xiàng)所述方法制備供試品后依次在 0、1、2、3、4、及5 h 按“3.2.2”項(xiàng)條件測(cè)定紫外光譜圖，計(jì)算所得紫外譜圖在325、305、240、275、255及290 nm 處A值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.66%、0.98%、2.11%、3.05%、3.72%及1.35%，可得該方法在5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

3.2.4 金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉紫外指紋圖譜采集

按“3.2.1”項(xiàng)下方法精密稱取15批金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉，制備供試品，并按“3.2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，得其紫外指紋圖譜重疊圖如圖2所示.

3.2.5 紫外對(duì)照指紋圖譜的建立[4]

按“3.2.1”項(xiàng)下方法取10批(JYH1～JYH10)切合文獻(xiàn)[1]的金銀花飲片制備的金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉，制備供試品，并按“3.2.2”項(xiàng)下條件測(cè)定其紫外指紋圖譜，以各波長(zhǎng)的A平均值作為紫外對(duì)照指紋圖譜的A值.紫外對(duì)照指紋圖譜如圖3所示.

3.2.6 相似度計(jì)算

應(yīng)用軟件“IBM SPSS statistics”中雙變量相關(guān)“Kendall’s tau-b”對(duì)10批金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑的紫外指紋圖譜與紫外對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，并進(jìn)行相似度測(cè)算[5]，所得結(jié)果為0.964、0.922、0.978、0.980、0.975、0.927、0.982、0.985、0.961及0.985，表明相關(guān)性顯著.

3.2.7A值

按“3.2.1”項(xiàng)下方法取10批(JYH1～JYH10)切合文獻(xiàn)[1]的金銀花飲片制備的金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉，制備供試品，按“3.2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，得紫外指紋圖譜，結(jié)果見表2.可見按照“3.2.1”項(xiàng)下方法所制備的供試品，按“3.2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定得到紫外指紋圖譜的A值應(yīng)同時(shí)滿足240 nm(0.581～0.744)、255 nm(0.443～0.572)、275 nm(0.252～0.390)、290 nm(0.316～0.488)、305 nm(0.350～0.513)、325 nm(0.389～0.557).

表2 10批金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉紫外指紋圖譜A值

3.2.8 試驗(yàn)驗(yàn)證

另取5批(JYH11～JYH15)金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉，按照“3.2.1”項(xiàng)下方法制備的供試品，按“3.2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，得紫外指紋圖譜，將吸光度于“IBM SPSS statistics”中雙變量相關(guān)“Kendall’s tau-b”進(jìn)行相似度分析，可得其紫外指紋圖譜相似度和A值均滿足范圍要求.

3.3 金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉的紅外指紋圖譜分析

3.3.1 供試品溶液制備

精密稱取金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密移取50 mL純凈水，稱重，超聲30 min冷卻后稱重，純凈水補(bǔ)足重量.精密移取30 μL所制溶液，放于瑪瑙研缽中，使用吹風(fēng)機(jī)將其烘干，按1∶100和干燥KBr 粉末研磨混勻，在15 MPa真空環(huán)境中下壓片1 min，得待測(cè)樣品.

3.3.2 光譜掃描條件

掃描前已排除H2O和CO2的干擾，減小試驗(yàn)誤差.按“3.3.1”項(xiàng)下方法制備的供試透明薄片放入傅里葉變換紅外光譜儀中掃描測(cè)驗(yàn)，掃描范圍為4 000～450 cm-1.

3.3.3 方法學(xué)考察

按“3.3.1”項(xiàng)下方法精密稱取金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品凍干粉(JYH9)，制備供試品，按“3.3.2”項(xiàng)下條件連續(xù)測(cè)定6次，得紅外圖譜，取圖譜中強(qiáng)吸收峰的10個(gè)對(duì)應(yīng)波數(shù)作為特征峰波數(shù)，計(jì)算特征峰波數(shù)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果顯示各特征峰波數(shù)值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.1%，故知該儀器精密度良好.按照“3.3.1”項(xiàng)下方法精密稱取金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品凍干粉(JYH9)，平行制備供試品6份，按“3.3.2”項(xiàng)下條件測(cè)定紅外光譜圖，計(jì)算特征峰波數(shù)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果顯示平均含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.1%，故供試品制備方法與測(cè)定方法的重復(fù)性均良好.按“3.3.1”項(xiàng)下方法精密稱取金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品凍干粉(JYH9)后分別在0、1、2、3、4及5 h 按“3.3.2”項(xiàng)下條件掃描供試品，計(jì)算特征峰波數(shù)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果顯示各峰波數(shù)值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.1%，故樣品在制得后5 h內(nèi)穩(wěn)定.

3.4 金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉的物理指紋圖譜分析

3.4.1 金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉物理參數(shù)的確定

采用穩(wěn)定性、流動(dòng)性、堆積性和可壓性作為金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑物理指紋譜的一級(jí)指標(biāo)，以松密度(Da)、振實(shí)密度(Dc)、休止角(α)、干燥失重(HR)、吸濕性(H)、豪斯納比(IH)、顆粒間空隙率(Ie)和卡爾指數(shù)(IC)作為二級(jí)指標(biāo).

1)松密度(Da)：稱8.0 g(w)待測(cè)粉末緩緩加至干燥潔凈的50 mL量筒中，記下待測(cè)粉末體積Va，Da=w/Va；

2)振實(shí)密度(Dc)：將上述盛有待測(cè)粉末的量筒以2s/次的頻率上下振動(dòng)200次，記下待測(cè)粉末的體積Vc，Dc=w/Vc；

3)休止角(α)：固定串聯(lián)漏斗使其距離水平面2.2 cm，緩慢將粉末倒入漏斗中.當(dāng)粉末的頂尖與漏斗的頂尖相接觸時(shí)停止，測(cè)量底部圓形堆積體半徑r，α=arctan(h/r)；

4)干燥失重(HR)：使用快速水分測(cè)定儀，稱取約 2.0 g 的待測(cè)粉末，在105 ℃下加熱10 min，記下失水率；

5)吸濕性(H)：將干燥蒸發(fā)皿放于恒溫干燥器(下部放置飽和氯化鈉溶液)，12 h后精密稱定質(zhì)量m，稱取約1.0 g待測(cè)粉末平鋪于上述蒸發(fā)皿中，精密稱定質(zhì)量m2，將蒸發(fā)皿放于上述恒溫恒濕的條件下，24 h后精密稱定質(zhì)量m3，H=(m3-m2)/(m2-m1)；

6)豪斯納比(IH)：IH=Dc/Da；

7)顆粒間空隙率(Ie)：Ie=(Dc-Da)/(Da×Dc)；

8)卡爾指數(shù)(IC)：IC=(Dc-Da)/Dc.

3.4.2 物理質(zhì)量指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換

便于分析，將實(shí)際測(cè)定值轉(zhuǎn)換至同一尺度，即0～10.標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換方法及各物理質(zhì)量指標(biāo)的可能數(shù)值范圍參考藥典標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn)方法[6].標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換方法及轉(zhuǎn)換值范圍如表3所示.

表3 二級(jí)物理質(zhì)量指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換方法及轉(zhuǎn)換值范圍

3.4.3 金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉物理指紋圖譜的構(gòu)建

按照“3.4.1”項(xiàng)下指標(biāo)，測(cè)得10批金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉的8個(gè)物理常數(shù)數(shù)值，對(duì)數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化，如表4所示.以10批金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉的各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化參數(shù)值為半徑繪制雷達(dá)圖，并取參數(shù)值的平均值為半徑繪制物理對(duì)照指紋譜雷達(dá)圖，結(jié)果如圖4所示.

表4 金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉物理指紋譜相關(guān)指標(biāo)值

3.4.4 相似度分析

采用“IBM SPSS statistics”中夾角余弦方法，對(duì)10批金銀花凍干粉的物理指紋圖譜與物理對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行分析，相似度分別為1.000、0.929、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、0.982及0.982，表明相似度顯著.

3.4.5 試驗(yàn)驗(yàn)證

取余下5批金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉，按照“3.4.1”項(xiàng)下指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定并建立物理指紋圖譜，采用“IBM SPSS statistics”中夾角余弦方法與其物理對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，符合指標(biāo)要求.

4 討 論

本研究從HPLC、紫外、紅外及物理指紋圖譜4個(gè)方面對(duì)金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立進(jìn)行了探討.結(jié)果表明：紫外、紅外指紋圖譜相似度顯著，但仍存在一定差異，有不穩(wěn)定的現(xiàn)象，與綠原酸熱敏度有關(guān)；HPLC指紋圖譜的7個(gè)共有峰可反映其指紋特征[7-8]；15批金銀花標(biāo)準(zhǔn)湯劑物理指紋圖譜表現(xiàn)為相關(guān)性顯著,主要是由于中藥浸膏粉末的粉體學(xué)性質(zhì)直接影響到制粒質(zhì)量[9-10]，標(biāo)準(zhǔn)湯劑為配方顆粒的基準(zhǔn)，所以采用其物理指紋圖譜為配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考.

目前大多數(shù)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究為HPLC指紋圖譜，很少從其他指紋圖譜方面進(jìn)行考察.本研究解決了常規(guī)配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立只采用HPLC指紋圖譜與含量測(cè)定方法的單一化問題，增加采用了紫外、紅外及物理指紋圖譜方法，為配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供了更有效的支撐.

據(jù)文獻(xiàn)[3]提出的相關(guān)出膏率及轉(zhuǎn)移率指標(biāo)范圍對(duì)本研究相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，得出膏率范圍為22.74%～42.22%，且每1 g含綠原酸為23.10～42.90 mg.據(jù)文獻(xiàn)[11]給出的金銀花配方顆粒出膏率范圍為24.00%～33.00%，但每1g含綠原酸為23.00～55.00 mg，其轉(zhuǎn)移率在給定范圍內(nèi)，出膏率范圍卻比給定范圍大.為此得出，如何獲得金銀花配方顆粒的最佳制備工藝參數(shù)，將是下一步的研究方向.