何家林，周楊楊，程 強，羿國娟，陳 勇，魯 蘭

(成都大學 四川抗菌素工業(yè)研究所，四川 成都 610052)

0 引 言

隨著抗生素的濫用，細菌耐藥性問題日益嚴重.銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，Pa)是外傷感染最常見致病菌，毒力強并易產(chǎn)生耐藥性[1-2].細菌通過運動黏附在體內(nèi)細胞發(fā)生定植，進而發(fā)生感染，和致病性息息相關(guān)，而細菌生物被膜的產(chǎn)生，可以阻止抗生素的進入，使產(chǎn)生生物被膜的菌株比浮游菌的耐藥性提高100～1 000倍，是產(chǎn)生耐藥性的重要途徑，也是導致院內(nèi)長期和反復感染的重要原因之一[3-8].目前，中藥及天然產(chǎn)物在抗菌藥物的研發(fā)領域越來越受到關(guān)注，成為發(fā)現(xiàn)新型抗菌藥物的重要方向[9-10].然而，具有抗菌作用的中藥在體內(nèi)由于其吸收、分布和代謝過程，往往難以達到其直接抗菌的有效濃度，多數(shù)以亞抑菌濃度(Sub-Minimum inhibitory concentration，Sub-MIC)發(fā)揮其作用.Sub-MIC抗菌藥物雖不能直接抑制細菌，但可影響細菌耐藥、黏附與運動等生物學效應.四季青為冬青科植物冬青的干燥葉，性涼、味苦且微澀，功效為清熱解毒、生肌斂瘡及活血止血，臨床上常以單味藥材水煎液外用，治療燒燙傷效果特佳[11-12].本研究以臨床收集的常見致病菌株為對象，對四季青水煎液的抗菌活性進行評價，并對Sub-MIC四季青水煎液抑制銅綠假單胞菌運動和生物被膜形成的能力及消除生物被膜的量-效關(guān)系進行探討，為四季青臨床抗感染治療提供了理論基礎和參考.

1 材料與儀器

1.1 材 料

四季青葉(冬青科植物冬青Ilex chinensis Sims的干燥葉，經(jīng)四川抗菌素工業(yè)研究所抗生素藥效評價中心按中國藥典2015版一部鑒別，經(jīng)測定含原兒茶酸0.176%、綠原酸0.056%及槲皮素0.008%，對實驗銅綠假單胞菌最低抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration,MIC)為100 mg/mL)，購自廣西亳州市君源堂藥材站；臨床分離致病菌株：金黃色葡萄球菌(MSSA)5株、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)5株、產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌(KE+)5株、大腸桿菌(KE-)5株、銅綠假單胞菌(Pa)5株，均由四川抗菌素工業(yè)研究所提供；質(zhì)控菌株：金黃色葡萄球菌ATCC 29213、大腸桿菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853，購自美國標準菌種收藏所(American type culture collection,ATCC)；MH(A)培養(yǎng)基(批號，20180602)，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；胰酪大豆瓊脂培養(yǎng)基TSA(批號，7053894)，購自美國BD公司；胰蛋白胨(批號，201901-002)，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；酵母浸出粉，購自成都市科龍化工試劑廠；瓊脂粉(批號，180201)，購自北京博奧拓達科技有限公司；營養(yǎng)肉湯NB(批號，201902-013)，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；美羅培南(批號，181003)，購自海口市制藥廠有限公司；二甲基亞砜DMSO(批號，20130701)，購自成都市科龍化工試劑廠；氯化鈉(批號，2019022101)，購自成都科隆化學品有限公司；生理鹽水(批號，M0040806C)，購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司；25%戊二醛(批號，20181101)，購自成都市科龍化工試劑廠；結(jié)晶紫(批號，602w041)，購自北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇(批號，2018051301)，購自成都市科龍化工試劑廠；無菌96孔板(批號，010617A005，規(guī)格，12×8孔)，購自NEST公司；麥氏比濁管(批號，075870)，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司.

1.2 儀 器

Multiskan FC型酶標儀(賽默飛世爾上海儀器有限公司)，ZHWY-100B恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)，GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設備有限公司)，Sartorius BS124S型電子天平(德國Sartorius公司).

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液與平板制備

2.1.1 四季青水煎液制備

稱取干燥四季青葉30 g，用潔凈紗布包好置于砂鍋內(nèi)，加蒸餾水500 mL，浸泡30 min，武火100 ℃煎煮15 min，轉(zhuǎn)文火100 ℃繼續(xù)煎煮30 min，倒出藥液(約50 mL)，再加500 mL蒸餾水.按上述方法煎制，將2次藥液(約100 mL)合并后100 ℃濃縮30 min至10 mL，其濃度相當于生藥量3 000 mg/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用.

2.1.2 培養(yǎng)平板與培養(yǎng)液制備

TSA平板：稱取TSA培養(yǎng)基4 g，加蒸餾水100 mL,使其溶解后，121 ℃高壓滅菌30 min，備用.

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨4 g，酵母浸出粉2 g，氯化鈉4 g，加蒸餾水400 mL，調(diào)pH值至7.0，121 ℃高壓滅菌30 min，備用.

浮泳運動培養(yǎng)基：稱胰蛋白胨3 g，氯化鈉3 g，瓊脂1.5 g，加300 mL蒸餾水，攪勻，121 ℃高壓滅菌30 min，50 ℃水浴保溫備用.

蹭行運動培養(yǎng)基：稱胰蛋白胨3 g，酵母浸出粉1.5 g，氯化鈉3 g，瓊脂3 g，加300 mL蒸餾水，攪勻，121 ℃高壓滅菌30 min，50 ℃水浴保溫備用.

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：稱取營養(yǎng)肉湯NB培養(yǎng)基1.8 g，加蒸餾水100 mL，121 ℃高壓滅菌30 min，備用.

2.2 四季青水煎液的體外抗菌活性

采用美國臨床實驗室標準化委員會(Clinical and laboratory standards institute,CLSI)瓊脂二倍稀釋法進行MIC測定.取3 000 mg/mL四季青水煎液，按二倍稀釋法使其在3 000～46.87 mg/mL范圍內(nèi).實驗同時設置美羅培南陽性對照組和菌液對照組進行質(zhì)控.

無菌平皿內(nèi)分別加入不同濃度四季青水煎液各1 mL，再加入融化的50 ℃ MH(A)培養(yǎng)基14 mL，混勻，按二倍稀釋法使每平皿內(nèi)所含藥物濃度依次為200、100、50.0、25.0、12.5、6.25、3.12 mg/mL，待冷卻后用多點接種儀分別接種不同菌液，菌液濃度為106CFU/mL，于35 ℃ 培養(yǎng)18～20 h，平皿內(nèi)未見細菌生長的最低藥物濃度(即最低抑菌濃度MIC).結(jié)果表明，四季青葉水煎液對金黃色葡萄球菌MSSA和MRSA的抗菌活性最強，均為6.25 mg/mL，而對大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抗菌活性相對較弱，如表1所示.由此可見，四季青抗銅綠假單胞菌的MIC值較大，由于藥物的吸收代謝等過程，在體內(nèi)難以達到MIC值，基本是以Sub-MIC存在，所以難以發(fā)揮直接的抗菌作用.因此，有必要研究其Sub-MIC對銅綠假單胞菌其他方面的影響.

表1 四季青水煎液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌的MICR(n=5)

2.3 Sub-MIC四季青水煎液對銅綠假單胞菌運動能力的影響

2.3.1 浮泳運動

取銅綠假單胞菌于TSA平板上復蘇過夜，挑取單個菌落溶于無菌生理鹽水，調(diào)至5.0麥氏比濁度，用LB培養(yǎng)基稀釋10倍后于37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)20 h，備用.用浮泳運動培養(yǎng)基和四季青水煎液混合，按二倍稀釋法分別制成含藥量為100、50.0、25.0、12.5、6.25 mg/mL(相當于1×MIC、1/2×MIC、1/4×MIC、1/8×MIC、1/16×MIC)的浮泳運動平板，同時制備空白對照.取上述靜置培養(yǎng)20 h后的銅綠假單胞菌培養(yǎng)液1 μL接種于培養(yǎng)基的表面，37 ℃正置培養(yǎng)18 h，用游標卡尺測定其生長直徑.

四季青水煎液對銅綠假單胞菌浮泳運動的抑制能力如表2與圖1所示.在四季青水煎液濃度為50 mg/mL和25 mg/mL(1/2×MIC和1/4×MIC)時，其菌落生長直徑與空白對照組比較有顯著性差異(P<0.01)，對細菌浮泳運動有較好的抑制作用.

表2 Sub-MIC四季青水煎液對銅綠假單胞菌浮泳運動的影響(n=6)

2.3.2 蹭行運動

取銅綠假單胞菌于TSA平板上復蘇過夜，挑取單個菌落溶于無菌生理鹽水，調(diào)至5.0麥氏比濁度，用LB培養(yǎng)基稀釋10倍后于37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)20 h，備用.用蹭行運動培養(yǎng)基和四季青水煎液混合，按二倍稀釋法分別制成含藥量為100、50.0、25.0、12.5、6.25 mg/mL(相當于1×MIC、1/2×MIC、1/4×MIC、1/8×MIC、1/16×MIC)的蹭行運動平板，同時制備空白對照.取上述靜置培養(yǎng)20 h后的銅綠假單胞菌培養(yǎng)液1 μL接種于培養(yǎng)基底部與培養(yǎng)皿接觸的地方，37 ℃正置培養(yǎng)18 h，游標卡尺測定其生長直徑.

四季青水煎液對銅綠假單胞菌蹭行運動的抑制能力如表3與圖2所示.在四季青水煎液濃度為50 mg/mL和25 mg/mL(1/2×MIC和1/4×MIC)時，其菌落生長直徑與空白對照組比較有顯著性差異(P<0.01)，對細菌蹭行運動有較好的抑制作用.

表3 Sub-MIC四季青水煎液對銅綠假單胞菌蹭行運動的影響(n=6)

2.4 Sub-MIC四季青水煎液對銅綠假單胞菌生物被膜的作用

取銅綠假單胞菌于TSA平板上復蘇過夜，挑取單個菌落溶于無菌生理鹽水，調(diào)至1.0麥氏比濁度，用營養(yǎng)肉湯稀釋20倍后備用.

取1套96孔板，于第2～10列，每列第2行起6個復孔中，分別加入備用的菌液200 μL，置37 ℃恒溫培養(yǎng)3 d 后取出，倒掉剩余培養(yǎng)液，用無菌生理鹽水小心洗滌2次；于第2～9列中分別加入四季青水煎液濃度為100、50.0、25.0、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78 mg/mL(分別相當于1×MIC、1/2×MIC、1/4×MIC、1/8×MIC、1/16×MIC、1/32×MIC、1/64×MIC、1/128×MIC)的營養(yǎng)肉湯液200 μL；第10列為不含四季青水煎液的空白對照，每列6個復孔，其余孔中分別加入無菌生理鹽水200 μL，置37 ℃恒溫培養(yǎng)72 h后取出，用無菌生理鹽水小心洗滌2次，加入2.5%戊二醛280 μL后固定20 min，用生理鹽水洗滌2次，加入2%結(jié)晶紫溶液280 μL染色10 min，再用無菌生理鹽水緩慢洗去多余結(jié)晶紫，加入200 μL無水乙醇溶解，酶標儀測定570 nm處OD值.

四季青水煎液對銅綠假單胞菌生物被膜72 h的消除作用如表4與圖3所示.四季青水煎液在濃度為100、50.0、25.0、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78 mg/mL(分別相當于1×MIC、1/2×MIC、1/4×MIC、1/8×MIC、1/16×MIC、1/32×MIC、1/64×MIC、1/128×MIC)時，與空白對照組比較，在100～6.25 mg/mL(1～1/16MIC)濃度范圍，各組均有顯著性差異(P<0.05或P<0.01).

2.5 Sub-MIC四季青水煎液消除銅綠假單胞菌生物被膜作用的量-效關(guān)系

根據(jù)四季青水煎液對銅綠假單胞菌生物被膜消除的有效劑量(1×MIC～1/16×MIC)和消除率，采用PKSolver 2.0軟件SigmodEmaxPD模型，分別用2種基本S曲線模型對有效實驗數(shù)據(jù)進行擬合，獲得相關(guān)參數(shù)為：SigmoidEmaxModel(模型1)AIC值為33.84，R2值為0.97；SigmoidEmaxModel withE0(模型2)AIC值為31.12，R2值為0.99.根據(jù)擬合優(yōu)度，選擇SigmoidEmaxModel withE0(模型2)進行擬合，結(jié)果如表5、表6和圖4所示.其中，Emax為52.20%，EC50為7.02 mg/mL，E0為12.69%，擬合式為，

(1)

表5 Sub-MIC四季青水煎液對銅綠假單胞菌生物被膜消除率

表6 Sub-MIC四季青水煎液消除生物被膜作用的PD參數(shù)

3 討 論

四季青水煎液在1×MIC濃度時，浮泳運動和蹭行運動平板中均未見菌落生長，這與在該濃度下四季青水煎液已經(jīng)能完全抑制細菌的生長一致.四季青水煎液在1/2×MIC的Sub-MIC下，浮泳運動和蹭行運動平板中雖然有菌群生長，但菌群生長直徑較空白對照組比較均有明顯減小(P<0.05或P<0.01)，表明在此Sub-MIC下四季青水煎液雖未對銅綠假單胞菌的生長產(chǎn)生明顯的抑制作用，但能使銅綠假單胞菌的運動能力受到明顯抑制.由于細菌的擴散力和侵襲力主要是由細菌的鞭毛運動產(chǎn)生，其受到抑制時將直接影響細菌的定植，進而影響到生物被膜形成過程中細菌的黏附和生物被膜的形成[13-14].四季青水煎液對銅綠假單胞菌生物被膜在72 h時具有較強的消除作用，但由于該項操作是在已經(jīng)生成的生物被膜中加入四季青水煎液后進行的，而中途也需要更換新鮮的培養(yǎng)液，導致短時間(0～24 h)內(nèi)殘留的細菌得以繼續(xù)產(chǎn)生生物被膜，直至24 h時生物被膜生成量才開始下降，因此，為克服細菌生物被膜自身生長規(guī)律的影響，本實驗選擇24 h時生物被膜OD值作為基準，以24 h為起點開始觀察，并獲得相應的Emax、EC50、E0及γ等參數(shù).實驗結(jié)果表明，四季青水煎液在1×MIC～1/16×MIC下能消除已生成的生物被膜并具有一定的量-效關(guān)系.綜上所示，四季青在Sub-MIC下能抑制銅綠假單胞菌的運動能力和生物被膜的生成，從而降低細菌的致病性和耐藥性，能夠被人體正常免疫系統(tǒng)清除，從而達到治療感染的效果，這與中藥主治未病且以調(diào)理為主的理論相吻合.四季青在Sub-MIC消除生物被膜的量-效關(guān)系也為其治療臨床感染的劑量選擇提供了理論依據(jù).