胡一冰，羅 虹，潘春暉，王璐瑤，先文杰，閆博文，張文慧,徐玉玲

(1.成都大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 610106；2.成都大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106;3.四川德成動物保健品有限公司，四川 德陽 618100)

0 引 言

六味地黃系列制劑(Liuwei Dihuang series preparations，LDSP)由熟地黃等3味補(bǔ)藥及澤瀉等3味瀉藥組成，為傳統(tǒng)滋陰補(bǔ)腎的名方劑，以此為基礎(chǔ)開發(fā)的多種劑型中成藥廣泛用于臨床中，有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降低血糖及抗腫瘤等多種藥理效應(yīng)[1-2].

目前各級標(biāo)準(zhǔn)中收載的六味地黃制劑有包括膠囊在內(nèi)的11種劑型，臨床應(yīng)用主要以丸劑(大蜜丸、濃縮丸)、膠囊劑(膠囊、軟膠囊)、顆粒劑及口服液為主，這些劑型雖然處方相同，但生產(chǎn)工藝有異，所含的物質(zhì)基礎(chǔ)可能有較大的區(qū)別，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與控制水平也參差不齊.紫外、紅外及近紅外光譜法分別是在確定中藥化學(xué)成分、反映中藥中具有不飽和化學(xué)鍵及其共軛體系基本物質(zhì)的吸收情況、反映中藥中多種化合物成分飽和鍵的吸收、確定該中藥中各種化學(xué)基團(tuán)的基礎(chǔ)上，對中藥整體進(jìn)行質(zhì)量控制研究.本研究建立統(tǒng)一的紫外、近紅外及紅外光譜研究方法，對LDSP的質(zhì)量進(jìn)行整體評價，以期對其質(zhì)量控制提供參考.

1 儀器與材料

1.1 儀 器

TU-1810PC型紫外可見分光光度儀(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；Spectrum Two 型傅里葉變換紅外光譜儀(美國Perkin Elmer公司)；FA2004型分析電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；NIR Magic3500型近紅外光譜分析儀(北京偉創(chuàng)英圖科技有限公司)；PS-40型超聲波清洗器(深圳得康清潔設(shè)備有限公司).

1.2 材 料

水為實驗用純凈水；乙酸乙酯、甲醇、石油醚及二甲苯均為分析純，購自成都市科隆化學(xué)品有限公司；六味地黃丸(批號17012482、17011166、17012473，編號 S1、S2、S3),六味地黃(濃縮丸)(批號18073459、18074529、18071341，編號 S4、S5、S6),六味地黃軟膠囊(批號18170316、18170314、18170319，編號 S7、S8、S9),購自北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司；六味地黃膠囊(批號20180516、20170621、20171014，編號 S10、S11、S12),購自修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；六味地黃顆粒(批號20170604、20170607、20171001，編號 S13、S14、S15),購自保和堂制藥有限公司；六味地黃口服液(批號170803、180106、170801，編號 S16、S17、S18),購自黃山市天目藥業(yè)有限公司.

2 方法與結(jié)果

2.1 LDSP紫外光譜研究[3-6]

2.1.1 光譜掃描條件

以水為空白調(diào)零，扣除基底影響；光譜寬帶為2.00 nm,掃描范圍為200.00～800.00 nm,光度模式為Abs，掃描間隔為1.0 nm，掃描速度為快.

2.1.2 供試品溶液制備

1)六味地黃丸供試品溶液制備.取樣品S1、S2、S3適量，剪碎，按照相同生藥量各取2.4 g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，分別加入水25 mL，精密移取，密塞，超聲提取(30 ℃，300 W,50 Hz)30 min，放冷，搖勻，抽濾，取濾渣重復(fù)上述操作，合并此2次續(xù)濾液，并取適量用0.45 μm微孔濾膜，精密移取1 mL續(xù)濾液置于50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，即得稀釋50倍的供試品溶液；分別取上述生藥量下六味地黃丸(濃縮丸)、六味地黃膠囊及六味地黃顆粒，同上述方法操作，制得供試品溶液.

2)六味地黃軟膠囊供試品溶液制備.取樣品S7、S8、S9內(nèi)容物，按照六味地黃處方生藥量相同，各取0.62 g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，加入石油醚(30～60 ℃)30 mL，加熱回流1 h，50 ℃，放冷，傾去石油醚液，然后，照上述六味地黃丸供試品溶液制備方法分別加入水25 mL并繼續(xù)同法操作.

3)六味地黃口服液供試品溶液制備.取樣品S16、S17、S18，按照六味地黃處方生藥量相同，各取2.7 mL,精密移取，分別置于具塞錐形瓶中，分別加入水22.29 mL，搖勻，然后照上述六味地黃丸供試品溶液制備方法抽濾并繼續(xù)同法操作.

2.1.3 方法學(xué)考察

1)精密度實驗.按“2.1.2”項下各制備同一供試品溶液(S1、S4、S7、S10、S13及S16)，按“2.1.1”項下掃描條件各連續(xù)掃描6次.結(jié)果顯示，300、290、277、249、240及230 nm處吸光度RSD均小于0.13%，表明儀器精密度良好.

2)穩(wěn)定性實驗.按“2.1.2”項下各制備同一供試品溶液(S1、S4、S7、S10、S13及S16)，各分別于0、1、2、3、4及5 h，按“2.1.1”項下掃描條件進(jìn)行掃描.結(jié)果顯示，300、290、277、249、240及230 nm處吸光度RSD均小于2.50%，表明供試品在5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

3)重復(fù)性實驗.各取同一批次樣品(S1、S4、S7、S10、S13及S16)，按“2.1.2”項下方法各平行制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項下掃描條件進(jìn)行掃描.結(jié)果顯示，300、290、277、249、240及230 nm處吸光度RSD均小于2.50%，表明該方法重復(fù)性良好.

2.1.4 紫外光譜采集

取“2.1.2”項下按照生藥量相同制備的LDSP樣品，按“2.1.1”項下掃描條件進(jìn)行掃描，其紫外可見光譜疊加圖如圖1所示.由圖1可知，LDSP在249 nm(波谷)與277 nm(波峰)都有強(qiáng)吸收，LDSP的吸光度整體值大小依次為大蜜丸、顆粒、濃縮丸、口服液、膠囊及軟膠囊.

2.1.5 紫外對照光譜建立

將測得的不同制劑不同批次紫外圖譜各波長下的吸光度取平均值，并以平均值建立對照光譜.

2.1.6 紫外光譜相似度分析

對6種制劑各3批樣品的紫外對照光譜進(jìn)行相似度分析，經(jīng)數(shù)據(jù)處理軟件IBM SPSS statistics中雙變量相關(guān)“Kendall’s tau-b”分析計算相似度，如表1所示.分析結(jié)果顯示，LDSP紫外對照光譜顯著相關(guān)，相似度在0.833～0.985之間，其中大蜜丸和口服液相似度最高，而膠囊和軟膠囊相似度最低(即為0.833)，表明LDSP間物質(zhì)基礎(chǔ)在200～400 nm吸收相似.

表1 LDSP紫外對照光譜相似度分析

2.2 LDSP紅外光譜研究[7-9]

2.2.1 供試品溶液制備

1)六味地黃丸供試品溶液制備.取樣品S1、S2及S3適量，剪碎，按照相同生藥量各取1 g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，分別加入水25 mL，精密移取，密塞，超聲提取(30 ℃，300 W,50 Hz)30 min，放冷，搖勻，置高速離心機(jī)中離心(5 000 r/min)10 min，取上清液,用0.45 μm微孔濾膜濾過，用平頭微量進(jìn)樣針移取20 μL續(xù)濾液于瑪瑙研缽中，揮干，加入0.1 g干燥KBr，沿同一方向研磨均勻，取適量研細(xì)后的粉末平鋪于紅外壓片磨具中，以10 MPa壓力壓制2 min，將制備好的樣品置于紅外光譜儀中測定，掃描范圍為400～4 000 cm-1；分別取上述生藥量下六味地黃丸(濃縮丸)、六味地黃膠囊及六味地黃顆粒，同上述方法操作，制得供試品溶液.

2)六味地黃軟膠囊供試品溶液制備.取樣品S7、S8及S9內(nèi)容物，按照六味地黃處方生藥量相同各取0.2 g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，加入石油醚(30～60 ℃)30 mL，加熱回流1 h，50 ℃，放冷，傾去石油醚液，然后照上述六味地黃丸供試品溶液制備方法分別加入水25 mL并繼續(xù)同法操作.

3)六味地黃口服液供試品溶液制備.取樣品S16、S17及S18，按照六味地黃處方生藥量相同各取1.11 mL,精密移取，分別置于具塞錐形瓶中，加入水23.89 mL，精密移取，搖勻，照上述六味地黃丸供試品溶液制備方法置高速離心機(jī)中并繼續(xù)同法操作.

2.2.2 方法學(xué)考察

1)精密度實驗.取同一供試品溶液(S1、S4、S7、S10、S13及S16)，按“2.2.1”項下的方法壓片，各連續(xù)測定6次，計算所得紅外光譜中各特征峰波數(shù)的RSD均小于0.79%，表明儀器精密度良好.

2)穩(wěn)定性實驗.取同一供試品溶液(S1、S4、S7、S10、S13及S16)，按“2.2.1”項下的方法壓片，各置于干燥器中保存，分別于0、1、2、3、4及5 h時掃描，計算所得紅外光譜中各特征峰的波數(shù)的RSD均小于2.21%，表明供試品在5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

3)重復(fù)性實驗.取同一供試品溶液(S1、S4、S7、S10、S13及S16)，按“2.2.1”項下的方法，各平行壓制6片，測定，計算所得紅外光譜中各特征峰波數(shù)的RSD均小于2.73%，表明該方法重復(fù)性良好.

2.2.3 紅外光譜建立

將“2.2.1”項下方法制備的供試品，進(jìn)行壓片并分別測定，LDSP樣品(各3批)的紅外光譜疊加圖如圖2所示.對6種制劑各3批樣品的紅外對照光譜進(jìn)行相似度分析，經(jīng)數(shù)據(jù)處理軟件IBM SPSS statistics中雙變量相關(guān)“Kendall’s tau-b”分析計算相似度，如表2所示.

表2 LDSP紅外對照光譜相似度分析

分析結(jié)果顯示：六味地黃紅外光譜圖的特征為在3 380、1 620及1 029 cm-1左右均有3個峰，且對各制劑，峰形均相似，第1個峰為大鈍峰，后2個峰強(qiáng)度較前者小，較銳；大蜜丸、顆粒、濃縮丸、軟膠囊及口服液在2 931、1 384及580 cm-1附近也都有峰，各圖峰形彼此相似，且在1 029 cm-1強(qiáng)峰的左側(cè)依次有2個肩峰，右側(cè)有1個肩峰，峰相對強(qiáng)度不同，膠囊無；大蜜丸與顆粒在829 cm-1左右有至少2個小峰，呈肩峰狀，且與其他制劑峰形不同.由圖2可知，各制劑所含峰的相對強(qiáng)度不同，大蜜丸和顆粒相對較強(qiáng)，濃縮丸、軟膠囊及口服液次之，膠囊相對較弱，表明LDSP間物質(zhì)分子的特性存在不同且質(zhì)量也存在差異.

相似度分析中，LDSP紅外對照光譜相似度在0.309～0.887之間，其中大蜜丸和顆粒相似度最高，大蜜丸和膠囊最低(即為0.309)，大蜜丸與顆粒、濃縮丸具有極顯著相關(guān)，與軟膠囊具有顯著相關(guān)，與口服液、膠囊為負(fù)相關(guān).由此可知，LDSP間物質(zhì)基礎(chǔ)存在差異.

2.3 LDSP近紅外光譜研究[10-11]

2.3.1 近紅外光譜采集

近紅外光譜分析儀開機(jī)預(yù)熱30 min后，將LDSP(除口服液3批)直接放入樣品杯中，進(jìn)行掃描.掃描條件設(shè)置為：掃描次數(shù)32次，范圍為900～1 800 cm-1,以儀器內(nèi)置背景為參比.5種制劑樣品的近紅外疊加圖譜如圖3所示.經(jīng)數(shù)據(jù)處理軟件IBM SPSS statistics中雙變量相關(guān)“Kendall’s tau-b”分析計算相似度，結(jié)果見表3.

表3 5種制劑近紅外對照光譜相似度分析

由圖3與圖4可得，LDSP(除口服液外)在1 200、1 315、1 460、1 530、1 570、1 660及1 720 nm處都有吸收，但峰的相對強(qiáng)度和峰形有差異.其中，在1 200 nm處，軟膠囊峰的相對強(qiáng)度較其他4種制劑強(qiáng)，且峰形也不同；在1 720 nm處，軟膠囊、大蜜丸及顆粒峰的相對強(qiáng)度較濃縮丸和膠囊的強(qiáng)，前三者峰形基本相同，后兩者峰形基本相同，且前三者和后兩者峰形不同；在1 315、1 460、1 530、1 570及1 660 nm處5種制劑的峰形基本相同，但各制劑峰相對強(qiáng)度不同，大致為大蜜丸、顆粒及軟膠囊較濃縮丸和膠囊強(qiáng).由表3知，5種制劑近紅外對照光譜相似度在0.401～0.898之間，其中大蜜丸和顆粒相似度最高；濃縮丸和軟膠囊最低(即為0.401)，大蜜丸與顆粒、軟膠囊呈極顯著相關(guān)，與濃縮丸和膠囊呈顯著相關(guān)，而軟膠囊只與顆粒、大蜜丸呈顯著相關(guān).由此說明，5種制劑物質(zhì)分子種類基本相同，但分子大小存在差異，質(zhì)量不同.

2.3.2 近紅外對照光譜建立

選擇單個制劑(除口服液)3批次，以其吸光度值的平均值為對照光譜的吸光度，得到對照近紅外光譜如圖4所示.

3 討 論

本研究建立紫外、紅外及近紅外光譜法來比較LDSP的質(zhì)量差異，結(jié)合相似度分析，能從整體上對LDSP進(jìn)行質(zhì)量評價，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供了參考.

本研究在近紅外光譜研究中曾考察過以水作為溶媒，將LDSP(各3批次)制備成溶液，進(jìn)行近紅外光譜掃描，結(jié)果LDSP樣品的近紅外光譜圖與水相同，表明水對其有干擾.結(jié)合近紅外光譜儀的自身特性，本研究采用直接掃描法對六味地黃系列制劑進(jìn)行近紅外分析.由于口服液劑型的工藝采用水作為溶媒，對口服液劑型的近紅外光譜有待進(jìn)一步研究，所以本研究在近紅外光譜中只比較其他5種劑型。