王鳳婷 張鑫生 潘洪玉 劉金亮

摘要?以小白菜、菠菜和生菜為實驗材料，研究改良研磨法與浸提法在葉綠素提取定量測定中的應用，分析不同提取時間對葉綠素提取效果的影響。結果表明，改良研磨法操作簡單、用時短、重復性好，且適用于不同植物材料，適合于大學生實驗教學。浸提法操作非常簡單、安全，只是實驗時間較長，同時提取速度受較多因素的影響。

關鍵詞?葉綠素，實驗教學，提取方法，蔬菜

中圖分類號?S-3文獻標識碼?A文章編號?0517-6611（2020）06-0001-03

Abstract?Using Chinese cabbage， spinach and lettuce as experimental materials， this paper studied the application of ?the improved grinding method and the extraction method in chlorophyll extraction， and analyzed the effects of different extraction time on the chlorophyll extraction.The results showed that the improved grinding method was simple to operate，took a shorter time， and the repeatability was good. It was suitable for different plant materials and suitable for experimental teaching. The extraction method was very simple， but it took a long time， and its extraction speed was affected by many factors.

Key words?Chlorophyll，Experimental teaching，Extraction method，Vegetables

葉綠素含量是植物生長發(fā)育的重要生理指標之一，其功能主要為吸收、傳遞光量子，進而影響 PSII、PSI之間能量的合成與轉換，影響凈光合速率，因此葉綠素含量與植物的光合作用、營養(yǎng)狀況、生理狀態(tài)等密切相關[1-2]。葉綠素含量無論是在品種選育還是植物抗性、生理狀態(tài)方面都是重要的研究指標[3-4]。

葉綠素含量的測定是高等院校農(nóng)學相關專業(yè)植物生理學課程的基礎實驗。目前關于不同植物葉綠素提取與含量測定的方法研究較多，常用的提取溶劑主要是乙醇、丙酮或二者的混合液，提取方法分為研磨和浸提2種。傳統(tǒng)的研磨方法是植物材料經(jīng)過研磨、過濾、定容后再進行比色測定，整個過程繁瑣、時間長，操作中還易受光氧化的破壞，導致誤差較大[5]。浸提法采用溶劑浸泡葉片的方法將葉綠素萃取出來，然后進行比色測定[6]。直接浸提法，雖然方法簡單易行，免除了研磨提取中的繁瑣手續(xù)，但不同植物葉綠體色素提取速度不同，最佳的提取時間和溫度要求也不同[7]。

為了培養(yǎng)與提高大學生的科研創(chuàng)新技能，在本科實驗教學中加大了設計性與綜合性實驗的比例，其中葉綠素的提取與測定是這類實驗中常涉及到的一項內(nèi)容。由于實驗項目內(nèi)容較多且學生操作技能不熟練，在有限的課堂時間內(nèi)難以完成。為簡化實驗教學步驟、節(jié)省時間、提高效率，篩選一個快速、無耗損且提取率高的實驗方法具有非常重要的意義。鑒于本科生實驗受管制的藥品較多（如丙酮、DMSO等），筆者選擇安全性高的乙醇試劑為提取液，通過測定葉菜類蔬菜小白菜、菠菜、生菜的葉綠素含量，探索出適合實驗教學的安全、高效、簡單易操作的葉綠素提取方法。

1?材料與方法

1.1?材料、試劑與主要儀器

供試材料為小白菜、菠菜和生菜，均為人工氣候室種植，新鮮度一致。試劑為分析純乙醇（95%）。主要儀器包括紫外可見分光光度計（UV2100）、高速冷凍離心機（eppendorf-AG）、萬分之一天平（ 梅德勒）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9082）、海爾冰箱。

1.2?提取方法

1.2.1?浸提法。

選取多片葉位一致的葉片，洗凈，用吸水紙吸凈葉片水分，避開主葉脈剪成2 mm 的細條，混勻后分別稱取細條0.2 g放入具塞試管中，加入95%乙醇提取液中浸提，加塞遮光。浸提時間分別為2、3、4、5、6、7和24 h，提取溫度分別為4、25和40 ℃。將提取液搖勻后分別于波長 665和 649 nm 下測定吸光度，重復3次。

由于葉綠素在不同溶劑中的吸收光譜有差異，因此，在使用不同溶劑提取色素時，計算公式也有不同。葉綠素a、b在95%乙醇中最大吸收峰的波長分別為665和649 nm，計算公式[8]：

組織中色素含量的計算（mg/g 鮮重）：

1.2.2?改進的研磨法。

選取多片葉位一致的葉片，洗凈，用吸水紙吸凈葉片水分，并剪成 2 mm 的細條，混勻后分別稱取細條0.2 g放入研缽中，加入少量 95%乙醇研磨提取，充分研磨后移入25 mL容量瓶中，用95%乙醇充分洗滌研缽和研棒，最后定容。提取液分別靜置10、20、30、40、50、60 mim后轉至離心管中離心5 min，轉速6 000 r/min，取上清進行定量分析。測定計算方法同“1.2.1”。

改進的研磨法是通過離心代替了傳統(tǒng)研磨法中的過濾步驟，縮短了時間，減少了葉綠素在提取過程中的降解[9]。

2?結果與分析

2.1?不同提取溫度和時間下葉綠素的浸泡提取

小白菜葉綠素40 ℃下提取時，發(fā)現(xiàn)浸提6 h后提取量無顯著差異，說明在40 ℃下提取6 h可達到較好的提取效果。在20 ℃和4 ℃下提取時，提取速度較慢，提取時間增加至24 h才能達到較好的效果。葉綠素b在40 ℃下提取浸提6 h后無顯著差異，20 ℃和4 ℃下提取7 h與24 h無顯著差異，這可能與葉綠素b的含量較少提取時間較短有關（圖1）。

菠菜葉綠素提取時，提取時間在2～7 h提取溫度高提取速度快，隨著提取時間的延長提取量逐漸增大，當提取時間達到24 h，不同溫度之間提取效果無顯著差異，均能提取完全。這說明短時間浸泡提取中，適當高溫可以增加葉綠素提取速度（圖2）。

生菜葉綠素提取時，不同提取溫度和時間下葉綠素提取量無顯著差異，不同溫度下提取7 h時均能達到較好的提取效果，但當提取時間長至24 h時，葉綠素含量有降低趨勢。表明溫度對生菜葉綠素提取速度影響不顯著，這可能與生菜的葉片薄、葉綠素含量少比較容易提取有關。當提取時間長至24 h時，不同提取溫度下的葉綠素含量均有下降，說明葉綠素有一定的降解（圖3）。

2.2?改進的研磨法提取葉綠素

研磨法提取3種蔬菜的葉綠素時，提取時間小于20 min時，葉綠素未提取完全，隨著提取時間的增加提取量逐漸增大，當提取時間在20～40 min時，葉綠素提取量無顯著差異，而當提取時間長于40 min后，提取量有下降趨勢，說明葉綠素有不同程度的降解。小白菜、菠菜和生菜的研磨提取中，由于葉片組織均被破碎，三者在提取時間上無差異（圖4～6）。

2.3?葉綠素2種提取方法的比較

采用乙醇浸泡提取和乙醇研磨提取2種方法分別對葉菜類蔬菜小白菜、菠菜和生菜葉片葉綠素進行了提取、測定分析。結果表明，小白菜葉綠素40 ℃下提取6 h可以達到較好的提取效果，若提取溫度較低，則需要延長提取時間，研磨法提取20 min則能充分提取，與40 ℃下浸泡提取6 h結果無顯著差異，均能達到較好的效果。

菠菜葉綠素在較短的浸泡提取時間內(nèi)不能充分提取，在4～40 ℃下提取時均需提取約24 h達到較好的效果，故提取時間較長，而研磨法提取僅需要研磨后靜置20 min即可達到好的提取效果，與浸泡提取的最大值無顯著差異。

生菜葉綠素浸泡提取時，溫度對其提取速度的影響不明顯，浸泡提取7 h測定值達到最大，研磨法提取同樣需研磨后靜置20 min，其測定值與浸泡提取最大值無差異。

綜合上述結果表明，乙醇在對葉菜類的葉綠素提取中，浸提法與研磨法均可取得良好效果，不同的是浸泡提取需要時間較長，不同的提取材料需要的適宜溫度與浸提時間不同，比較適宜于處理大量樣品，而研磨法則提取時間短，操作相對浸提法復雜，適宜處理少量樣品。

3?討論

通過對3種蔬菜葉綠素提取方法和時間的比較發(fā)現(xiàn)，浸泡提取葉綠素時，小白菜40 ℃下提取6 h測定量較高，提取較充分，菠菜在不高于40 ℃的溫度下提取時，提取時間增加至24 h才可以提取充分，生菜受溫度的影響不顯著，提取時間7 h提取量最高。因此，不同的植物材料采用浸提法提取葉綠素時，最佳的提取時間、提取溫度不同，這與徐瀾等[7]的研究結果一致，其發(fā)現(xiàn)小麥、冬青菠菜、油菜葉綠素的提取量最高時處理溫度分別為 40、40、60、50 ℃，處理時間分別為 36、12、1.5、4.5 h。

浸泡提取時，生菜葉綠素提取值在提取7 h后有下降趨勢，這可能與葉綠素的降解有關，而小白菜與菠菜提取時，由于提取速度較慢葉綠素的提取速率大于降解速率，故提取值無下降趨勢。這說明葉綠素提取充分以后，要盡快進行含量測定，以防葉綠素降解導致測定值偏小。同時也表明葉綠素提取速度除受溫度、時間影響外，還與樣品的結構有關。浸泡提取葉綠素的速度一定程度上還受處理樣品大小、提取液與樣品比例的影響，適當?shù)匕褬悠贩鬯榛蛟黾犹崛∫旱牧坑兄谔岣咛崛∷俣萚10-13]。

該研究中，用改進的研磨法對3種葉菜類蔬菜的葉綠素進行了測定，均表現(xiàn)出一致的變化趨勢，在研磨后靜置20～40 min時，葉綠素測定值較高，此時間內(nèi)葉綠素的降解較少，對測定值影響不顯著。此方法避免了傳統(tǒng)研磨法中的濾紙過濾速度慢、時間長、葉綠素受光氧化破壞使測定值偏低的缺點，具有快速、簡單、重復性好，不受樣品特性、溫度、時間、提取液與樣品比例等因素的影響，使用范圍較廣。

4?結論

2種葉綠素提取方法均采用乙醇為提取液，該試劑無毒、無腐蝕性，安全系數(shù)較高，比丙酮、甲醇、DMSO[14-15]等更適合用于本科生教學實驗。改進的研磨法操作簡單、用時短、重復性好，一個樣品完成實驗僅需0.5 h左右，而且適用于不同的植物材料，這大大節(jié)省了課堂時間。浸泡提取法操作十分簡單，只是實驗時間較長，同時提取速度受較多因素影響，在樣品較少、工作量不大時不宜使用。

參考文獻

[1] ZHOU X J，LIU Z G，XU S，et al.An automated comparative observation system for suninduced chlorophyll fluorescence of vegetation canopies[J].Sensors，2016，16（6）：1-15.

[2] RATTAN K J.Comparative analyses of physiological assays and chlorophyll a variable fluorescence parameters：Investigating the importance of phosphorus availability in oligotrophic and eutrophic freshwater systems[J].Aquatic ecology，2017，51（3）：359-375.

[3] PORRA R J.The chequered history of the development and use of simultaneous equations for the accurate determination of chlorophylls a and b[J].Photosynthesis research，2002，73（1/2/3）：149-156.

[4] 弗里德GH，黑德莫諾斯GJ.生物學[M].田青淶，殷瑩，馬洌，等譯.2版.北京：科學出版社，2002.

[5] 武衛(wèi)華，劉忠榮，黃先敏，等.葉綠體色素的提取方法改進及其應用[J].北方園藝，2010（24）：67-69.

[6] 徐新娟，李勇超，張尚攀，等.兩種葉綠素提取方法的比較[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2013，52（21）：5303-5304，5321.

[7] 徐瀾，許冰霞，張珺，等.不同材料葉綠素提取條件探究術[J].廣州化工，2017，45（9）：102-105.

[8] 李合生.植物生理生化實驗原理和技術[M].北京：高等教育出版社，2000.

[9] QIU N W，WANG X S，ZHOU F.A new method for fast extraction and determination of chlorophylls in natural water[J].Z Naturforsch（C），2018，73（1/2）：77-86.

[10] 吳興壯，張華，張曉黎，等.西蘭花葉葉綠素提取條件研究[J].農(nóng)業(yè)科技與裝備，2013（11）：57-59.

[11] 昌夢雨，魏曉楠，王秋悅，等.植物葉綠素含量不同提取方法的比較研究[J].中國農(nóng)學通報，2016，32（27）：177-180.

[12] HISCOX J D，ISRAELSTAM G F.A method for the extraction of chlorophyll from leaf tissue without maceration[J].Canadian journal of botany，1979，57（12）：1332-1334.

[13] 王琴，崔素萍，楊智明.鹽地堿蓬中葉綠素的提取研究[J].當代畜牧，2017（36）：57-59.

[14] ALPERT P.Analysis of chlorophyll content in mosses through extraction in DMSO[J].The bryologist，1984，87（4）：363-365.

[15] 徐敏，劉君，阿衣古力·阿布都瓦依提.植物生理實驗教學中葉綠素提取方法比較[J].實驗科學與技術，2018，16（4）：129-133.