文/復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院 編輯/清風(fēng)

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)之父威廉·奧斯勒醫(yī)生說：人類有三大敵人——發(fā)熱、饑餓及戰(zhàn)爭(zhēng)，其中發(fā)熱為三敵之首。盡管檢測(cè)手段和方法不斷進(jìn)步，不明原因發(fā)熱的診斷至今仍是常見而且重要的臨床難題之一。近日，國(guó)際權(quán)威學(xué)術(shù)期刊《自然》雜志發(fā)表了由中國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的一種全新原發(fā)性免疫缺陷病，該病可引起患者發(fā)熱和炎癥反應(yīng)。據(jù)悉，這是復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院臨床醫(yī)生和浙江大學(xué)及哈佛大學(xué)基礎(chǔ)研究科學(xué)家通力協(xié)作取得的研究成果，闡明了受體相互作用絲氨酸/蘇氨酸激酶1（RIPK1）基因突變，導(dǎo)致RIPK1無(wú)法被切割引起的炎癥和周期性發(fā)熱，并對(duì)這一基因突變?cè)谘装Y產(chǎn)生、細(xì)胞死亡等機(jī)制進(jìn)行了詳盡的研究，這也是人類首次發(fā)現(xiàn)這種類型的變異。本文通訊作者之一、復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院免疫科主任王曉川教授坦言，此項(xiàng)研究對(duì)于因免疫相關(guān)性疾病導(dǎo)致的不明原因發(fā)熱的患兒來說，將帶來全新的診治思路和有效診治方法。

兒科力量為免疫缺陷病基因圖譜新添一員

引起不明原因發(fā)熱的原因主要包括感染、腫瘤及免疫相關(guān)性疾病。隨著疾病譜的改變，免疫相關(guān)性疾病逐漸成為不明原因發(fā)熱的重要因素之一，王曉川教授團(tuán)隊(duì)表示，“已經(jīng)明確一些免疫相關(guān)性發(fā)熱與基因突變有關(guān)，也就是有著宿主出生免疫缺陷的基礎(chǔ)”。

隨著人類基因組學(xué)和免疫學(xué)知識(shí)的不斷完善，以及二代測(cè)序等技術(shù)手段的支撐，免疫相關(guān)性疾病在過去20多年中飛速發(fā)展?？茖W(xué)家們能夠鑒定出導(dǎo)致不同免疫相關(guān)性疾病的遺傳變異，為受累患者的臨床治療和罕見病的基因檢測(cè)提供必要的數(shù)據(jù)支撐。

2歲的童童（化名）是家里的第一個(gè)孩子，出生后2月齡起出現(xiàn)反復(fù)發(fā)熱，每次發(fā)熱持續(xù)數(shù)天，間隔8－10天再次反復(fù)，在當(dāng)?shù)囟啻巫≡褐委熑圆荒苊鞔_原因。2017年10月來到復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院臨床免疫科住院治療，進(jìn)行了全面臨床評(píng)估，排除了感染、風(fēng)濕以及腫瘤性疾病所致發(fā)熱?；純撼税l(fā)熱以外，還有淋巴增殖的表現(xiàn)，多種促炎癥細(xì)胞因子增高，這些信息提示免疫系統(tǒng)可能存在固有的缺陷。

初步的全外顯子高通量基因測(cè)序和免疫分析排除了各種已知的免疫缺陷病，患兒的反復(fù)發(fā)熱情況并未改善，作為本文第一作者、上海市援青干部、復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院免疫科孫金嶠教授坦言，在臨床發(fā)現(xiàn)問題后，復(fù)旦兒科團(tuán)隊(duì)聯(lián)合浙江大學(xué)周青教授團(tuán)隊(duì)和哈佛大學(xué)袁鈞瑛教授團(tuán)隊(duì)，進(jìn)一步分析患兒的基因測(cè)序數(shù)據(jù)并開展了一系列的基礎(chǔ)研究，最終發(fā)現(xiàn)患兒RIPK1的p.D324V位點(diǎn)存在新發(fā)變異。 “這也是人類首次發(fā)現(xiàn)這種類型的變異?！?孫金嶠教授表示，RIPK1（Receptor-Interactingserine/threonine-Protein Kinase-1）是受體相互作用蛋白（RIP）激酶家族的一員，參與了決定細(xì)胞“生死存亡”的多種重要信號(hào)通路，其激酶活性在RIPK1依賴的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞程序性壞死進(jìn)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。以往的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠RIPK1對(duì)應(yīng)位點(diǎn)（Asp325）突變會(huì)引起胚胎致死，主要是由于增多的細(xì)胞凋亡和程序性壞死，同時(shí)敲除Ripk3和Fadd，或者M(jìn)lkl和Fadd可以逆轉(zhuǎn)這一致死表型。然而，人類RIPK1該切割位點(diǎn)變異對(duì)這些重要信號(hào)通路及人類健康的影響未有報(bào)道。

▲ 基因測(cè)序數(shù)據(jù)圖譜

一系列問題擺在臨床醫(yī)生及基礎(chǔ)研究科學(xué)家們面前：需要證實(shí)這個(gè)變異是否是這類患者的致病原因以及遺傳方式；為什么相同的突變類型人與小鼠卻有著不同后果？小鼠可引起死胎，而人類僅僅發(fā)熱！另一個(gè)問題，同是RIPK1這個(gè)基因，已經(jīng)明確了它在激酶區(qū)的復(fù)合雜合突變會(huì)導(dǎo)致重癥聯(lián)合免疫缺陷病。而p.D324V位點(diǎn)的雜合突變僅僅導(dǎo)致反復(fù)發(fā)熱？這些問題都等待作者們進(jìn)一步證實(shí)和闡明。

孫金嶠教授分析道，首先這個(gè)患兒沒有聯(lián)合免疫缺陷病的臨床表現(xiàn)和免疫表型，只是表現(xiàn)為自身炎癥的臨床和實(shí)驗(yàn)室表現(xiàn)，同時(shí)也有一定程度的淋巴增殖性表現(xiàn)。患兒的生長(zhǎng)發(fā)育正常，無(wú)家族史和其他嚴(yán)重疾病史。一系列深入的免疫評(píng)估指向了自身炎癥性發(fā)熱的可能。因此不同于已經(jīng)報(bào)道的RIPK1激酶區(qū)復(fù)合雜合突變的聯(lián)合免疫缺陷病例。

功能實(shí)驗(yàn)研究顯示RIPK1的p.D324V位點(diǎn)變異促進(jìn)了TNF所致的外周血淋巴細(xì)胞死亡和炎癥反應(yīng)，尤其是以IL-6為代表的促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生明顯增加。至少在這種病例其炎癥的發(fā)生，除了RIPK1的變異造成促炎癥細(xì)胞因子增加外，細(xì)胞死亡又使得炎癥加強(qiáng)，二者之間存在相互促進(jìn)的作用，可以很好地解釋其周期性發(fā)熱等自身炎癥的表現(xiàn)，這也為臨床可能的治療手段提供了依據(jù)。此外，在RIPK1基因敲除的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）也看到了類似的變化。這些研究基本解決了患兒RIPK1 p.D324V變異致病的問題，但還無(wú)法解釋小鼠這一位點(diǎn)突變所引起的死胎而人類僅僅表現(xiàn)為自身炎癥的現(xiàn)象。

進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，取患兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)所獲得的結(jié)果與其外周血單個(gè)核細(xì)胞及MEFs結(jié)果相反，患兒在TNF的刺激下成纖維細(xì)胞的死亡和促炎癥因子IL-6的產(chǎn)生均較正常對(duì)照減少。并且成纖維細(xì)胞RIPK1和TNFR1的表達(dá)也被下調(diào)。這一結(jié)果表明人與小鼠的結(jié)果并不完全相同，也解釋了RIPK1 p.D324V變異在人與小鼠致病的差異，同時(shí)表明RIPK1參與細(xì)胞和機(jī)體炎癥調(diào)控的組織差異和復(fù)雜性。

中國(guó)臨床、基礎(chǔ)科學(xué)家協(xié)作研究

2019年12月12日，浙江大學(xué)生命科學(xué)研究院周青課題組、哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院袁鈞瑛教授團(tuán)隊(duì)和復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院王曉川課題組聯(lián)合在《自然》雜志上發(fā)表研究論文A dominant autoinflammatory disease caused by noncleavable variants of RIPK1，本研究首次發(fā)現(xiàn)人類RIPK1非切割變異導(dǎo)致自身炎癥性疾病并解析其發(fā)病分子機(jī)制。結(jié)果表明不能切割的RIPK1可以促進(jìn)其激酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、細(xì)胞程序性壞死增加、炎癥因子上調(diào)，為臨床提供更加合理、科學(xué)的治療建議，從而極大緩解患者的臨床癥狀；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)患者不同種類細(xì)胞響應(yīng)外來刺激的異質(zhì)性，豐富了RIPK1在調(diào)節(jié)不同種類細(xì)胞死亡中的作用。據(jù)王曉川教授介紹，結(jié)合這些研究的結(jié)果，兒科醫(yī)院免疫科在2019年3月起給患兒采取了托珠單抗治療，他的發(fā)熱頻率和持續(xù)時(shí)間均較前好轉(zhuǎn)。

如何從眾多的患者中把因免疫異常致病的患者診斷出來，需要的技術(shù)手段不是常規(guī)技術(shù)手段所能勝任的。將最新的免疫和分子診斷技術(shù)引入臨床免疫診斷是王曉川教授近年來一直在探索的問題。從2002年開始，在國(guó)內(nèi)首先對(duì)先天性免疫缺陷進(jìn)行基因診斷，使許多原本停留在書本和文獻(xiàn)中的疾病在中國(guó)得到明確診斷。如今，幾十種原發(fā)性免疫缺陷病都已經(jīng)得到快速明確的診斷，使許多患者的疾病都得到了有效的控制和治療。

根據(jù)國(guó)際免疫學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)專家組2017年版分類，可分為九大類，共354種疾病，明確致病基因344個(gè)。近年來隨著高通量基因測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，每年都有數(shù)十種新的致病基因被發(fā)現(xiàn)，而此項(xiàng)研究是由中國(guó)臨床醫(yī)生和基礎(chǔ)科學(xué)家通力協(xié)作主導(dǎo)發(fā)現(xiàn)的全新原發(fā)性免疫缺陷病，“希望通過臨床發(fā)現(xiàn)問題，再由基礎(chǔ)科學(xué)家介入，最終找到有效的治療手段和辦法幫助到更多患兒。”王曉川教授表示。

據(jù)悉，作為國(guó)內(nèi)唯一獨(dú)立的臨床免疫科，兒科醫(yī)院臨床免疫科1981年開展臨床免疫?？崎T診，2011年創(chuàng)建臨床免疫/過敏科，2014年成立了全國(guó)首家兒童免疫缺陷病?？撇》俊Ｔ\治范圍包括：免疫低下/免疫缺陷、預(yù)防接種相關(guān)問題、過敏性疾病、不明原因發(fā)熱等。我院是國(guó)內(nèi)最早開展原發(fā)性免疫缺陷病診治單位之一，在多年的工作中，建立了原發(fā)性免疫缺陷病的臨床和實(shí)驗(yàn)室評(píng)估和治療體系。