劉 燕，吳耀松，楊鐵柱，白 娟，寇美靜，史占江，陳玉龍＊＊

（1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院/河南省方證信號傳導(dǎo)實驗室 鄭州 450046；2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 鄭州 450046；3. 河南省洛陽正骨醫(yī)院（河南省骨科醫(yī)院） 鄭州 450016；4. 河南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 鄭州450046；5. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 武漢 430065）

抑郁癥（Depression，MDD）是一種以抑郁心境自我體驗為中心的臨床癥狀群或狀態(tài)，主要表現(xiàn)為心情低落、思維遲緩、認(rèn)知功能障礙、意志行為活動減退、軀體癥狀等[1,2]。據(jù)統(tǒng)計，抑郁癥已成為威脅人類健康的第四大疾患。越來越多的研究表明，抑郁癥的發(fā)生與社會心理應(yīng)激密切相關(guān)。然而，迄今為止，壓力應(yīng)激導(dǎo)致行為障礙的機制仍不清楚。通過本報道資助課題研究以及相關(guān)中樞神經(jīng)病學(xué)研究和臨床研究報道，大腦皮層和海馬是重要的情緒活動調(diào)控系統(tǒng)，其功能異常或障礙可能是應(yīng)激致病的主要原因[2]。

研究顯示，抑郁癥患者腦內(nèi)病變主要涉及大腦皮層和海馬腦區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocytes，AST）形態(tài)、功能、可塑性的改變[3]。另外，本團隊在上述課題研究的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)抑郁癥小鼠模型前額皮質(zhì)AST 與谷氨酸轉(zhuǎn)運體EAATs 的功能損害既是抑郁癥的結(jié)果又是促進其發(fā)展的重要因素[4]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是它是正常上皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的強抑制劑。有趣的是，有研究顯示TGF-β1 具有調(diào)節(jié)行為的作用[5]，然而，關(guān)于抑郁癥的發(fā)生中，TGF-β1 的表達(dá)變化和作用的報道具有不一致性。有研究顯示慢性應(yīng)激時，海馬內(nèi)注射TGF-β1 能逆轉(zhuǎn)大鼠抑郁行為，又有研究顯示抑郁病人血漿中TGF-β1 含量增加[6,7]。堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）表達(dá)主要集中于AST 中，其功能主要是促進AST 肥大和增生，是一種重要的促星形膠質(zhì)細(xì)胞活化因子。研究顯示前額皮質(zhì)、海馬和紋狀體bFGF 表達(dá)增強可顯著改善抑郁狀態(tài)[8]。

大量的臨床和實驗研究表明，宋代《太平惠民和劑局方》中逍遙散在抑郁癥治療方面顯示了明顯的優(yōu)越性，關(guān)于其治療機制目前已有大量研究者做出了相關(guān)探索，但大部分研究均聚焦于逍遙散對抑郁癥患者或模型大腦中樞神經(jīng)元的調(diào)節(jié)和保護作用，而從抑郁癥患者或動物模型中樞膠質(zhì)細(xì)胞功能開展逍遙散治療抑郁癥機制的研究甚少。本研究基于探索星形膠質(zhì)細(xì)胞抑制和激活因子TGF-β1 和bFGF 的表達(dá)進一步證實星形膠質(zhì)細(xì)胞參與抑郁癥發(fā)生過程，并聚焦于逍遙散對抑郁癥小鼠星形膠質(zhì)的重要調(diào)節(jié)因子TGF-β1 和bFGF 的調(diào)節(jié)作用，探討逍遙散治療抑郁癥的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司購買40只 10 周 齡 SPF 級 C57BL/6J 小 鼠（許 可 證 號 ：NO.11400700088123），按照隨機數(shù)字表法平均分為4組，分別為：正常組，模型組，氟西汀組、逍遙散組，所有小鼠飼養(yǎng)于SPF 級動物房（溫度22 ± 2℃，濕度30-40%）。除正常組外，其余各組小鼠均接受CUMS 方法造模。

1.2 實驗藥物

逍遙散顆粒劑（柴胡30 g，茯苓30 g，白術(shù)30 g，當(dāng)歸30 g，白芍30 g，甘草15 g，干姜10 g，薄荷10 g）購于河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院。鹽酸氟西汀膠囊為蘇州中化藥品工業(yè)有限公司產(chǎn)品（規(guī)格：20 mg/粒，批號：20064844）。

1.3 給藥方法

小鼠給藥劑量根據(jù)公式（小鼠的劑量=9.1X mg·kg-1，X 代表成人每天服用量/60 kg）換算確定，小鼠每天灌胃體積為0.5 mL，逍遙散和氟西汀的灌胃濃度分別為0.53 g·mL-1和 0.182 mg·mL-1[9]。模型組小鼠以同體積去離子水灌胃。

1.4 試劑與儀器

本研究采用的主要試劑有：bFGF Elisa 試劑盒（CUSABIO，規(guī)格：96 T，批號：CEB-E08001m）、TGF-β1 Elisa 試 劑 盒（Multi Science，規(guī) 格 ：96T，批 號 ：EK2812）、Anti-FGF2 Anti-body（No. ab10419，abcam公司）、Anti-TGF-β1 Anti-body（No.3711，CST 公司）。主要檢測的儀器有universal Hood II 型全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)；power pac 1000 型電泳儀；GS-800 型分光光度計。

1.5 動物模型的建立

根據(jù)文獻(xiàn)報道，采用抑郁癥模型建立常用的慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激方法[10]造模。對各組小鼠體重、攝食量進行監(jiān)測，并采用曠場試驗和糖水偏好實驗對各組小鼠行為學(xué)進行評價。自造模第1天開始于接受造模刺激前1 h灌胃。

1.6 動物一般情況和行為學(xué)檢測

1.6.1 體重測量

每日于灌胃前稱量并記錄各組小鼠體重、攝食量。

1.6.2 糖水實驗

根據(jù)文獻(xiàn)報道的實驗步驟[11]，實驗前，先訓(xùn)練小鼠適應(yīng)含糖飲用水，實驗開始時，每只小鼠預(yù)先給予一瓶1%蔗糖水和一瓶純凈水，1 h 后，取兩瓶并稱重以計算動物中糖和純水的消耗量（蔗糖偏好=蔗糖水消耗量/總耗水量× 100%）。糖水實驗于造模第21 天進行。

1.6.3 強迫游泳實驗

實驗第1天，將小鼠放入圓柱形玻璃桶中（注水高度20 cm；溫度22 ± 1℃）游泳15 min。第2 天，將小鼠放入同條件的圓柱形玻璃桶中游泳6 min，并使用視頻測量不動時間6 min。在最后5 min 內(nèi)，由對設(shè)計不知情的實驗者記錄每只小鼠的不動持續(xù)時間。該實驗在造模的第21天進行。

1.7 Elisa方法檢測逍遙散對抑郁小鼠前額皮質(zhì)bFGF和TGF-β1的總蛋白水平的影響

以反復(fù)凍融法裂解各組前額皮質(zhì)標(biāo)本，按說明書，加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本（100 mL/孔），并逐步加入抗體工作液、洗液、底物溶液和終止液，于酶標(biāo)儀450 nm波長條件下檢測各孔OD 值。使用Curve Expert 1.3 軟件并求出各樣本的實際蛋白濃度。

1.8 免疫組化方法檢測逍遙散對抑郁癥小鼠前額皮質(zhì)bFGF和TGF-β1蛋白免疫活性的影響

將4%多聚甲醛固定的小鼠腦組織以石蠟包埋，5 μm厚度連續(xù)切片，每個腦組織隨機挑取3 張切片進行免疫組化檢測。切片經(jīng)抗原修復(fù)和內(nèi)源性過氧化物酶滅活后，BSA 封閉后，滴加抗 bFGF 和 TGF-β1 兔多克隆抗體（均按1∶1000 比例稀釋）室溫條件下孵育1 小時后，滴加二抗，室溫孵育20 min，PBS浸洗，經(jīng)DAB顯色，復(fù)染、脫水、透明后，以中性樹脂封片。采用Court&Measure Full cellSens 1.11系統(tǒng)對切片進行管擦并計算bFGF和TGF-β1陽性細(xì)胞數(shù)和OD值。

1.9 western blotting 方法檢測逍遙散對抑郁癥小鼠前額皮質(zhì)bFGF和TGF-β1蛋白的表達(dá)水平的影響

BCA 法測定總蛋白濃度后，按照文獻(xiàn)[2]報道的western blotting 方法檢測各組小鼠前額皮質(zhì)bFGF 和TGF-β1 蛋白的表達(dá)水平，并采用GIS1D 4.2 圖像分析軟件對圖像灰度值進行采集，并求出bFGF 和TGF-β1受體蛋白的相對表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）對結(jié)果進行描述。符合正態(tài)分布檢驗和組間方差齊性檢驗的數(shù)據(jù)，采用One-Way ANOVA進行統(tǒng)計處理，組間比較采用LSD 檢驗，以P＜0.05 作為統(tǒng)計學(xué)意義界限。

2 實驗結(jié)果

2.1 逍遙散對抑郁癥模型小鼠體重和攝食量的調(diào)節(jié)作用

從表1 可知，模型組小鼠體重和攝食量較正常小鼠均出現(xiàn)明顯的下降（P＜0.01），然而，經(jīng)逍遙散和氟西汀治療后，小鼠體重（P＜ 0.05，P＜ 0.05）和攝食量（P＜ 0.01，P＜ 0.05）均出現(xiàn)明顯增長。

2.2 逍遙散對抑郁癥模型小鼠行為學(xué)變化的調(diào)節(jié)作用

從表2可知，與正常比較，模型組小鼠糖水偏好顯著減弱（P＜0.01），強迫游泳5 min 內(nèi)不動時間顯著增加（P＜0.01）。逍遙散和氟西汀可使模型小鼠糖水偏好顯著增加（P＜ 0.01，P＜ 0.01）；使強迫游泳5 min 內(nèi)不動時間顯著減少（P＜ 0.01，P＜ 0.01）。

2.3 逍遙散對抑郁癥小鼠前額皮質(zhì)bFGF 和TGF-β1總蛋白含量的影響

從表3可以看出，模型小鼠前額皮質(zhì)bFGF含量較正常組下降趨勢顯著（P＜0.05），而經(jīng)逍遙散和氟西汀治療后，模型小鼠前額皮質(zhì)bFGF 含量顯著升高（P＜ 0.05，P＜ 0.01）。相反的是，模型組小鼠前額皮質(zhì)TGF-β1 的含量較正常組顯著上升（P＜ 0.01），而經(jīng)逍遙散和氟西汀治療后，模型小鼠前額皮質(zhì)TGF-β1 的含量顯著上升（P＜ 0.01）。

表1 各組小鼠體重和攝食量變化

表2 各組小鼠糖水偏好和強迫游泳行為變化

表3 各組小鼠前額皮質(zhì)bFGF和TGF-β1含量的統(tǒng)計學(xué)描述()/pg·mg-1

表3 各組小鼠前額皮質(zhì)bFGF和TGF-β1含量的統(tǒng)計學(xué)描述()/pg·mg-1

注：*：與正常組比較：P ＜ 0.05，**：與正常組比較P ＜ 0.01；△：與模型組比較P ＜ 0.05，△△：與模型組比較P ＜ 0.01；

TGF-β1 9.56±0.67 16.06±2.84**11.36±1.51△△10.18±1.31△△組別正常組模型組逍遙散組氟西汀組bFGF 5.62±0.60 3.35±1.03*5.43±1.59△5.87± 0.71△△

表4 各組小鼠前額皮質(zhì)bFGF和TGF-β1蛋白免疫組化OD值及陽性細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計學(xué)描述()

表4 各組小鼠前額皮質(zhì)bFGF和TGF-β1蛋白免疫組化OD值及陽性細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計學(xué)描述()

注：*：與正常組比較：P ＜ 0.05，**：與正常組比較P ＜ 0.01；△：與模型組比較P ＜ 0.05，△△：與模型組比較P ＜ 0.01

陽性細(xì)胞數(shù)/n 217.42±61.65 283.92±86.31*202.75± 45.10△△195.83± 81.54△△組別正常組模型組逍遙散組氟西汀組bFGF OD值2.76±0.66 1.75±0.55**2.50± 0.53△△2.29±0.66△陽性細(xì)胞數(shù)/n 268.53±66.32 179.00±43.80**226.17±39.22△220.92±44.58△TGF-β1 OD值1.59±0.52 2.90±0.48**1.88± 0.53△△1.78± 0.43△△

2.4 逍遙散對抑郁模型小鼠前額皮質(zhì)bFGF和TGF-β1的蛋白表達(dá)的影響

2.4.1 免疫組化技術(shù)檢測結(jié)果

圖2 各組小鼠前額皮質(zhì)TGF-β1蛋白免疫組化檢測結(jié)果

表5 各組小鼠前額皮質(zhì)bFGF和TGF-β1蛋白表達(dá)的統(tǒng)計學(xué)描述（）

表5 各組小鼠前額皮質(zhì)bFGF和TGF-β1蛋白表達(dá)的統(tǒng)計學(xué)描述（）

注：*：與正常組比較：P ＜ 0.05，**：與正常組比較P ＜ 0.01；△：與模型組比較P ＜ 0.05，△△：與模型組比較P ＜ 0.01

TGF-β1 1.40±0.32 2.32±0.92**1.49±0.19△1.36±0.13△△組別正常組模型組逍遙散組氟西汀組bFGF 1.63±0.30 0.90±0.36**1.46±0.44△1.46±0.45△

從表4 和圖1 可見，模型組小鼠前額皮質(zhì)bFGF 蛋白陽性細(xì)胞數(shù)和OD 值與正常組比較顯著減少（P＜0.01），與模型組比較，逍遙散和氟西汀治療組小鼠前額皮質(zhì)bFGF 蛋白陽性細(xì)胞數(shù)和OD 值顯著增加（P＜0.05，P＜ 0.01）。從表4和圖2可見模型組小鼠TGF-β1蛋白OD 值和陽性細(xì)胞數(shù)較正常組顯著增加（P＜0.05），經(jīng)逍遙散和氟西汀治療后，小鼠 TGF-β1 蛋白OD值和陽性細(xì)胞數(shù)顯著降低（P＜0.01）。

2.4.2 Western blot技術(shù)檢測結(jié)果

圖3 各組小鼠前額皮質(zhì)TGF-β1蛋白表達(dá)情況

圖4 各組小鼠前額皮質(zhì)bFGF蛋白表達(dá)情況

從表5 和圖3-4 可知，模型組小鼠前額皮質(zhì)bFGF蛋白表達(dá)量較正常小鼠顯著減少（P＜0.01），而經(jīng)逍遙散和氟西汀治療后bFGF 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。而各組小鼠TGF-β1 的表達(dá)情況與bFGF 相反，組間差異顯著（P＜ 0.05，P＜ 0.01）。

3 討論

抑郁癥的發(fā)生與慢性應(yīng)激密切相關(guān)。不良應(yīng)激會產(chǎn)生多種有害物質(zhì)，從而引起機體一系列應(yīng)激癥狀，如消極、適應(yīng)能力低下、泄瀉、體重降低、飲食減少等[12]。機體在應(yīng)激狀態(tài)下，可通過各種代償機制應(yīng)對，并引起一系列神經(jīng)生化、內(nèi)分泌和免疫等系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)改變，其中參與應(yīng)激反應(yīng)的腦區(qū)主要有海馬、下丘腦、前額皮質(zhì)、杏仁核、紋狀體等，其中前額皮質(zhì)和海馬是應(yīng)激反應(yīng)過程中承受刺激最大、受損最嚴(yán)重的腦區(qū)[13]。

本研究結(jié)果顯示21 天慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激可使小鼠體重、攝食量減少，糖水偏好減少，強迫游泳5 min 內(nèi)不動時間增加，且逍遙散對模型小鼠出現(xiàn)體重、攝食量、行為學(xué)等的變化有顯著的治療作用，以上研究結(jié)果與同類研究結(jié)果[14]相吻合，說明慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激可使小鼠出現(xiàn)明顯抑郁癥狀。

bFGF 是成纖維細(xì)胞生長因子（Fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）家族中組成成員之一，是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和雪旺細(xì)胞的促有絲分裂原，能促進細(xì)胞增殖，另外bFGF 作為一種天然的神經(jīng)保護因子，有維持神經(jīng)細(xì)胞存活的功效[15]。有文獻(xiàn)報道，外源性的bFGF可改善大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，小鼠接受急性應(yīng)激后，前皮層中bFGF的表達(dá)明顯上調(diào)[16]。本研究觀察到，抑郁癥模型小鼠前額皮質(zhì)bFGF 蛋白表達(dá)顯著上升，而經(jīng)逍遙散和氟西汀治療bFGF 表達(dá)下調(diào)。表明抑郁癥小鼠自發(fā)行為和空間記憶功能的改變與bFGF 在前額皮質(zhì)表達(dá)變化密切相關(guān)，且逍遙散和氟西汀對此改變有一定的扭轉(zhuǎn)作用。

轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）不僅在炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和組織損傷中發(fā)揮著重要作用，還能發(fā)揮對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用，研究表明在抑郁癥發(fā)生中，TGF-β1 具有調(diào)節(jié)行為的作用[17]，且在CUMS 大鼠模型海馬組織內(nèi)檢測到TGF-β1 的表達(dá)顯著升高，硒蛋白P 表達(dá)下降，且正常和CUMS 大鼠注射外源性TGF-β1 能明顯抑制硒蛋白 P 的表達(dá)，表明 TGF-β1 通過 TGF-β1 型受體抑制硒蛋白P 表達(dá)可能是導(dǎo)致抑郁發(fā)生的途徑之一[18]。本研究觀察到，抑郁癥模型小鼠，前額皮質(zhì)TGF-β1 蛋白表達(dá)顯著增加，經(jīng)逍遙散和氟西汀治療后均下調(diào)，表明TGF-β1 蛋白在抑郁癥發(fā)生中扮演著重要的角色。

另外，本研究團隊前期研究顯示AST 功能損害與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)，且逍遙散可能通過調(diào)節(jié)抑郁癥AST 功能而發(fā)揮其治療作用[4]。而本研究觀察到逍遙散可通過調(diào)控AST 抑制劑TGF-β1 和促活化劑bFGF 而發(fā)揮治療抑郁癥的作用，其機制可能與逍遙散通過bFGF/TGF-β1 調(diào)控前額皮質(zhì)AST 功能有關(guān)，但具體機制仍需進一步深入研究。