劉 藝，郭金興

（1. 牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 牡丹江 157011；2. 牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院 牡丹江 157011）

宮頸癌（cervical carcinoma）是常見的威脅女性健康及生命的惡性腫瘤。國(guó)際癌癥研究中心研究數(shù)據(jù)表明，2013 年世界范圍內(nèi)確診宮頸癌病例約48.5 萬，死亡23.6 萬[1]。我國(guó)宮頸癌統(tǒng)計(jì)學(xué)研究數(shù)據(jù)表明，2009 年，我國(guó)宮頸癌發(fā)病率為12.96/10 萬，死亡率為3.28/10萬[2]。宮頸癌95%的病例是由高危型人乳頭瘤病毒（HPV）持續(xù)感染引起，其他危險(xiǎn)因素如早婚、結(jié)婚次數(shù)過多、丈夫包皮過長(zhǎng)、性伴侶過多、多產(chǎn)及初產(chǎn)年齡過早、人工流產(chǎn)次數(shù)過多、口服避孕藥、吸煙與被動(dòng)吸煙、機(jī)體免疫功能低下等[3-6]。目前宮頸癌的治療仍以傳統(tǒng)放化療為主，而放化療耐受已成為宮頸癌治療失敗、癌癥轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的主要原因之一[7]。近年來，中藥治療腫瘤以其多靶點(diǎn)、來源豐富、有效低毒的優(yōu)勢(shì)日益收到大多學(xué)者高度的重視。冬凌草甲素（oridonin）是唇形科香茶菜屬植物冬凌草主要的抗癌有效成分，為貝殼杉烯類二萜。現(xiàn)代藥理研究表明，冬凌草甲素對(duì)多種腫瘤有治療作用如直腸癌[8]、前列腺癌[9]、乳腺癌[10]、肺癌[11]、肝癌[12]、食管癌[13]、卵巢癌[14]、胰腺癌[15]等，提示冬凌草甲素具有較好的抗腫瘤效果。也有研究表明，冬凌草甲素對(duì)人宮頸癌HeLa 細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用[16,17]。然而有關(guān)于冬凌草甲素對(duì)HeLa細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響鮮見報(bào)道。故此本研究觀察了冬凌草甲素對(duì)HeLa 細(xì)胞遷移和侵襲能力及Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通路的影響，為其治療宮頸癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株

人宮頸癌HeLa細(xì)胞（美國(guó)ATCC，貨號(hào)：ZY-H066）接種于含10%熱滅活胎牛血清（foetal bovine serum，F(xiàn)BS）、2%谷氨酰胺、100 μg·mL-1鏈霉素和100 U·mL-1青霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)液中培養(yǎng)。每48 h 更換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。

1.1.2 主要試劑

冬凌草甲素（純度＞99.4%，美國(guó)Amresco，貨號(hào)：28957-04-2）；二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO，美國(guó) SIGMA，貨號(hào)：D5879-100ML）；RPMI-1640 培養(yǎng)基、FBS 和胰蛋白酶（美國(guó) Gibco 公司，貨號(hào)：12633、DXT-10099141、X4380）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）；（美國(guó) Abbkine 公司，貨號(hào)：KTC011001）；TUNEL 細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Ambion 公司，貨號(hào)：xyG001-1）；Annexin V-FITC/PI 試劑盒（美國(guó)BD 公司，貨號(hào)：556547）；鼠抗人β-catenin單克隆抗體（美國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)：xyKF682）；鼠抗人原癌基因（C-myc）單克隆抗體（美國(guó)Merck Millipore公司，貨號(hào)：DXT-ST257261）；鼠抗人細(xì)胞周期素D1（Cyclin D1）和兔抗人GAPDH 多克隆抗體（美國(guó)Bioss公司，貨號(hào)：bs-0623R-1，bs-0755R-1）；其它試劑均為進(jìn)口或者國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器

Model 311 型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；Bio-Tek ELX800 型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Rad公司）；FACS CaliburTM流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）；BX43熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；Power PAC1000電泳儀（美國(guó)Bio Rad 公司）；Micropulser 電轉(zhuǎn)儀（美國(guó)Bio Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥物配制

冬凌草甲素溶于 DMSO 配制成 160 μmol·L-1儲(chǔ)備液，DMSO濃度≤0.1%且不誘導(dǎo)細(xì)胞增殖或者死亡。-20℃冰箱保存，臨用時(shí)以RPMI-1640 培養(yǎng)液稀釋到所需濃度。

1.2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)

嚴(yán)格按照CCK-8 檢測(cè)試劑盒操作說明書進(jìn)行HeLa細(xì)胞活力檢測(cè)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞密度為1.5× 104個(gè)細(xì)胞/孔。37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組分別加入含不同濃度為10、20、40、80、160 μmol·L-1冬凌草甲素的RPMI-1640培養(yǎng)液100 μL，對(duì)照組加入不含冬凌草甲素的RPMI-1640 培養(yǎng)液100 μL。每個(gè)劑量組均設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。37℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。分別于12 h，24 h和36 h后終止培養(yǎng)，各孔均加入CCK-8試劑10 μL，混勻。37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)4 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處的吸光度（optical density，OD）值，以未加入HeLa 細(xì)胞，未加入冬凌草甲素，但是加入CCK-8 試劑的培養(yǎng)空作為空白組。計(jì)算細(xì)胞活力，細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組的OD 值-空白組的OD 值）/對(duì)照組的OD 值-空白組的OD 值）× 100%，并應(yīng)用Bliss 法計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）值。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

（1）TUNEL染色

嚴(yán)格按照TUNEL 凋亡檢測(cè)試劑盒操作說明書進(jìn)行HeLa 細(xì)胞凋亡檢測(cè)。取潔凈無菌玻片置于24孔板底部，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa 細(xì)胞以密度為4 × 104個(gè)細(xì)胞/mL 接種于24 孔板。37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組分別加入含不同濃度為10、20、40 μmol·L-1冬凌草甲素的 RPMI-1640 培養(yǎng)液 300 μL，對(duì)照組加入不含冬凌草甲素的RPMI-1640培養(yǎng)液300 μL。每個(gè)劑量組均設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。37℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h 后終止培養(yǎng)，取出玻片，4%多聚甲醛于4℃下固定 30 min，3% H2O2封閉 10 min，0.1%的 Triton-100 置于冰上打孔 5 min，加 80 μL 的 TUNEL檢測(cè)液，37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)2 h，DAPI 染核5 min，50%甘油封片。熒光顯微鏡下觀察HeLa 細(xì)胞核熒光變化。結(jié)果判定：凋亡細(xì)胞核發(fā)出綠色熒光，未凋亡細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色熒光。隨機(jī)選取10個(gè)視野觀察，分別計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

（2）Annexin V-FITC/PI雙染法

嚴(yán)格按照AnnexinV-FITC/PI試劑盒操作說明書進(jìn)行HeLa 細(xì)胞凋亡檢測(cè)。分組及細(xì)胞培養(yǎng)同“（1）”。0.25%胰蛋白酶消化，1200 r·min-1離心5 min，收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，250 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞（Binding Buffer），2000 r·min-1離心 5 min 后，去除上清液，添加100 μL Binding Buffer 并吹打，依次加入 Annexin VFITC 和 PI 液各 5 μL 混勻，室溫避光反應(yīng) 15 min，再加入400 μL Binding Buffer，轉(zhuǎn)移至流式管，于1 h 內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，計(jì)算凋亡率。凋亡率（%）=Q2凋亡率+Q4凋亡率。

1.2.4 細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)

將分組及細(xì)胞培養(yǎng)同“（1）”。預(yù)處理過的HeLa細(xì)胞接種于預(yù)先用Matrigel 膠包被96 孔板。37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)120 min。PBS 洗滌2 次去除未粘附的細(xì)胞，加入MTT 20μL，37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)4 h，加DMSO 150 μL 溶解結(jié)晶顆粒，置搖床上低速振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處的OD 值，計(jì)算粘附率。粘附率（%）=實(shí)驗(yàn)組的OD/對(duì)照組的OD×100%。

1.2.5 劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa 細(xì)胞以密度為4×104個(gè)細(xì)胞/mL接種于6孔板，37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，待細(xì)胞平鋪面積達(dá)80%后，用已消毒的10 μL 槍頭垂直劃一條泳道，PBS 洗去脫落細(xì)胞。分組及細(xì)胞培養(yǎng)同“（1）”。倒置顯微鏡下拍照，用NIH image J 軟件計(jì)算劃痕面積，計(jì)算遷移率。遷移率（%）=實(shí)驗(yàn)組劃痕面積/對(duì)照組劃痕面積×100%。

1.2.6 Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)

將Transwell 侵襲小室進(jìn)行Matrigel 膠鋪膠，置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行固化處理。用無血清培養(yǎng)液將HeLa 細(xì)胞饑餓培養(yǎng)24 h 后，在上層小室加入200 μL密度為4 × 104個(gè)細(xì)胞/mL 細(xì)胞懸液，而在下室中加入完全培養(yǎng)基。分組及細(xì)胞培養(yǎng)同“（1）”。取出小室，棄上層小室培養(yǎng)液，PBS 洗滌3 次，無菌棉簽擦去未侵襲細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過的細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算侵襲率。侵襲率（%）=實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.7 Western blot分析

分組及細(xì)胞培養(yǎng)同“（1）”。1200 r·min-1離心 5 min，收集細(xì)胞，充分裂解后提取總蛋白，用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺預(yù)制凝膠中，各培養(yǎng)孔加入50 μg 蛋白樣品進(jìn)行電泳。常規(guī)轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉封閉2 h。分別與Ⅰ抗鼠抗人β-catenin 單克隆抗體，鼠抗人C-myc 單克隆抗體，鼠抗人Cyclin D1 4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，洗膜后加辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗兔Ⅱ抗，37℃、5% CO2及飽和濕度下孵育1 h。TBST 洗膜3 次，ECL 顯影。以GAPDH作為內(nèi)參。Gel-pro 4.0軟件進(jìn)行分蛋白條帶與GAPDH灰度比值，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

圖1 不同濃度冬凌草甲素對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。數(shù)據(jù)分析計(jì)量資料采用“”表示，各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊時(shí)，采用單因素方差分析，組間兩兩比較，采用LDS 檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)采用 Games-Howell 檢驗(yàn)。P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冬凌草甲素對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響

HeLa細(xì)胞經(jīng)不同濃度0、10、20、40、80、160 μmol·L-1冬凌草甲素處理 12 h，24 h 和 36 h 后，以 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，冬凌草甲素對(duì)HeLa 細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，且隨著作用時(shí)間和作用濃度的增加，抑制作用逐漸增加（圖1）。當(dāng)冬凌草甲素濃度為 80 μmol·L-1處理24 h 時(shí)，HeLa 細(xì)胞活力約為 50%。24 h，48 h 和 72 h 的IC50分別為（151.36 ± 18.72）μmol·L-1，（62.10 ± 7.39）μmol·L-1和（8.41 ± 1.07）μmol·L-1。本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用 ≤80 μmol·L-（110、20、40 μmol·L-1）冬凌草甲素及24 h作為實(shí)驗(yàn)濃度和處理時(shí)間。

2.2 冬凌草甲素對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響

2.2.1 TUNEL染色結(jié)果

與對(duì)照組比較，10、20、40 μmol·L-1冬凌草甲素組HeLa 細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高（P＜ 0.05，P＜ 0.01）（圖2、圖3）。

2.2.2 Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)果

與對(duì)照組比較，10、20、40 μmol·L-1冬凌草甲素組HeLa 細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜ 0.05，P＜ 0.01）（圖4、圖5）。

2.3 冬凌草甲素對(duì)HeLa細(xì)胞粘附力的影響

與對(duì)照組比較，10、20、40 μmol·L-1冬凌草甲素組HeLa細(xì)胞粘附率顯著降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01）（圖6）。

2.4 冬凌草甲素對(duì)HeLa細(xì)胞遷移能力的影響

與對(duì)照組比較，10、20、40 μmol·L-1冬凌草甲素組HeLa 細(xì)胞遷移率顯著降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01）（圖7、圖8）。

2.5 冬凌草甲素對(duì)HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響

與對(duì)照組比較，10、20、40 μmol·L-1冬凌草甲素組HeLa 細(xì)胞侵襲率顯著降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01）（圖9、圖10）。

2.6 冬凌草甲素對(duì)HeLa細(xì)胞侵Wnt/β-catenin信號(hào)通的影響

與對(duì)照組比較，10、20、40 μmol·L-1冬凌草甲素組HeLa 細(xì)胞β-catenin、C-myc 和 Cyclin D1 蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01）（圖11、圖12）。

3 討論

本研究CCK-8 結(jié)果顯示，冬凌草甲素可呈劑量-時(shí)間依賴效應(yīng)的方式抑制HeLa 細(xì)胞增殖。同時(shí)本研究TUNEL 染色和Annexin V-FITC/PI 雙染法結(jié)果顯示，冬凌草甲素亦可誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞凋亡。以上研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[18]。

遷移和侵襲是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)的重要過程，遷移和侵襲能力越強(qiáng)說明腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力越強(qiáng)，腫瘤越容易轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)[19]。轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)是一個(gè)受多種因素調(diào)控的復(fù)雜過程，除了與腫瘤細(xì)胞新生血管的形成有關(guān)以外，亦與細(xì)胞的粘附力，遷移和侵襲能力的改變有關(guān)，為惡性腫瘤治療失敗及預(yù)后較差的主要原因[20]。本研究通過細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了冬凌草甲素對(duì)HeLa細(xì)胞粘附力的影響，劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了冬凌草甲素對(duì)HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響，Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了冬凌草甲素對(duì)HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，冬凌草甲素顯著抑制HeLa 細(xì)胞粘附力，遷移和侵襲能力，且隨著藥物濃度增加，抑制作用逐漸增加。這些結(jié)果提示，冬凌草甲素除了可以抑制HeLa細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡以外，亦可通過抑制其遷移和侵襲能力共同發(fā)揮抗宮頸癌作用。

圖2 TUNEL染色結(jié)果（×200）

圖3 冬凌草甲素對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響

圖4 Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)果

圖5 冬凌草甲素對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡率的影響

圖6 冬凌草甲素對(duì)HeLa細(xì)胞粘附率的影響

圖7 劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（×40）

圖8 冬凌草甲素對(duì)HeLa細(xì)胞遷率的影響

圖9 Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果（結(jié)晶紫，×200）

圖10 冬凌草甲素對(duì)HeLa細(xì)胞侵襲率的影響

宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲是制約其療效、影響預(yù)后及的重要因素之一。惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)是一個(gè)由多種分子參與調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)通路，與惡性腫瘤有著密切的關(guān)系，參與多個(gè)生物學(xué)進(jìn)程調(diào)控（如調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等），其異?；罨瘏⑴c人類多種癌癥的發(fā)病過程[21]。β-catenin 是 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，是該信號(hào)通路激活的標(biāo)志[22]。β-catenin表達(dá)量越高，腫瘤的惡性程度越高，遷移和侵襲能力越強(qiáng)，預(yù)后也越差[23]。當(dāng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常激活時(shí)，β-catenin 在細(xì)胞質(zhì)中降解減少，去磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而開啟下游C-myc 和Cyclin D1 等靶基因的異常表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，轉(zhuǎn)移和侵襲[24]。研究表明，宮頸癌患者及HeLa細(xì)胞β-catenin 表達(dá)異常[25,26]。本研究 western blot 分析結(jié)果顯示，冬凌草甲素顯著降低HeLa 細(xì)胞β-catenin、C-myc 和Cyclin D1 表達(dá)。以上結(jié)果提示，冬凌草甲素可抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路。

圖11 Western blot結(jié)果

圖12 冬凌草甲素對(duì)HeLa細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通的影響

綜上所述，冬凌草甲素具有抑制HeLa 細(xì)胞增殖的作用，亦可誘導(dǎo)凋亡及抑制遷移和侵襲能力，并抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路。目前對(duì)于冬凌草甲素的抗宮頸癌作用仍不明確，今后的實(shí)驗(yàn)中還需要具體探討。