嚴(yán)福林，溫 迪，任得強(qiáng)，王 波，徐文芬，孫慶文，魏升華

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 貴陽(yáng) 550025）

清風(fēng)藤屬Sabia隸屬于清風(fēng)藤科Sabiaceae，我國(guó)分布 16 種、5 亞種、2 變種，分為清風(fēng)藤組Sect.Sabia與厚盤組Sect. Pachydiscus，主要集中分布于我國(guó)貴州、云南、廣西等西南地區(qū)[1,2]。清風(fēng)藤屬植物大多入藥使用，以小花清風(fēng)藤藥用最為廣泛，具有清熱利膽、祛風(fēng)止痛等功效，常用于治療肝炎、風(fēng)濕痹痛、跌打損傷等疾病，亦為貴州苗族、布依族等少數(shù)民族常用藥[3,4]。現(xiàn)代研究表明，清風(fēng)藤屬植物主要含有黃酮類、生物堿類及三萜類成分，具有顯著的抗乙肝病毒、保肝護(hù)肝、降酶、抗炎等作用[5-12]。此外，清風(fēng)藤屬植物藤蔓特殊，適應(yīng)性強(qiáng)，亦是良好的園藝造景植物。可見(jiàn)，該屬植物具有較好的園藝價(jià)值和藥物開(kāi)發(fā)價(jià)值。

清風(fēng)藤屬植物花期較短，花瓣易脫落，果實(shí)較少，標(biāo)本往往缺乏重要的鑒定器官，給該屬植物的系統(tǒng)分類學(xué)研究和藥材的真?zhèn)舞b別帶來(lái)了挑戰(zhàn)。王波、劉科成、溫迪等[13-16]在顯微鏡下對(duì)清風(fēng)藤屬植物葉表皮細(xì)胞、淀粉、非腺毛、石細(xì)胞特征進(jìn)行觀察，該屬植物的淀粉、非腺毛、葉表皮、石細(xì)胞形態(tài)、大小及紋孔等方面存在一定差異。郭文凱、孫慶文等[17]采用顯微觀察和數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)凹萼清風(fēng)藤、平伐清風(fēng)藤、小花清風(fēng)藤等9 種清風(fēng)藤屬種植物葉片表皮細(xì)胞顯微表征進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)毛被與細(xì)胞形態(tài)不同。以上研究取得了卓著的成效，為該屬植物的分類及其藥材鑒別提供了重要的參考。Sui 等[18]采用DNA 條形碼技術(shù)，考察了trnH-psbA、rbcL-a、matK 3個(gè)候選系列在小花清風(fēng)藤及其混偽品中的鑒定可行性，其中，3個(gè)候選系列均能將清風(fēng)藤屬植物與其他科屬植物分開(kāi)，matk + rbcL-a 可將小花清風(fēng)藤與其他科（防己科、衛(wèi)矛科、茜草科等）的7種植物區(qū)別開(kāi)，為小花清風(fēng)藤藥材及其偽品的鑒定奠定了基礎(chǔ)。但以上研究在取樣上還有一定局限，研究種類較少，該屬植物的分類與鑒定仍然依靠經(jīng)驗(yàn)豐富的專家[19,20]。因此，探求一種準(zhǔn)確簡(jiǎn)便又行之有效的鑒別方法來(lái)鑒別清風(fēng)藤屬植物的系統(tǒng)分類與鑒定仍然尤為重要。

內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2 序列（internal transcribed spacer 2，ITS2）是核基因上位于5.8S rRNA 基因區(qū)和大的亞單位編碼區(qū)28S之間的一個(gè)片段，具有通用性好、變異性高、擴(kuò)增和測(cè)序料率高等優(yōu)點(diǎn)，是分析動(dòng)植物系統(tǒng)進(jìn)化、分類鑒定的較好基因片段。在淫羊藿屬、人參屬、蘭屬、等諸多藥用生物的分類和鑒定中得到了廣泛應(yīng)用，是鑒定物種屬及物種水平的研究熱點(diǎn)[21-26]。本研究基于前期基礎(chǔ)，對(duì)9種清風(fēng)藤屬藥用植物38個(gè)產(chǎn)地樣品進(jìn)行ITS2序列分析，為清風(fēng)藤屬植物的分類鑒定與系統(tǒng)學(xué)提供參考，為該屬植物的種質(zhì)資源的保護(hù)與可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究為清風(fēng)藤科清風(fēng)藤屬植物的9 個(gè)物種，38份樣品采自貴州、云南、重慶、臺(tái)灣4 個(gè)地區(qū)。對(duì)應(yīng)標(biāo)本均由貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定，憑證標(biāo)本存于貴州省生藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本室。材料信息詳見(jiàn)表1。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品DNA的提取與擴(kuò)增

取硅膠干燥的葉片約20 mg，根據(jù)試劑盒（Tiangen Biotech Co.，China）操作提取樣品總 DNA 樣本。候選引物 ITS2，以 50 μL 體系：24 μL Tad PCR Matermix（2×，bluedye）、正反向引物各2 μL，總DNA 模板2 μL，ddH2O 20 μL 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；擴(kuò)增程序均為：94℃，5 min；94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，45 s；40 cycles；72℃，10 min。引物序列為 ITS2（堿基序列（5'-3'））：2FATGCGATACTTGGTGTGAAT，3R-GACGCTTCTCCAGACTACAAT。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳中檢測(cè)，條帶單一且清晰的PCR產(chǎn)物送至上海生工純化及測(cè)序。

表1 樣品信息表

2.2 數(shù)據(jù)處理方法

測(cè)序后所得峰圖應(yīng)用Codon Code Aligner V 8.0.2（CodonCode Co.，USA）軟件進(jìn)行校對(duì)拼接，去除引物區(qū)和低質(zhì)量序列。所得各序列經(jīng)ClustalX V 2.0（Higgins D.G）進(jìn)行多序列比對(duì)并查錯(cuò)；再應(yīng)用The ITS2 Database在線工具（http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/）進(jìn)行注釋剪切，去除序列兩端5.8S 和28S 區(qū)；應(yīng)用Geneious V 10.0.02 軟件分析ITS2 序列的組成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)；使用MEGA V 7.0軟件計(jì)算（Kimura 2-parameter，K2P）距離值，比較ITS2序列的種間、種內(nèi)變異，應(yīng)用最大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 ITS2序列特征分析

本研究統(tǒng)計(jì)了38 個(gè)居群清風(fēng)藤屬植物分子樣進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后的擴(kuò)增成功率和測(cè)序成功率。結(jié)果顯示，擴(kuò)增成功率與測(cè)序成功率均為100%，表明本研究所選用的ITS2 序列引物在清風(fēng)藤屬植物中的通用性好。測(cè)序所得的序列經(jīng)拼接、去除引物區(qū)和低質(zhì)量序列，剪切兩端5.8S和28S區(qū)，清風(fēng)藤屬植物的ITS2序列長(zhǎng)度均為241 bp，GC 含量為51.9-64.7%。保守位點(diǎn)168 個(gè)，變異位點(diǎn)數(shù)目為73 個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)目為65 個(gè)。CpG、TpG（CpA）和 TpA 頻率為 20.75%（50/241），2倍簡(jiǎn)并位點(diǎn)25個(gè)，4倍簡(jiǎn)并位點(diǎn)39個(gè)（圖1）。

3.2 清風(fēng)藤屬ITS2序列種內(nèi)和種間變異分析

應(yīng)用MEGA 7.0 軟件通過(guò)K2P 模型，統(tǒng)計(jì)清風(fēng)藤屬種間和種內(nèi)遺傳分化情況，獲得的ITS2序列的種內(nèi)與種間變異值詳情見(jiàn)表2。ITS2 序列在清風(fēng)藤屬中，種內(nèi)變異為0-0.074，其中種內(nèi)變異最大的為S.swinhoei（0.074±0.002），S.campanulata與S.fasciculate種內(nèi)遺傳變異為0；種間變異在0.007-0. 205，其中S.discolor與S. swinhoei種間遺傳距離最大，為 0.205 ±0.007，S.campanulata與S.transarisanensia種間遺傳距離最小，為0.007。總體看，ITS2 序列在清風(fēng)藤屬內(nèi)種間遺傳距離與種內(nèi)遺傳距離存在一定間隔，可將各種類進(jìn)行區(qū)分，是清風(fēng)藤屬植物較為理想的DNA條形碼候選序列。

3.3 清風(fēng)藤屬ITS2序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

應(yīng)用ML，自展支持率（bootstrap）1000 次重復(fù)檢驗(yàn)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建（圖2）。由ITS2 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可知：清風(fēng)藤屬厚盤組Sect.Pachydiscus下的四川清風(fēng)藤、鐘花清風(fēng)藤亞種（鄂西清風(fēng)藤）、云南清風(fēng)藤、阿里山清風(fēng)藤4 個(gè)種聚為1 支，組下的4 個(gè)種又各為單列，具有一定的遺傳距離，能夠較好的將清風(fēng)藤屬2 個(gè)組區(qū)分。其中，廣布種四川清風(fēng)藤由于采集地居群差異，具有較大的遺傳距離，貴陽(yáng)居群與其余居群區(qū)分，這與遺傳距離分析結(jié)果一致。

清風(fēng)藤組Sect.Sabia下的小花清風(fēng)藤S.parviflora、簇花清風(fēng)藤S. fasciculata樣品較好的各自聚為一支，可與其余種類較好的區(qū)分。平伐清風(fēng)藤S.dielsii與灰背清風(fēng)藤S.discolor聚成一支，且灰背清風(fēng)藤S.discolor2 個(gè)樣品均鑲嵌于平伐清風(fēng)藤S.dielsii中，不宜區(qū)分。尖葉清風(fēng)藤S. swinhoei樣品均能聚為成一支，但各產(chǎn)地樣品變異較大，不能聚類?？梢?jiàn)，小花清風(fēng)藤、簇花清風(fēng)藤、云南清風(fēng)藤、鄂西清風(fēng)藤較為保守；平伐清風(fēng)藤與灰背清風(fēng)藤親緣關(guān)系較近，但平伐清風(fēng)藤與四川清風(fēng)藤變異較為復(fù)雜。

4 討論

清風(fēng)藤屬藥用植物以莖葉及根入藥，由于其特殊的藥用功效多數(shù)種類在其產(chǎn)地均為藥用，最早記載于宋代的《本草圖經(jīng)》，后《本草綱目》及貴州、湖南、廣西等地的《天目山藥用植物志》、《廣西本草選編》等地方醫(yī)藥典籍與醫(yī)藥地方標(biāo)準(zhǔn)均有記載。又名“青藤、尋風(fēng)藤”等，具有祛風(fēng)利濕，活血解毒等功效。以小花清風(fēng)藤藥用最為廣泛，在廣西、貴州、云南、湖南、湖北等地均有藥用，用于治療和預(yù)防黃疸型傳染性肝炎。現(xiàn)代研究表明，清風(fēng)藤屬植物具有良好的抗肝炎作用，有巨大的開(kāi)發(fā)利用潛力。

目前，清風(fēng)藤屬植物及其藥材的分類鑒定主要依賴于性狀鑒別，顯微方法等傳統(tǒng)方法。由于其特殊的結(jié)構(gòu)特性、遺傳與分布特性，依靠標(biāo)本難以對(duì)其進(jìn)行分類鑒定，該屬植物系統(tǒng)分類與鑒定還有待完善，尤其在清風(fēng)藤藥材的鑒定過(guò)程中應(yīng)用傳統(tǒng)分方法更難以區(qū)分。本研究對(duì)9 種清風(fēng)藤屬藥用植物38 個(gè)居群核基因片段ITS2序列的結(jié)構(gòu)、種間遺傳距離與系統(tǒng)關(guān)系進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，ITS2 序列在清風(fēng)藤屬植物中的擴(kuò)增率成功率與測(cè)序成功率均達(dá)到100%，引物通用性較好，較為容易得到質(zhì)量較高的序列片段，具有較高的可行性。

表2 清風(fēng)藤屬植物ITS2序列種內(nèi)和種間平均遺傳距離

圖2 基于ITS2構(gòu)建的清風(fēng)藤屬藥用植物ML系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

分析獲得清風(fēng)藤屬ITS2 序列保守位點(diǎn)168 個(gè)，變異位點(diǎn)數(shù)目73 個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)目65 個(gè)；其中，二倍簡(jiǎn)并位點(diǎn)25 個(gè)，四倍簡(jiǎn)并位點(diǎn)39 個(gè)。表明，ITS2 序列在清風(fēng)藤屬藥用植物中具有較好的進(jìn)化速率與變異程度，種間變異位點(diǎn)豐富，且種內(nèi)變異位點(diǎn)較少。

ITS2 序列在清風(fēng)藤屬種內(nèi)變異為0-0.074，種間變異為0.007-0.205，但從各種間遺傳距離看，種間遺傳距離均大于種內(nèi)遺傳距離，具有較好的種間分離度。從ITS2 構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果看，在四川清風(fēng)藤、尖葉清風(fēng)藤、灰背清風(fēng)藤等部分廣布種中，存在屬內(nèi)種間遺傳距離與種內(nèi)遺傳距離存在交叉，大多數(shù)種內(nèi)具有穩(wěn)定的遺傳，近地理居群親緣較近。系統(tǒng)樹(shù)基本符合傳統(tǒng)的系統(tǒng)分類學(xué)方法，清風(fēng)藤組Sect.Sabia從清風(fēng)藤屬中區(qū)分聚為一個(gè)大支，包括于厚盤組Sect.Pachydiscus中，傳統(tǒng)的分類方法將其單列，與清風(fēng)藤組Sect.Sabia平行，有待進(jìn)一步從基因組角度研究探討。種間聚類情況與遺傳距離分析結(jié)果一致，具有較好的種間分化。平伐清風(fēng)藤為貴州特有植物，是典型的狹域分布種類，具有明顯的區(qū)域分布特征，系統(tǒng)關(guān)系分析中，平伐清風(fēng)藤與灰背清風(fēng)藤親緣關(guān)系較近，且平伐清風(fēng)藤變異較為復(fù)雜，所有樣品不能更好聚類。這提示平伐清風(fēng)藤在可能是一個(gè)雜交形成物種，但還需結(jié)合形態(tài)特征，從多序列或基因組的角度進(jìn)一步深入研究，予以證實(shí)。

綜上，除平伐清風(fēng)藤、灰背清風(fēng)藤與廣布種四川清風(fēng)藤外，ITS2 序列基本能將屬下物種進(jìn)行區(qū)分。因此認(rèn)為，ITS2 序列在清風(fēng)藤屬植物中具有適宜的分化和保守性，能夠?qū)ΨN間進(jìn)行較為準(zhǔn)的分類和鑒別。研究中除阿里山清風(fēng)藤外，均具有2個(gè)以上的產(chǎn)地樣品，進(jìn)行了反復(fù)驗(yàn)證，具有可重復(fù)性，符合清風(fēng)藤屬藥用植物DNA條形碼鑒定要求。因此，本研究中的ITS2序列適用于清風(fēng)藤屬藥用植物的分類鑒定和系統(tǒng)學(xué)分析。本研究豐富了清風(fēng)藤屬藥用植物的分子生物學(xué)研究數(shù)據(jù)，為該屬植物的種類鑒定、物種起源、演化與系統(tǒng)學(xué)等研究提供了一定參考。