魏丹丹， 謝中藝， 楊帆帆， 林立萍， 黃新祥， 張盈

(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

傷寒沙門菌(Salmonellaentericaserovar Typhi，S. Typhi)屬于腸桿菌科沙門菌屬，人類是其唯一的感染宿主[1]?？山?jīng)糞口途徑傳播感染人體引起消化系統(tǒng)感染，緊接著S. Typhi侵入腸壁淋巴組織并沿著淋巴管進(jìn)入腸系膜淋巴組織，并被巨噬細(xì)胞吞噬，S. Typhi能夠在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活和增殖，通過淋巴液及血液循環(huán)擴(kuò)散到全身造成系統(tǒng)性感染[2]。

OmpR是雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)EnvZ/OmpR中的調(diào)節(jié)蛋白，磷酸化的OmpR參與許多信號傳導(dǎo)[3]。研究表明，OmpR對酸應(yīng)激、滲透壓調(diào)節(jié)、上皮細(xì)胞侵襲能力等有重要意義[4]，并且也是細(xì)菌氧化應(yīng)激調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一部分[5]。EnvZ/OmpR雙組分系統(tǒng)也可通過沙門氏菌致病島2(SalmonellaPathogenicity Island-2，SPI-2)調(diào)控Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)的表達(dá)，從而影響細(xì)菌的毒力[6]。本研究利用ompR基因缺陷株(ΔompR)及回補(bǔ)株(C-ΔompR)，探討OmpR對S. Typhi巨噬細(xì)胞內(nèi)生存能力的影響，并通過分析OmpR對細(xì)菌巨噬細(xì)胞內(nèi)生存能力相關(guān)的SPI-2中3個操縱子首基因ssrA、ssrB和spiC的調(diào)控關(guān)系來研究其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒S. Typhi野生株GIFU10007(WT)由日本岐阜大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室饋贈；S. Typhi空載體對照株(WT-pBAD33)，ompR缺陷帶空質(zhì)粒株(ΔompR-pBAD33)，ompR回補(bǔ)株(C-ΔompR)，ompR-pET28a-BL21重組蛋白表達(dá)菌由本實驗室制備及保存；pBAD33質(zhì)粒(氯霉素抗性)、pBAD33-ompR(ompR回補(bǔ)質(zhì)粒)；pHRP309-ssrA、pHRP309-ssrB和pHRP309-spiC分別為ssrA、ssrB和spiC基因啟動子序列與pHRP309中的lacZ基因相連。

1.1.2 主要試劑 巨噬細(xì)胞THP-1購自上海生科院細(xì)胞庫；Trizol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品; 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR熒光定量試劑盒、快速DNA消化試劑盒均為TaKaRa公司產(chǎn)品；凝膠阻滯實驗(EMSA)上樣緩沖液為碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；β-半乳糖苷酶活性檢測試劑盒為Promega公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 核酸紫外檢測儀(德國Eppendorf公司)；凝膠成像系統(tǒng)(英國SynGene公司)；ABI2720型PCR儀，高速冷凍離心機(jī)以及CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱均為美國Thermo公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀，電轉(zhuǎn)化儀Gene Pulsero Ⅱ以及酶標(biāo)儀均為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.1.4 引物 基因特異性引物由蘇州泓訊生物科技有限公司合成，序列見表1(下劃線表示酶切位點)。

表1 特異性引物名稱及相應(yīng)序列

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng) 將WT-pBAD33、ΔompR-pBAD33以及C-ΔompR接種于液體LB培養(yǎng)基中，37℃，250 r/min培養(yǎng)過夜作為種子液。按1 ∶100將種子液轉(zhuǎn)接至新鮮的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對數(shù)早期[D(600 nm)約為0.4]，加入0.2%(w/v)L-阿拉伯糖繼續(xù)培養(yǎng)30 min以誘導(dǎo)ompR的表達(dá)。

1.2.2 THP-1胞內(nèi)生存實驗 THP-1細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種5×105細(xì)胞，加入150 ng/mL佛波乙酯誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化48 h，誘導(dǎo)率約為70%。實驗前1 h給細(xì)胞換上新鮮的RPMI 1640培養(yǎng)液。將WT-pBAD33、ΔompR-pBAD33和C-ΔompR菌株按“1.2.1”所述培養(yǎng)誘導(dǎo)后，按MOI=10 ∶1加入THP-1細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)1 h。每孔加入100 μg/mL慶大霉素后繼續(xù)培養(yǎng)1 h殺死胞外菌，棄上清液，PBS洗3次，將全部孔分為3等份。1/3孔內(nèi)加入1 mL 0.5%(v/v)Triton X-100裂解細(xì)胞，適當(dāng)稀釋后涂在LB平板，37℃過夜培養(yǎng)后計數(shù)平板上的菌落并乘以稀釋倍數(shù)記為T0；后2/3孔棄去1/2體積的培養(yǎng)液并加入等量新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)分別培養(yǎng)12 h和24 h，然后同樣的方法計數(shù)菌落數(shù)記為T12和T24。計算并比較不同菌株的T12/T0和T24/T0(分別代表12 h和24 h細(xì)菌在巨噬細(xì)胞胞內(nèi)存活能力)。實驗進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3 RNA提取和實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 將WT-pBAD33和ΔompR-pBAD33分別接種至液體LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)早期，離心收集菌體。Tri-zol法提取細(xì)菌總RNA，取1 μg總RNA，DNA消化試劑盒消化基因組DNA后利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用ssrA、ssrB和spiC特異性引物進(jìn)行qRT-PCR，以16 S rRNA為內(nèi)參基因，采用相對定量法分析各基因mRNA表達(dá)水平。每組設(shè)有平行樣，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 β-半乳糖苷酶活性檢測 以S. Typhi基因組DNA為模板，利用特異性引物(序列見表1)PCR擴(kuò)增目的片段，與pHRP309質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后酶連，將產(chǎn)物熱擊至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆提取質(zhì)粒測序，序列比對完全正確后，將LacZ重組載體分別電轉(zhuǎn)至WT和ΔompR感受態(tài)細(xì)胞中，PCR驗證后，即菌株構(gòu)建成功。將攜帶有LacZ重組質(zhì)粒的WT和ΔompR培養(yǎng)至對數(shù)中期，離心棄上清, 預(yù)冷的 PBS洗滌2次后重懸。超聲儀破菌，β-半乳糖苷酶活性檢測酶聯(lián)板孔中分別加入WT和ΔompR上清液，加入30 μL檢測液后混勻，37℃靜置至溶液完全變黃，記錄反應(yīng)時間，加入反應(yīng)終止液混勻，利用酶標(biāo)儀檢測混合液的D(415 nm)值和D(595 nm)值。實驗3次生物學(xué)重復(fù)。Miller Units的數(shù)值用來表示β-半乳糖苷酶活性，計算公式如下：Miller單位= 106×稀釋倍數(shù)×[D(415 nm)-D(595 nm)]×1.75/[體積(μL)×作用時間(min)×D(600 nm)]。

1.2.5 OmpR蛋白的表達(dá)及純化 接種ompR-pET28a-BL21重組蛋白表達(dá)菌至液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期[D(600 nm)約為0.6]，加入1 mmol/L IPTG，30℃，100 r/min誘導(dǎo)6 h。收集菌體后超聲波破碎，離心(13 400 r/min，4℃，30 min)，收集上清，用Ni柱純化后轉(zhuǎn)入透析袋中冰上透析，用PEG2000吸去透析袋中部分水分以濃縮蛋白，測濃度后使用SDS-PAGE分析其純度，置于-80℃保存。

1.2.6 凝膠阻滯實驗 以WT基因組DNA為模板，PCR特異性擴(kuò)增ssrA、ssrB和spiC基因起始密碼子上游約500 bp的啟動子區(qū)域序列并純化，16 S DNA作為陰性對照(引物見表1)。已純化的His-OmpR蛋白溶液加入含20 mmol/L新鮮乙酰磷酸鹽的結(jié)合緩沖液，室溫孵育10 min使OmpR磷酸化，結(jié)合體系配制完成后，分別加入100 ng各基因啟動子區(qū)DNA片段，30℃溫育30 min后進(jìn)行6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴化乙啶染色后于凝膠成像儀顯影且分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

利用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OmpR對傷寒沙門菌巨噬細(xì)胞內(nèi)生存力的影響

為了研究OmpR對細(xì)菌巨噬細(xì)胞內(nèi)生存力的影響，使用WT-pBAD33、ΔompR-pBAD33和C-ΔompR菌株進(jìn)行THP-1胞內(nèi)生存力實驗。結(jié)果顯示，ΔompR-pBAD33在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存力相較于WT-pBAD33顯著降低，而C-ΔompR生存能力較ΔompR-pBAD33部分恢復(fù)(P<0.01，圖1)，說明ompR的缺失可使S. Typhi在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存能力下降。

a: P<0.05，b: P<0.01，與同時間點WT-pBAD33比較

2.2 OmpR對巨噬細(xì)胞內(nèi)生存力相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

選擇與巨噬細(xì)胞內(nèi)生存能力密切相關(guān)的SPI-2中3個操縱子的首基因ssrA、ssrB和spiC進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果顯示，ΔompR-pBAD33中ssrA、ssrB和spiC的mRNA水平較WT-pBAD33明顯降低(P<0.01)。進(jìn)一步利用β-半乳糖苷酶活性檢測實驗研究OmpR對ssrA、ssrB和spiC轉(zhuǎn)錄活性的影響，結(jié)果顯示，ΔompR中ssrA、ssrB和spiC的β-半乳糖苷酶活性比WT明顯降低(P<0.01)。見圖2。以上結(jié)果表明，OmpR正向調(diào)控ssrA、ssrB和spiC的轉(zhuǎn)錄。

a:P<0.05，b:P<0.01，與WT-pBAD33比較

圖2 qRT-PCR和β-半乳糖苷酶活性實驗檢測ssrA、ssrB和spiC的mRNA水平

2.3 OmpR蛋白的表達(dá)及純化

為了獲得OmpR蛋白，使用BL21表達(dá)菌株表達(dá)His-OmpR蛋白。如圖3所示，經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后，His-OmpR蛋白的表達(dá)量較未誘導(dǎo)明顯增加，并且在上清液中有His-OmpR蛋白的存在，說明表達(dá)了可溶性的蛋白；經(jīng)Ni柱純化后，只有單一的目的條帶，說明去除了其他非目的蛋白；進(jìn)一步經(jīng)濃縮后，使用相同體積的蛋白樣進(jìn)行SDS-PAGE，條帶明顯加深，說明蛋白濃度明顯增加，達(dá)到了濃縮的目的。

M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物

2.4 OmpR蛋白與巨噬細(xì)胞內(nèi)生存力相關(guān)基因的相互作用

利用凝膠阻滯實驗檢測His-OmpR蛋白與ssrA、ssrB和spiC基因啟動子區(qū)域的相互作用。如圖4所示：His-OmpR與ssrA、ssrB和spiC的啟動子區(qū)域均有結(jié)合，且兩者的結(jié)合均呈現(xiàn)劑量依賴性。以上結(jié)果表明，OmpR蛋白能直接與ssrA、ssrB和spiC的啟動子區(qū)域結(jié)合來調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)。

16S DNA：陰性對照，1～8泳道分別加入濃度依次遞增的蛋白

圖4ssrA、ssrB和spiC的凝膠阻滯實驗

3 討論

S. Typhi是常見的腸道致病菌，可感染人體消化系統(tǒng)進(jìn)而侵入淋巴系統(tǒng)引起全身癥狀[7]。S. Typhi感染人體后能夠逃避免疫系統(tǒng)的殺傷，在被巨噬細(xì)胞吞噬后仍然能夠存活且具有復(fù)制能力[8]。

S. Typhi在吞噬細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制是由SPI-2控制，SPI-2編碼的T3SS-2在巨噬細(xì)胞內(nèi)起作用。T3SS可將效應(yīng)蛋白穿過吞噬體膜輸送至宿主細(xì)胞的胞質(zhì)中，對細(xì)菌在真核細(xì)胞內(nèi)的存活有著重要作用[9]。目前認(rèn)為，參與SPI-2基因表達(dá)調(diào)控的雙組分系統(tǒng)共有3套：EnvZ/OmpR、SsrA/SsrB和PhoP/PhoQ。SsrA/SsrB中的反應(yīng)調(diào)節(jié)因子SsrB可激活SPI-2結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)[10]。SpiC蛋白(也稱為SsaB蛋白)是由SPI-2編碼的含127個氨基酸的蛋白質(zhì)。SpiC蛋白作為T3SS2的效應(yīng)蛋白，既可介導(dǎo)其他效應(yīng)器的分泌，也能通過干擾宿主Hook3和(或)Tassc蛋白的活性，抑制含沙門氏菌的噬菌體與溶酶體和吞噬體的融合。spiC突變體無法在巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，并且對小鼠的毒力減弱[11]。OmpR調(diào)節(jié)蛋白在ssrA和ssaB的基因區(qū)域富集，說明OmpR與SPI-2之間有著復(fù)雜的聯(lián)系[12]。本文選擇SPI-2中3個操縱子的首基因ssrA、ssrB和spiC，通過qRT-PCR和β-半乳糖苷酶活性實驗發(fā)現(xiàn) OmpR可促進(jìn)這些基因的轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步的EMSA實驗顯示，磷酸化的OmpR可直接與ssrA、ssrB和spiC基因啟動子區(qū)域結(jié)合。綜上所述，OmpR能夠直接調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞內(nèi)生存力相關(guān)基因ssrA、ssrB和spiC的表達(dá)，從而增強(qiáng)S. Typhi在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存能力。此研究為進(jìn)一步探討OmpR的功能及相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。