鄧之奎， 朱偉

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 淮安市第一人民醫(yī)院血液科實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 淮安 223300)

近年來，隨著化療、造血干細(xì)胞移植、免疫治療、分子靶向治療等技術(shù)的進(jìn)步，急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者大多能獲得完全緩解，標(biāo)準(zhǔn)的一線誘導(dǎo)化療方案能夠使60%～80%的年輕患者以及40%～60%的老年患者獲得緩解，然而，仍有60%的患者緩解后面臨復(fù)發(fā)的風(fēng)險[1]。耐藥是AML患者治療失敗、生存率低的關(guān)鍵因素[2]，然而AML耐藥的確切機(jī)制尚不完全明確。近年來，AML耐藥機(jī)制的研究主要集中在耐藥相關(guān)蛋白及酶異常、基因突變、miRNAs的改變以及耐藥相關(guān)信號通路的異?；罨痆3]。本研究以AML患者骨髓單個核細(xì)胞(BMMNC)以及AML細(xì)胞系為研究對象，探討miR-155-5p對AML細(xì)胞凋亡的影響及可能機(jī)制，為臨床克服AML患者化療耐藥、提高療效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 BMMNC采集

收集本院2016年1月至2018年12月43例AML患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照WHO急性白血病臨床分型(2016)，所有患者均經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫分型、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子學(xué)(MICM)確診?；颊叩闹形荒挲g36(18～75)歲，男24例，女19例。采用Ficoll密度梯度離心法分離出BMMNC，分裝至1.5 mL EP管內(nèi)(每管細(xì)胞數(shù)約1×106)，保存于-80 ℃低溫冰箱。對照組為21例缺鐵性貧血患者。標(biāo)本采集經(jīng)淮安市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得患者本人知情同意。

1.2 細(xì)胞系及培養(yǎng)

HL-60、THP-1細(xì)胞系購于美國ATCC細(xì)胞庫(美國Virginia公司)，用含有10%胎牛血清、100 mg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)于37℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48～72 h換培養(yǎng)液1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 試劑

Bcl-2抗體(美國Proteintech公司)；NF-κB(p65)抗體、β-肌動蛋白抗體、羊抗鼠IgG-HRP抗體、羊抗兔IgG-HRP抗體(美國Cell signaling Technology公司)；ECL檢測發(fā)光試劑盒(美國Bioworld Technology公司)；細(xì)胞凋亡試劑盒(德國MiltenyiBiotec公司)；總蛋白提取試劑盒(南京諾唯贊公司)；qRT-PCR相關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增試劑盒(中國Vazyme公司)；PVDF膜(中國凱基生物科技有限公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁生物科技有限公司)；miR-155-5p轉(zhuǎn)染試劑盒(上海生工生物科技有限公司)。

1.4 qRT-PCR檢測BMMNC中miR-155-5p和Bcl-2 mRNA的表達(dá)

Trizol法提取BMMNC的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，Oligo引物及逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。miR-155-5p特異引物為5′-TTAATGCTAATCGTGATAGGGGT-3′；Bcl-2上游引物為5′-CCCCACAGTCTACTGTAAG-3′，下游引物為5′-GCATTGCCGATGGTACTGATT-3′；β-肌動蛋白上游引物為5′-GGCATCGTGATGGACTCCG-3′，下游引物為5′-GCTGGAAGGTGGACAGCGA-3′。定量PCR(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司7300擴(kuò)增儀)反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 3 min，95℃ 30 s，40個循環(huán)，62℃ 40 s。擴(kuò)增結(jié)果以β-肌動蛋白作為內(nèi)參基因，采用ΔΔCt法計(jì)算相對定量。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

miR-155-5p類似物：5′-GAUAGUUCGGUGUGCACA-3′,miR-155-5p類似物對照:5′-AUGGUCGUUAAGCCAGUG-3′；miR-155-5p抑制劑：5′-CGGAUAUGUGCAGUGCUA-3′,miR-155-5p 抑制劑對照：5′-AGGCAGUGUCGUCAAUUG-3′。依據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，取對數(shù)生長期的HL-60、THP-1細(xì)胞分別接種于6孔板，次日細(xì)胞匯合度達(dá)30%～50%時，加入混勻后的脂質(zhì)體2000和miR-155-5p類似物或抑制劑，室溫孵育30 min，置于37℃、5%CO2的孵育箱中轉(zhuǎn)染6 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，方法同步驟“1.4”。

1.6 CCK-8法檢測HL-60和THP-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的活性

取轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期的HL-60、THP-1細(xì)胞，以4×104/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積為100 μL。加入不同濃度的化療藥物阿糖胞苷(終濃度為0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64和1.28 μg/mL)，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育48 h，棄去上清液，每孔中加入100 μL PBS和10 μL的WST-8試劑，避光37℃溫箱孵育2 h后用酶標(biāo)儀檢測光密度(D)值，檢測波長為480 nm。每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測HL-60和THP-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡率

將轉(zhuǎn)染后的HL-60、THP-1細(xì)胞以每孔1×105個的密度接種于6孔板中，各設(shè)3個復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，加入阿糖胞苷(0.16 μg/mL)處理48 h后，用酶消化法收集細(xì)胞于1.5 mL EP管中，1 000 r/min離心10 min，PBS洗滌1次，每管加入200 μL結(jié)合液、5 μL Annexin V試劑和10 μL PI試劑，避光室溫孵育10 min后置于冰上。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.8 qRT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染miR-155-5p抑制劑后HL-60和THP-1細(xì)胞NF-κB、Bcl-2的mRNA表達(dá)

Trizol法提取轉(zhuǎn)染miR-155-5p抑制劑后HL-60和THP-1細(xì)胞的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，Oligo引物及逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。NF-κB上游引物為5′-CCTATGTGGAGATCATTGAGCA-3′，下游引物為5′-CAAAGATGGGATGAGAAAGGAC-3′；Bcl-2上游引物為5′-CCCCACAGTCTACTGTAAG-3′，下游引物為5′-GCATTGCCGATGGTACTGATT-3′；β-肌動蛋白上游引物為5′-GGCATCGTGATGGACTCCG-3′，下游引物為5′-GCTGGAAGGTGGACA GCGA-3′。定量PCR(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司7300擴(kuò)增儀)反應(yīng)體系：上下游引物各1 μL、Taq DNA聚合酶12.5 μL、模板cDNA 2 μL、去離子水8.5 μL，總反應(yīng)體系25 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min，94℃ 30 s，66℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個循環(huán)，72℃ 5 min。擴(kuò)增結(jié)果以β-肌動蛋白作為內(nèi)參基因，采用ΔΔCt法計(jì)算相對定量。

1.9 蛋白質(zhì)印跡法檢測轉(zhuǎn)染miR-155-5p抑制劑后HL-60和THP-1細(xì)胞NF-κB、Bcl-2的蛋白表達(dá)

6孔板每孔用1 mL PBS洗滌1次，置于冰上，每孔加入70 μL含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，細(xì)胞刮刀順同一方向?qū)⑥D(zhuǎn)染miR-155-5p抑制劑后的AML細(xì)胞輕輕刮下，吸取每孔中的蛋白裂解液至1.5 mL EP管中，振蕩器振蕩混勻1 min，置于冰上10 min后繼續(xù)振蕩1 min，重復(fù)3次，4℃、12 000×g離心15 min后吸取上清液至新EP管中，按照4 ∶1的比例加入5×上樣緩沖液，水浴煮沸8 min，-20℃短期保存。取50 μg蛋白質(zhì)為上樣量，先經(jīng)80 V恒壓電泳，當(dāng)?shù)鞍走M(jìn)入積層膠時將電壓調(diào)至100 V恒壓電泳，待蛋白跑至膠底部后以350 mA恒流電轉(zhuǎn)2 h，將PVDF膜浸于5%脫脂牛奶中封閉1 h，分別加入一抗(NF-κB、Bcl-2、β-肌動蛋白，稀釋比例1 ∶1 000)，4℃孵育過夜。次日以TBST洗滌3次，每次10 min，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(稀釋比例1 ∶2 000)，37 ℃溫育1 h，最后，加入Millipore的曝光液(A液和B液按1 ∶1的比例混合)，采用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-155-5p、Bcl-2在AML患者BMMNC中高表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示AML患者較缺鐵性貧血患者BMMNC的miR-155-5p和Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯升高(圖1)。

圖1 miR-155-5p、Bcl-2在AML患者BMMNC中高表達(dá)

2.2 miR-155-5p對阿糖胞苷處理的HL-60和THP-1細(xì)胞活性和凋亡的影響

HL-60細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-155-5p類似物或抑制劑后，qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率，miR-155-5p表達(dá)較對照組有明顯差異(F=124.7，P<0.01)，見圖2A。CCK-8及流式檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-155-5p類似物的HL-60細(xì)胞經(jīng)阿糖胞苷處理后細(xì)胞活性較對照組增加，細(xì)胞凋亡率明顯減少(t=6.806,P<0.01)；而轉(zhuǎn)染miR-155-5p抑制劑組細(xì)胞活性降低，凋亡率明顯增加(t=3.790,P<0.01)，見圖2B、C。qRT-PCR檢測THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-155-5p類似物或抑制劑轉(zhuǎn)染效率，miR-155-5p表達(dá)較對照組有明顯差異(F=295.3，P<0.01)，見圖3A。阿糖胞苷處理后轉(zhuǎn)染miR-155-5p類似物的THP-1細(xì)胞活性增強(qiáng)，凋亡率減少(t=4.487,P<0.01)；轉(zhuǎn)染miR-155-5p抑制劑的THP-1細(xì)胞活性降低，凋亡率增加(t=16.01,P<0.01)，見圖3B、3C。

圖2 miR-155-5p對阿糖胞苷處理的HL-60細(xì)胞活性和凋亡的影響

圖3 miR-155-5p對阿糖胞苷處理的THP-1細(xì)胞活性和凋亡的影響

2.3 抑制miR-155-5p后HL-60和THP-1細(xì)胞NF-κB、Bcl-2表達(dá)減少

qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，HL-60細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-155-5p抑制劑后，NF-κB、Bcl-2在mRNA水平與蛋白水平的表達(dá)均下降(P均<0.05)，見圖4A、4B。用THP-1細(xì)胞重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證也發(fā)現(xiàn)同樣的結(jié)果(P均<0.05)，見圖4C、4D。表明miR-155-5p可能通過上調(diào)NF-κB、Bcl-2抑制AML細(xì)胞凋亡。

圖4 抑制miR-155-5p對HL-60、THP-1細(xì)胞NF-κB、Bcl-2表達(dá)的影響

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)miRNAs主要通過調(diào)控DNA損傷、細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡等介導(dǎo)腫瘤耐藥[4-6]。研究表明，miR-155在多種腫瘤組織中表達(dá)異常，并與臨床病理標(biāo)志物、腫瘤分型和較低的存活率相關(guān)，能夠介導(dǎo)多種信號通路，包括NF-κB信號通路，NF-κB可直接結(jié)合miR-155的啟動子調(diào)控miR-155的表達(dá)。miR-155參與多種生理學(xué)過程，包括造血細(xì)胞分化、免疫反應(yīng)、炎癥以及腫瘤治療耐藥[7-8]。miR-155在多種實(shí)體腫瘤的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，Bayraktar等[7]通過對乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌6個實(shí)體腫瘤的540個樣本的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-155的表達(dá)在乳腺癌、肺癌和結(jié)腸癌樣本中上調(diào)，并可促進(jìn)包括乳腺癌和肺癌在內(nèi)的幾種癌癥的腫瘤細(xì)胞生長、細(xì)胞遷移、侵襲以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

miR-155除了在實(shí)體瘤的發(fā)生及耐藥中發(fā)揮重要作用外，也參與多種血液腫瘤的發(fā)病及耐藥。miR-155是血液系統(tǒng)腫瘤最具有特征性的致癌miRNA，包括彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤、濾泡淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病、霍奇金淋巴瘤、合并FLT3-ITD基因突變的AML[9-12]。高表達(dá)的miR-155可以顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞活性，同時降低白血病細(xì)胞對化療藥物的敏感性[7]。研究證實(shí)miR-155在成人與兒童AML中高表達(dá)，特別是FLT3-ITD突變的AML，且高表達(dá)miR-155的AML患者預(yù)后較差[13]。本研究通過分析AML患者臨床樣本發(fā)現(xiàn)miR-155-5p、Bcl-2在AML患者BMMNC中表達(dá)明顯增高。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-155-5p在AML細(xì)胞生長及凋亡中的作用，在AML細(xì)胞系中，分別轉(zhuǎn)染miR-155-5p類似物與miR-155-5p抑制劑，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-155-5p類似物組細(xì)胞活性增加、凋亡減少，而轉(zhuǎn)染miR-155-5p抑制劑組細(xì)胞活性降低、凋亡增加，提示miR-155-5p可以提高AML細(xì)胞活性、抑制其凋亡。同時，在轉(zhuǎn)染miR-155-5p抑制劑的AML細(xì)胞中，NF-κB、Bcl-2的mRNA和蛋白水平表達(dá)均降低，提示miR-155-5p促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，并抑制AML細(xì)胞凋亡。

綜上，本研究結(jié)果顯示miR-155-5p、Bcl-2在AML患者BMMNC中高表達(dá)，在AML細(xì)胞中miR-155-5p可以促進(jìn)AML細(xì)胞對阿糖胞苷的抗性、抑制其凋亡，miR-155-5p可能通過促進(jìn)NF-κB、Bcl-2的表達(dá)抑制AML細(xì)胞凋亡。因此，miR-155-5p或可作為提高AML治療效果的分子靶標(biāo)。