韓田田， 孟紅霞， 趙康容， 孫愛(ài)琴， 楊萬(wàn)年， 邵根寶

(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

二甲雙胍是治療2型糖尿病的一線藥物[1]。近來(lái)研究表明，二甲雙胍具有抗癌、免疫調(diào)節(jié)和抗衰老作用[2]。有文獻(xiàn)報(bào)道二甲雙胍可以抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移[3]。然而，其具體機(jī)制仍未闡明。賴(lài)氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1(lysine specific demethylase 1，LSD1)是第一個(gè)鑒定出的組蛋白去甲基化酶，其通過(guò)對(duì)單甲基化和二甲基化的組蛋白H3第4位賴(lài)氨酸(H3K4me1/2)去甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄[4]。LSD1在多種腫瘤中呈高表達(dá)，如卵巢癌[5]、肺癌[6]、乳腺癌[7]和胃癌[8]等，其過(guò)表達(dá)與患者生存率呈負(fù)相關(guān)[9]。臨床已將LSD1確定為癌癥治療靶標(biāo)[10]。關(guān)于抑制LSD1表達(dá)對(duì)于卵巢癌的靶向治療影響尚不清楚。本研究擬通過(guò)免疫印跡檢測(cè)二甲雙胍抑制LSD1蛋白表達(dá)和PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)，并進(jìn)一步敲低LSD1，觀察其在二甲雙胍抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移中的作用。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)

卵巢上皮癌HO8910和SKOV3細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存；多西環(huán)素誘導(dǎo)型穩(wěn)定敲低LSD1的HO8910和SKOV3細(xì)胞株(HO8910-shLSD1和SKOV3-shLSD1)是用pLKO-Tet-puro慢病毒誘導(dǎo)型載體構(gòu)建，參考文獻(xiàn)[11]。HO8910和SKOV3細(xì)胞在含有10%胎牛血清的高糖DMEM中，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 抗體和試劑

兔單克隆抗體LSD1、凋亡抑制蛋白(Survivin)、組蛋白H3、組蛋白H3第4位賴(lài)氨酸二甲基化(H3K4me2)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/AKT)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、E-鈣黏蛋白、波形蛋白和鋅指轉(zhuǎn)錄蛋白(Snail)均為美國(guó)Cell Signaling 公司產(chǎn)品；兔單克隆抗體β-微管蛋白(美國(guó)Bioworld公司)；兔單克隆抗體P21(美國(guó)Abcam公司)；HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體、總RNA抽提試劑盒(上海Sangon公司)；二甲雙胍(北京索萊寶公司)；多西環(huán)素(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(5-Ethyny1-2′-deoxyuridine，EdU)檢測(cè)試劑盒(廣東銳博公司)；Transwell小室(美國(guó)Corning公司)；2×SYBR Green PCR預(yù)混液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)；ECL顯影試劑(上海碧云天公司)。

1.3 EdU染色法檢測(cè)不同濃度二甲雙胍處理后細(xì)胞的增殖能力

取HO8910和SKOV3兩種卵巢癌細(xì)胞株，每種細(xì)胞以5×103個(gè)/孔密度接種于96孔板，按二甲雙胍不同處理濃度(0、5、10和20 mmol/L)分為4組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后細(xì)胞貼壁，嚴(yán)格按照EdU檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，EdU綠色熒光代表正處于DNA復(fù)制期的細(xì)胞，DAPI熒光代表所有的活細(xì)胞。顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞增殖率(%)=EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/所有活細(xì)胞×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)二甲雙胍處理和敲低LSD1后卵巢癌細(xì)胞的增殖能力

取HO8910-shLSD1和SKOV3-shLSD1兩種細(xì)胞株，每種細(xì)胞分為對(duì)照組、二甲雙胍處理組和敲低LSD1組，分別予以PBS，10 mmol/L二甲雙胍，100 ng/mL多西環(huán)素處理48 h。采用EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。具體實(shí)驗(yàn)操作方法同“1.3”。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

取“1.3”和“1.4”分組細(xì)胞，制備成不含血清的細(xì)胞懸液，每個(gè)Transwell小室上室接種2×104個(gè)細(xì)胞，Transwell下室加入500 μL含血清的DMEM。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h；用棉簽擦拭膜表面未遷移的細(xì)胞；4%低聚甲醛固定30 min；室溫下用0.1%結(jié)晶紫染色20 min。顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野細(xì)胞，拍照并計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)LSD1 mRNA表達(dá)水平

取“1.3”分組細(xì)胞，嚴(yán)格按照RNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞RNA，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。LSD1引物序列：上游，5′-CAAGTGTCAATTTGTTCGGG-3′；下游，5′-TTCTTTGGGCTGAGGTACTG-3′；GAPDH引物序列：上游，5′-GCAAATTCCATGGCACCGTC-3′，下游，5′-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3′，以GAPDH為內(nèi)參。PCR擴(kuò)增條件： 95 ℃初始變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。基因的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 免疫印跡檢測(cè)LSD1、增殖相關(guān)蛋白、遷移相關(guān)蛋白及PI3K/AKT通路蛋白的表達(dá)

取“1.3”和“1.4”分組細(xì)胞，PBS洗2次，用含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液裂解細(xì)胞30 min；4℃行12 000×g離心15 min，上清液即為蛋白樣品。將蛋白樣品行10% SDS-PAGE，80 V電壓30 min，110 V電壓100 min；300 mA恒流130 min轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入一抗和β-微管蛋白于4℃搖床孵育過(guò)夜；次日TBST洗滌3遍，每次8 min；加入二抗室溫反應(yīng)1 h；ECL顯影，用Image J軟件定量，與內(nèi)參β-微管蛋白比較。一抗LSD1、Survivin、P21、組蛋白H3、H3K4me2、E-鈣黏蛋白、波形蛋白、Snail、PI3K、p-AKT、AKT稀釋比均為1 ∶1 000、β-微管蛋白稀釋比為1 ∶5 000；二抗稀釋比為1 ∶5 000。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍抑制卵巢癌細(xì)胞增殖

EdU結(jié)果顯示，與0 mmol/L組相比，卵巢癌HO8910細(xì)胞和SKOV3細(xì)胞5、10、20 mmol/L組細(xì)胞增殖率顯著降低(P均<0.01)，二甲雙胍處理組細(xì)胞增殖受到明顯抑制，呈濃度依賴(lài)性。見(jiàn)圖1。免疫印跡結(jié)果顯示，與0 mmol/L組相比，HO8910和SKOV3細(xì)胞中10、20 mmol/L組Survivin 表達(dá)顯著降低(P<0.01或P<0.05)，P21表達(dá)顯著升高(P均<0.01)。見(jiàn)圖2。

a：P<0.01，與0 mmol/L組比較

a：P<0.01，b：P<0.05，與0 mmol/L組比較

2.2 二甲雙胍抑制卵巢癌細(xì)胞遷移

遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與0 mmol/L組相比，HO8910細(xì)胞和SKOV3細(xì)胞中5、10、20 mmol/L組細(xì)胞遷移數(shù)均顯著減少(P均<0.01)，二甲雙胍處理組細(xì)胞遷移受到明顯抑制，呈濃度依賴(lài)。見(jiàn)圖3。免疫印跡結(jié)果顯示，HO8910細(xì)胞中，與0 mmol/L組相比，5、10、20 mmol/L組E-鈣黏蛋白表達(dá)顯著升高(P均<0.01)，波形蛋白和Snail表達(dá)顯著降低(P均<0.01)。SKOV3細(xì)胞中，與0 mmol/L組相比，10、20 mmol/L組E-鈣黏蛋白表達(dá)顯著升高(P均<0.01)，波形蛋白和Snail表達(dá)顯著降低(P均<0.01)。見(jiàn)圖4。

a：P<0.01，與0 mmol/L組比較

a：P<0.01，與對(duì)照組比較

2.3 二甲雙胍下調(diào)LSD1蛋白表達(dá)

免疫印跡結(jié)果顯示，隨著二甲雙胍濃度升高，HO8910細(xì)胞和SKOV3細(xì)胞中5、10、20 mmol/L組LSD1蛋白表達(dá)水平較0 mmol/L組明顯降低(P<0.05或P<0.01)，其底物H3K4me2蛋白表達(dá)水平明顯升高(P均<0.01)。見(jiàn)圖5。qRT-PCR結(jié)果顯示，與0 mmol/L處理組相比，HO8910和SKOV3細(xì)胞中5、10、20 mmol/L處理組LSD1 mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P均>0.05)。見(jiàn)圖6。

2.4 二甲雙胍抑制PI3K/AKT信號(hào)通路

免疫印跡結(jié)果顯示，隨著二甲雙胍濃度升高，HO8910和SKOV3細(xì)胞中5、10、20 mmol/L組p-AKT 和PI3K 蛋白表達(dá)均較0 mmol/L組明顯降低(P均<0.01)。見(jiàn)圖7。

a：P<0.05，b：P<0.01，與0 mmol/L組比較

圖6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)不同濃度二甲雙胍處理后各組細(xì)胞LSD1 mRNA水平

2.5 二甲雙胍處理和敲低LSD1均抑制細(xì)胞增殖

EdU結(jié)果顯示，HO8910-shLSD1細(xì)胞和SKOV3-shLSD1細(xì)胞中對(duì)照組細(xì)胞增殖率均顯著高于二甲雙胍處理組和敲低LSD1組(P均<0.01)。見(jiàn)圖8。免疫印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HO8910-shLSD1細(xì)胞和SKOV3-shLSD1細(xì)胞中二甲雙胍處理組和敲低LSD1組Survivin表達(dá)顯著降低(P均<0.01)，P21表達(dá)顯著升高(P均<0.01)。見(jiàn)圖9。

a：P<0.01，與0 mmol/L組比較

a：P<0.01，與對(duì)照組比較

a：P<0.01，與對(duì)照組比較

2.6 二甲雙胍處理和敲低LSD1均抑制細(xì)胞遷移

遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HO8910-shLSD1細(xì)胞和SKOV3-shLSD1細(xì)胞中對(duì)照組細(xì)胞遷移數(shù)均顯著高于二甲雙胍處理組和敲低LSD1組(P均<0.01)。見(jiàn)圖10。免疫印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HO8910-shLSD1細(xì)胞和SKOV3-shLSD1細(xì)胞中二甲雙胍處理組和敲低LSD1組E-鈣黏蛋白表達(dá)顯著升高(P均<0.01)，波形蛋白和Snail蛋白表達(dá)顯著降低(P均<0.01)。見(jiàn)圖11。

3 討論

本研究采用HO8910和SKOV3兩種卵巢癌細(xì)胞株，通過(guò)EdU實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)二甲雙胍抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移，PI3K/AKT/LSD1信號(hào)軸介導(dǎo)二甲雙胍對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移。

研究報(bào)道，卵巢癌患者經(jīng)二甲雙胍治療可降低疾病死亡率和復(fù)發(fā)率[12]。也有研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可改變卵巢癌細(xì)胞代謝并抑制腫瘤生長(zhǎng)[13]。另有研究表明，Survivin表達(dá)降低、P21表達(dá)升高代表腫瘤細(xì)胞增殖能力降低，E-鈣黏蛋白表達(dá)降低、波形蛋白和Snail表達(dá)升高代表腫瘤細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)[8]。本研究結(jié)果顯示二甲雙胍對(duì)卵巢癌HO8910和SKOV3細(xì)胞增殖和遷移具有抑制作用，且呈濃度依賴(lài)性。用不同濃度二甲雙胍處理HO8910和SKOV3細(xì)胞后，細(xì)胞增殖率明顯降低，且Survivin表達(dá)顯著升高，P21表達(dá)顯著降低。與0 mmol/L相比，細(xì)胞在二甲雙胍作用下遷移能力顯著降低，且E-鈣黏蛋白表達(dá)顯著降低，波形蛋白和Snail表達(dá)顯著升高。由此表明，二甲雙胍可以抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移。

a：P<0.01，與對(duì)照組比較

a：P<0.01 ，與對(duì)照組比較

關(guān)于二甲雙胍抗腫瘤作用的研究多集中于AMPK信號(hào)通路[14]。也有研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路影響細(xì)胞增殖[15]，但具體機(jī)制仍不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，LSD1在卵巢癌細(xì)胞中呈高表達(dá)[16]，其可通過(guò)多種作用方式調(diào)控卵巢癌的發(fā)生發(fā)展[9]。本研究結(jié)果顯示，HO8910和SKOV3細(xì)胞經(jīng)不同濃度二甲雙胍處理后，5、10、20 mmol/L組LSD1蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組逐漸降低，且呈濃度依賴(lài)性，其底物H3K4me2蛋白表達(dá)水平逐漸升高。由此表明，二甲雙胍可抑制卵巢癌細(xì)胞中LSD1蛋白表達(dá)以及LSD1去甲基化酶活性。我們之前的研究表明，LSD1受PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控[16]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度二甲雙胍處理細(xì)胞后，p-AKT和PI3K蛋白表達(dá)水平顯著降低，且呈濃度依賴(lài)性。由此表明，二甲雙胍可負(fù)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路，進(jìn)而抑制LSD1蛋白表達(dá)及其去甲基化酶活性。

研究表明，過(guò)表達(dá)LSD1可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖[16]。另有研究發(fā)現(xiàn)，LSD1介導(dǎo)的表觀遺傳修飾促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲[17]。為進(jìn)一步驗(yàn)證LSD1與二甲雙胍抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移的相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)采用誘導(dǎo)性穩(wěn)定敲低LSD1的細(xì)胞株檢測(cè)二甲雙胍處理和敲低LSD1后細(xì)胞的增殖和遷移能力。根據(jù)上述結(jié)果，選擇10 mmol/L二甲雙胍作為實(shí)驗(yàn)濃度。結(jié)果顯示，二甲雙胍處理和敲低LSD1后，細(xì)胞增殖率均顯著降低，且Survivin表達(dá)均顯著降低，P21表達(dá)均顯著升高。此外，E-鈣黏蛋白表達(dá)均顯著升高，波形蛋白和Snail表達(dá)均顯著降低。由此表明，二甲雙胍處理和敲低LSD1產(chǎn)生的作用相似，均顯著抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移，提示LSD1可能是二甲雙胍抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移的靶標(biāo)。

綜上所述，二甲雙胍在卵巢癌細(xì)胞中通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路及LSD1蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移。PI3K/AKT通路對(duì)LSD1的調(diào)控作用是否與表觀遺傳修飾有關(guān)仍要進(jìn)一步研究。