蔡曉杰， 王鳴， 高潔， 姜偉， 宋廉，張禮榮， 龔愛(ài)華， 朱海濤， 王冬青

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院影像科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

胰腺癌已經(jīng)成為僅次于肺癌的第二大癌癥致死腫瘤[1]，且導(dǎo)致胰腺癌惡性程度極高的主要原因是化療抵抗，而腫瘤微環(huán)境在胰腺癌治療抵抗中發(fā)揮重要的作用。低氧是胰腺癌微環(huán)境最重要的特點(diǎn)之一[2]。低氧及其誘導(dǎo)的低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)參與多種腫瘤靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的能量代謝、增殖和凋亡，是導(dǎo)致放化療誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的最重要抵抗因素[3-4]。因此，有效的逆轉(zhuǎn)低氧在腫瘤細(xì)胞死亡中的作用具有重要的意義。

鐵死亡是一種新型死亡模式，其本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化物的代謝障礙，進(jìn)而在鐵離子的催化下產(chǎn)生大量脂質(zhì)過(guò)氧化物，消耗抗氧化物，破壞細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，觸發(fā)細(xì)胞死亡[5]。已有研究表明鐵死亡誘導(dǎo)劑聯(lián)合吉西他濱可有效抑制胰腺癌的增殖，促進(jìn)細(xì)胞死亡[6]，但是這一聯(lián)合效應(yīng)卻仍可以被低氧及其誘導(dǎo)的HIF-1α所緩解[7]。二甲雙胍是調(diào)節(jié)細(xì)胞糖代謝的傳統(tǒng)藥物， 其可通過(guò)腺苷酸活化蛋白激酶-雷帕霉素靶蛋白(AMP-activated protein kinase/mammalian target of rapamycin，AMPK-mTOR)通路調(diào)控HIF-1α的表達(dá)[8]，同時(shí)也有研究提示雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)途徑抑制劑雷帕霉素能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞鐵死亡[9]。因此，本研究擬探討二甲雙胍能否通過(guò)抑制HIF-1α進(jìn)而逆轉(zhuǎn)低氧引起的腫瘤細(xì)胞鐵死亡抵抗效應(yīng)，為胰腺癌的化療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

人胰腺癌Patu8988細(xì)胞株 (中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所)；DMEM高糖培養(yǎng)基，PBS(美國(guó)Hyclone公司)；澳洲胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；二甲雙胍、Erastin、鐵死亡抑制劑ferrostatin-1、凋亡抑制劑ZVAD-FMK、壞死抑制劑necrosulfonamide(美國(guó)MedChemExpress公司)；兔抗人多克隆抗體HIF-1α(美國(guó)Abcam公司)；兔抗人單克隆抗體β-微管蛋白，兔抗人多克隆抗體p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)(美國(guó)Cell 公司)；羊抗兔二抗(美國(guó)Santa Cruz公司)；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Corning公司)；CCK8試劑盒(北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 常氧培養(yǎng)：Patu8988細(xì)胞培養(yǎng)在含10 %胎牛血清的高糖DMEM中，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。低氧培養(yǎng)：將細(xì)胞置于密封的低氧培養(yǎng)盒中，向低氧培養(yǎng)盒里充入低氧混合氣體(1% O2，5% CO2，94% N2，購(gòu)自南大恒通氣體廠)，持續(xù)充入10 min然后將低氧培養(yǎng)盒轉(zhuǎn)移到37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Patu8988細(xì)胞接種于96孔板，每孔5 000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔；次日細(xì)胞貼壁后，經(jīng)或不經(jīng)藥物處理，分別置于常氧和低氧培養(yǎng)條件下；待達(dá)到作用時(shí)間，配置CCK-8反應(yīng)溶液(90 μL無(wú)血清培養(yǎng)基+10 μL CCK-8試劑)；取出96孔板，每孔加入100 μL反應(yīng)溶液，同時(shí)設(shè)立空白組(只含DMEM)進(jìn)行校正；分別置于不同培養(yǎng)條件培養(yǎng)2 h；用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處各孔光密度(D)值。每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞活性=實(shí)驗(yàn)組-空白組/對(duì)照組-空白組。

1.2.2.1 常氧和低氧培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞的活性 將細(xì)胞接種于96孔板后置于常氧和低氧培養(yǎng)條件，分別在0、12、24、48 h時(shí)間點(diǎn)取出，加入CCK-8檢測(cè)各孔細(xì)胞活性。

1.2.2.2 經(jīng)不同濃度的Erastin處理不同時(shí)間后細(xì)胞的活性 用培養(yǎng)基將Erastin濃度稀釋為0、2.5、5、10、20 μmol/L，分別取100 μL與細(xì)胞共孵育；置于常氧和低氧培養(yǎng)條件，分別在0、12、24、48 h時(shí)間點(diǎn)取出，加入CCK-8檢測(cè)各孔細(xì)胞活性。

1.2.2.3 經(jīng)不同藥物分組處理后細(xì)胞的活性 細(xì)胞與各組藥物(對(duì)照組、10 μmol/L Erastin組、40 mmol/L二甲雙胍組、10 μmol/L Erastin+40 mmol/L二甲雙胍組、10 μmol/L Erastin+40 mmol/L二甲雙胍+1 μmol/L Ferrostatin組、10 μmol/L Erastin+40 mmol/L二甲雙胍+1 μmol/L ZVAD-FMK組、Erastin+40 mmol/L二甲雙胍+1 μmol/L necrosulfonamide組)在低氧條件下共孵育24 h后取出，加入CCK-8檢測(cè)各孔細(xì)胞活性。

1.2.2.4 經(jīng)不同濃度二甲雙胍處理后細(xì)胞的活性 用培養(yǎng)基將二甲雙胍濃度稀釋為0、20、40、80 mmol/L，分別取100 μL與細(xì)胞在低氧條件下共孵育24 h后取出，加入CCK-8檢測(cè)各孔細(xì)胞活性。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集Patu8988細(xì)胞，加入蛋白裂解液，提取總蛋白，100 ℃煮沸5 min；離心機(jī)12 000×g離心5 min，所得上清液即為蛋白樣品。以每個(gè)泳道20 μL蛋白樣品上樣，行10 % SDS-PAGE；將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；次日TBST洗膜3次，每次10 min；二抗37 ℃孵育1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；ECL發(fā)光試劑顯影，在凝膠成像系統(tǒng)上拍照并分析。一抗分別為兔抗人多克隆抗體HIF-1α，兔抗人多克隆抗體GPX4，兔抗人多克隆抗體p-AMPK， 兔抗人多克隆抗體AMPK，兔抗人多克隆抗體p-mTOR，兔抗人多克隆抗體mTOR，內(nèi)參為兔抗人單克隆抗體β微管蛋白(均為1 ∶1 000)；二抗為羊抗兔二抗(1 ∶10 000)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 低氧抑制胰腺癌細(xì)胞活性

與常氧組相比，低氧組Patu8988細(xì)胞活性降低，且低氧培養(yǎng)24、48 h細(xì)胞活性明顯低于常氧組(t=2.83、13.16，P<0.05)。見(jiàn)圖1。由此說(shuō)明低氧能夠抑制胰腺癌細(xì)胞活性。

a:P<0.05,與常氧組比較

2.2 低氧使得胰腺癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡抵抗

與對(duì)照組相比，不同濃度的鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin處理24 h后，常氧或低氧培養(yǎng)的Patu8988細(xì)胞的細(xì)胞活性均減低。在同一Erastin濃度處理?xiàng)l件下，與常氧組相比，低氧組Patu8988細(xì)胞活性高于常氧組。且當(dāng)Erastin濃度為10 μmol/L時(shí)，兩組間細(xì)胞活性存在最顯著的差異(t=3.51，P<0.05)。故選擇10 μmol/L 作為Erastin后續(xù)處理濃度。見(jiàn)圖2。

a：P<0.05，與常氧組比較

由圖3可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，Erastin分別處理常氧和低氧培養(yǎng)條件下的Patu8988細(xì)胞 12、24和48 h，Patu8988細(xì)胞的活性均減低。在同一培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)條件下，與常氧組相比，低氧組細(xì)胞的細(xì)胞活性高于常氧組，且在24 h差異最大(t=2.46，P<0.05)。由圖4可見(jiàn)，低氧條件下，Patu8988細(xì)胞中HIF-1α的蛋白表達(dá)水平呈一定的時(shí)間依賴性，在24 h時(shí)，蛋白表達(dá)水平最高(t=40.68，P<0.05)。由此可見(jiàn)，低氧條件下細(xì)胞HIF-1α表達(dá)變化與Erastin對(duì)細(xì)胞的活性變化存在一定的一致性。

a：P<0.05，與低氧組比較

a：P<0.05，與低氧0 h比較

2.3 二甲雙胍增敏低氧條件下Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡效應(yīng)

與對(duì)照組相比，低氧條件下Erastin，二甲雙胍均可抑制Patu8988細(xì)胞的活性。與單獨(dú)Erastin組相比，Erastin+二甲雙胍抑制作用更加顯著(t=58.45，P<0.01)。與聯(lián)合用藥組相比，外加鐵死亡特異性挽救劑Ferrostatin后，細(xì)胞明顯恢復(fù)活性(t=10.77，P<0.05)，而外加凋亡抑制劑ZVAD-FMK組和necrosulfonamide組與聯(lián)合組比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此說(shuō)明，聯(lián)合用藥是通過(guò)增強(qiáng)鐵死亡效應(yīng)來(lái)進(jìn)一步抑制細(xì)胞活性。見(jiàn)圖5。蛋白印跡顯示，單獨(dú)使用Erastin處理后GPX4蛋白水平降低，Erastin聯(lián)合二甲雙胍處理后與單獨(dú)Erastin組相比進(jìn)一步降低了GPX4蛋白水平(t=3.05，P<0.05)，同時(shí)抑制了HIF-1α的表達(dá)(t=10.95，P<0.05)。見(jiàn)圖6。進(jìn)一步說(shuō)明二甲雙胍可以逆轉(zhuǎn)低氧誘導(dǎo)的Patu8988細(xì)胞對(duì)鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin的抵抗。

a：P<0.01，與未經(jīng)藥物處理組比較；b：P<0.05，與Erastin+二甲雙胍組比較

圖5各組藥物作用24 h后對(duì)低氧下細(xì)胞活性的影響

a：P<0.01，與未經(jīng)藥物處理組比較； b: P<0.05，與Erastin組比較

2.4 低氧條件下二甲雙胍阻斷HIF-1α的積聚

在低氧條件下使用不同濃度的二甲雙胍作用于細(xì)胞24 h，圖7可見(jiàn)，隨二甲雙胍濃度遞增，細(xì)胞活性呈濃度依賴性降低。蛋白印跡結(jié)果顯示，二甲雙胍濃度遞增促進(jìn)了AMPK的磷酸化，同時(shí)抑制其下游的重要信號(hào)分子mTOR的磷酸化，進(jìn)而顯著降低了HIF-1α蛋白水平，見(jiàn)圖8。從而驗(yàn)證了AMPK-mTOR/HIF-1α信號(hào)通路在二甲雙胍抑制胰腺癌中發(fā)揮重要作用。

a：P<0.05，與0 mmol/L二甲雙胍處理組比較

a：P<0.05；b：P<0.01，與0 mmol/L二甲雙胍處理組比較

3 討論

鐵死亡是一種由鐵離子催化、多不飽和脂肪酸的過(guò)度氧化而誘導(dǎo)的一種新型細(xì)胞程序性死亡模式[5]。脂質(zhì)過(guò)氧化形成導(dǎo)致活性氧過(guò)度積累是誘發(fā)細(xì)胞鐵死亡的關(guān)鍵因素[9]。GPX4是鐵死亡發(fā)生的重要指標(biāo)，一旦失效，會(huì)造成膜脂上活性氧自由基的積累，引發(fā)鐵死亡。鐵死亡概念的提出為多種實(shí)體瘤的治療提出了新的理念[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯可誘導(dǎo)Kras突變的胰腺癌細(xì)胞鐵死亡[13]；聯(lián)合蓽撥明堿、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑CN-A 和柳氮磺胺吡啶可以有效地抑制胰腺癌的生長(zhǎng)，主要是通過(guò)誘導(dǎo)鐵死亡作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin可以誘導(dǎo)人胰腺癌Patu8988細(xì)胞鐵死亡，這與以往的報(bào)道一致[15]。雖然針對(duì)鐵死亡的研究有效地改善了腫瘤的抑制效應(yīng)，但是部分腫瘤仍具有鐵死亡抵抗的特征。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞可通過(guò)Prominin2 MVB外顯子鐵蛋白途徑抵抗鐵死亡[16]，也可以通過(guò)cadherin-NF2-Hippo-YAP通路負(fù)向調(diào)控鐵死亡[17]。盡管針對(duì)鐵死亡的抵抗機(jī)制做了深入的研究，但是絕大多數(shù)的研究都是基于細(xì)胞自身的因素。而微環(huán)境因素對(duì)腫瘤細(xì)胞鐵死亡的作用機(jī)制還不是十分明確。本研究結(jié)果提示低氧可以促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的鐵死亡抵抗。

低氧是胰腺癌腫瘤微環(huán)境的最重要特征之一。低氧通過(guò)激活HIF-1α調(diào)控多種信號(hào)分子，進(jìn)而影響腫瘤的放療、化療抵抗、轉(zhuǎn)移及腫瘤血管生成等生物學(xué)行為[3-4,18]。本研究發(fā)現(xiàn)，低氧條件下，人胰腺癌細(xì)胞對(duì)鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin抵抗性增強(qiáng)，呈一定的時(shí)間依賴性。且抵抗的時(shí)間依賴性與HIF-1α表達(dá)變化趨勢(shì)一致，提示HIF-1α在低氧胰腺癌中起著負(fù)向調(diào)控鐵死亡的作用。我們推測(cè)：細(xì)胞內(nèi)積累的HIF-1α抑制低氧引起的活性氧的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制活性氧積累引起的鐵死亡。這一效應(yīng)仍需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)證實(shí)。

二甲雙胍抗腫瘤得到了越來(lái)越多的關(guān)注。但是當(dāng)前二甲雙胍使用濃度遠(yuǎn)大于臨床治療濃度[19]，因此臨床轉(zhuǎn)化存在風(fēng)險(xiǎn)。如果能夠?qū)⒍纂p胍和其他抑癌藥物聯(lián)合使用，可以有效地降低二甲雙胍的使用濃度。二甲雙胍抗腫瘤機(jī)制之一是通過(guò)激活A(yù)MPK抑制mTOR從而抑制上述HIF-1α的表達(dá)[20]。我們的研究結(jié)果證實(shí)，低氧條件下在Patu8988細(xì)胞中隨二甲雙胍濃度遞增AMPK激活，mTOR磷酸化受到抑制，HIF-1α表達(dá)也隨之下調(diào)。同時(shí)，聯(lián)用二甲雙胍和鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin與單獨(dú)用Erastin組比，有效地減少了HIF-1α的聚集，降低了GPX4的表達(dá)，增強(qiáng)了鐵死亡效應(yīng)。低氧條件下二甲雙胍逆轉(zhuǎn)鐵死亡抵抗的示意圖概述見(jiàn)圖9。

圖9 低氧下二甲雙胍逆轉(zhuǎn)鐵死亡抵抗原理示意圖

然而在上述過(guò)程中二甲雙胍對(duì)HIF-1α的抑制是否主要由AMPK-mTOR途徑調(diào)控還有待于進(jìn)一步研究。 綜上所述，二甲雙胍可以通過(guò)AMPK-mTOR/HIF-1α信號(hào)通路減弱低氧引起的胰腺癌細(xì)胞對(duì)鐵死亡抵抗。