滕彩玲，鐘晰，吳昊娣，胡燕，周常勇，王雪峰

馬蜂柑響應(yīng)黃龍病菌不同侵染時(shí)期的生物學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

滕彩玲1，鐘晰1，吳昊娣1，胡燕2，周常勇1，王雪峰1

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所國家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶 400712；2贛州市果業(yè)局，江西贛州 341000）

【】柑橘黃龍?。℉uanglongbing，HLB）是制約柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大病害，我國發(fā)生的黃龍病由韌皮部桿菌亞洲種（‘Liberibacter asiaticus’，CLas）引起。本研究通過分析潛在耐黃龍病柑橘品種馬蜂柑（）在感染黃龍病后不同時(shí)期的生物學(xué)癥狀、顯微結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)差異，揭示馬蜂柑不同時(shí)期對黃龍病菌具有耐性的分子機(jī)理，為進(jìn)一步深入挖掘抗性基因及開展抗病育種打下基礎(chǔ)。以嫁接在兩年生卡里佐枳橙砧木上的馬蜂柑作為供試材料，使用只感染CLas、其他常見柑橘病毒類病原均呈陰性的毒源為接毒材料對馬蜂柑進(jìn)行接種，并在接種毒源后每隔15 d進(jìn)行定期的熒光定量PCR檢測。將馬蜂柑接種毒源4個(gè)月（最早檢測到CLas陽性）作為感病前期處理，接種毒源14個(gè)月作為感病后期處理，以健康植株為對照，進(jìn)行生物學(xué)癥狀和顯微結(jié)構(gòu)觀察，分析其感病后不同時(shí)期的結(jié)構(gòu)變化。結(jié)合比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析與熒光定量PCR驗(yàn)證，解析其耐病相關(guān)機(jī)制。癥狀觀察發(fā)現(xiàn)，馬蜂柑在感病前期和感病后期，植株葉片幾乎不顯癥；顯微結(jié)構(gòu)觀察表明，馬蜂柑在感病前期中脈組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞形態(tài)正常，無淀粉粒積累的現(xiàn)象，僅在后期出現(xiàn)韌皮部極少數(shù)的篩管被堵塞；對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行篩選鑒定，馬蜂柑感病前期共篩選鑒定到181個(gè)差異表達(dá)基因，感病后期共篩選鑒定到1 384個(gè)差異表達(dá)基因；比較轉(zhuǎn)錄組分析表明，馬蜂柑感病前期和后期的差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞壁代謝、防御反應(yīng)、淀粉與蔗糖代謝、胼胝質(zhì)合成以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面，其中在感病前期，淀粉與蔗糖代謝、細(xì)胞壁代謝相關(guān)的調(diào)控基因下調(diào)表達(dá)，在感病后期，水楊酸代謝及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、病程相關(guān)蛋白和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶相關(guān)的調(diào)控基因上調(diào)表達(dá)。馬蜂柑響應(yīng)CLas早期侵染主要表現(xiàn)為物理結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、淀粉合成和光合作用等途徑不受干擾；而水楊酸介導(dǎo)的抗性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、效應(yīng)蛋白觸發(fā)免疫反應(yīng)（effector-triggered immunity，ETI）激活的病程相關(guān)蛋白和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶參與的解毒作用是感病后期的主要耐病機(jī)制。

柑橘黃龍??；韌皮部桿菌亞洲種；馬蜂柑；耐病性；轉(zhuǎn)錄組

0 引言

【研究意義】柑橘黃龍?。℉uanglongbing，HLB）是柑橘生產(chǎn)上的一種毀滅性病害，能侵染幾乎所有的柑橘栽培品種[1]，造成植株經(jīng)濟(jì)壽命縮短，產(chǎn)量銳減，果品品質(zhì)變劣，并可在短期內(nèi)導(dǎo)致植株死亡，從而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。自1919年Reinking首次在我國潮汕地區(qū)發(fā)現(xiàn)黃龍病以來，該病在中國的發(fā)生已有100多年，目前世界范圍內(nèi)仍未研發(fā)出治療性的藥劑[3]。我國發(fā)生的柑橘黃龍病由韌皮部桿菌亞洲種（‘Liberibacter asiaticus’，CLas）引起，由于CLas純培養(yǎng)難題尚未攻克，病原致病機(jī)理尚不明確，極大程度地限制了病原生物學(xué)、病原-植物寄主互作及抗病基因工程育種的研究。以耐病品種馬蜂柑（）為研究材料，從生物學(xué)和轉(zhuǎn)錄水平上研究馬蜂柑響應(yīng)不同時(shí)期CLas侵染的應(yīng)答機(jī)制，可為抗/耐黃龍病常規(guī)和轉(zhuǎn)基因育種提供新思路。【前人研究進(jìn)展】解剖學(xué)和生物學(xué)研究表明感染CLas引起的癥狀與淀粉累積和韌皮部組織壞死相關(guān)[4-7]。對不同柑橘品種及其近緣屬對黃龍病的敏感性評價(jià)發(fā)現(xiàn)澳指檬（）、來檬（）、檸檬（）、枳（）等品種具有一定的抗/耐病性[8-10]。近年來，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)方法鑒定柑橘中黃龍病應(yīng)答基因已取得了較大進(jìn)展，柑橘感染黃龍病后，不同部位中的基因表達(dá)譜均已被解析[11-16]。CLas侵染后柑橘嫩葉、成熟葉和果實(shí)中的糖代謝和淀粉代謝相關(guān)基因的表達(dá)均受到了影響，其中葉片中蔗糖代謝和淀粉合成相關(guān)基因均被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，顯癥果實(shí)中蔗糖和棉子糖代謝相關(guān)基因被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，而淀粉合成相關(guān)基因被抑制表達(dá)[17-18]。光合作用相關(guān)基因在帶病根、莖、葉中均下調(diào)表達(dá)[19-20]，而在帶病果實(shí)中卻上調(diào)表達(dá)[10,21]。運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)或蛋白組學(xué)技術(shù)比較了不同敏感度柑橘品種的不同部位響應(yīng)CLas侵染后的差異，發(fā)現(xiàn)病菌侵染可導(dǎo)致柑橘蔗糖代謝[22]、淀粉代謝[17-18]、光合作用[19-21]、激素代謝[23-24]的平衡失調(diào)。CLas對寄主植物體內(nèi)糖類的偏好性分解利用（如果糖）會(huì)導(dǎo)致寄主糖類代謝平衡失調(diào)，糖類代謝的失衡可能導(dǎo)致染病植株呈現(xiàn)生理及病理方面的癥狀[18]。柑橘黃龍病帶病葉片的黃化癥狀與韌皮部堵塞和光合作用受抑制相關(guān)，而CLas侵染后寄主體內(nèi)淀粉累積和胼胝質(zhì)沉積是韌皮部堵塞的重要原因。淀粉累積的主要原因是淀粉分解過程受抑制[19]。感染CLas的柑橘中，茉莉酸（JA）和水楊酸（SA）的含量明顯高于未感染CLas的柑橘[25]。筆者實(shí)驗(yàn)室前期對耐病品種馬蜂柑和感病品種甜橙（）早期感染黃龍病進(jìn)行了比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)CLas侵染后甜橙的淀粉代謝和光合作用受到一定影響，但對馬蜂柑無顯著影響，馬蜂柑中細(xì)胞壁代謝的激活和部分抗病蛋白相關(guān)基因的高水平表達(dá)與其防御能力相關(guān)[26]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，在不同類型柑橘響應(yīng)黃龍病菌侵染的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組方面開展了大量研究，但尚無針對同一柑橘品種在感染黃龍病不同時(shí)期的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。因此，有必要將感病前期和后期的馬蜂柑進(jìn)行生物學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，進(jìn)一步了解感病不同時(shí)期馬蜂柑顯微結(jié)構(gòu)及基因表達(dá)的變化。【擬解決的關(guān)鍵問題】以對柑橘黃龍病具有一定耐性的馬蜂柑為材料，分別設(shè)置感病前期和感病后期兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)。通過生物學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)對兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行比較研究，觀察二者在相關(guān)代謝途徑和防御反應(yīng)上的差異，揭示馬蜂柑在感病前期和后期的不同耐病調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017—2019年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所國家柑桔工程技術(shù)研究中心完成。

1.1 供試毒源及苗木

黃龍病毒源：筆者實(shí)驗(yàn)室保存毒源采自江西贛州八鏡臺的琯溪蜜柚（cv. Guanximiyou）。該樣品中柑橘衰退病毒（，CTV）、柑橘碎葉病毒（Citrus tatter leaf virus，CTLV）、溫州蜜柑萎縮病毒（，SDV）、柑橘裂皮病類病毒（，CEVd）等常見柑橘病毒類病害檢測結(jié)果均呈陰性。試驗(yàn)苗木：馬蜂柑接穗嫁接于兩年生卡里佐枳橙（×）砧木，苗木放置于國家柑橘苗木脫毒中心溫室，溫度為（25±3）℃。試驗(yàn)處理：通過芽接的方式將毒源嫁接在試驗(yàn)苗木上，兩個(gè)月后每隔15 d進(jìn)行定期qPCR檢測。第一批次接種毒源傳毒并放置到14個(gè)月的馬蜂柑苗木作為感病后期處理；第二批次接種毒源并首次檢測到（約4個(gè)月）帶毒的馬蜂柑作為感病前期處理；同時(shí)期接種無毒琯溪蜜柚的植株作為健康對照。兩個(gè)時(shí)期分別選3株植株作為生物學(xué)重復(fù)，健康對照取2株作為生物學(xué)重復(fù)。

1.2 Spurr樹脂樣品制備及切片觀察

取感病前期和后期的馬蜂柑葉片及相應(yīng)的健康葉片的中脈，切取2 mm×1 mm大小置于1.5 mL離心管中；加入固定液，固定過夜；用鉀鹽緩沖液漂洗樣品；用不同梯度的丙酮溶液浸漬樣品去除樣品水分；加入Spurr樹脂與純丙酮溶液（體積比1﹕3）滲透，每4 h追加一次的Spurr樹脂，3次后純樹脂過夜；在包埋模中放上滲透好的樣品，加入純樹脂后，放入70℃恒溫箱中聚合過夜；得到樹脂樣品，切片染色觀察。

1.3 RNA提取及轉(zhuǎn)錄組建庫、測序

取感病前期、后期和健康植株的完全展開嫩葉，使用Trizol法提取總RNA。用Agilent RNA 6000 Nano試劑盒處理樣品后，利用NanoDrop One檢測總RNA樣品的純度，用Agilent 2100檢測總RNA樣品的濃度、28S/18S 以及RIN值。質(zhì)檢合格后的樣品用于文庫構(gòu)建，再利用BGISEQ-500平臺進(jìn)行雙末端測序，并進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)（深圳華大基因股份有限公司）。

1.4 序列分析

測序的原始數(shù)據(jù)去除低質(zhì)量、接頭污染和未知堿基N含量過高的reads后，得到clean reads，使用HISAT將clean reads比對到甜橙參考基因組序列（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/genome/10702）。使用Bowtie 2將clean reads比對到參考序列，再使用RSEM計(jì)算基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。使用PossionDis算法進(jìn)行差異基因檢測，參數(shù)為fold change（FC）≥2.00，-value ≤0.005，F(xiàn)DR≤0.001。差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG）功能分析，將差異表達(dá)基因通過Gene Ontology（GO）數(shù)據(jù)庫（http://www.geneontology. org/）進(jìn)行功能分類，同時(shí)基于NCBI mercator.results數(shù)據(jù)，利用MapMan軟件對差異基因進(jìn)行代謝途徑分析。

1.5 差異表達(dá)基因的RT-qPCR驗(yàn)證

選擇不同代謝途徑差異表達(dá)基因，同時(shí)選取在測序樣品中表達(dá)量一致的（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）作為內(nèi)參基因。以不同時(shí)期馬蜂柑葉片總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。利用GoTaq? qPCR Master Mix（Promega）熒光定量試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。使用Primer Premier 5.0 應(yīng)用軟件設(shè)計(jì)RT-qPCR引物，由深圳華大基因股份有限公司合成（表1）。利用Bio-Rad iQ5進(jìn)行2-ΔΔCT分析，并換算成log2FC，計(jì)算基因相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 馬蜂柑感染黃龍病前期、后期的生物學(xué)分析

觀察感染黃龍病前期（接種CLas 4個(gè)月，病原菌檢測陽性）和后期（接種CLas 14個(gè)月，病原菌檢測陽性）的馬蜂柑植株，發(fā)現(xiàn)馬蜂柑接種CLas后，未表現(xiàn)出明顯的黃龍病癥狀，生長也未受到顯著影響（圖1-A、1-B、1-C）。

表1 RT-qPCR基因及引物

通過光學(xué)顯微鏡觀察馬蜂柑健康和感病樣品的中脈組織發(fā)現(xiàn)，健康和感病樣品的大部分組織結(jié)構(gòu)都比較清晰，皮層薄壁細(xì)胞排列整齊，木質(zhì)部細(xì)胞大而疏松，韌皮部細(xì)胞排列緊密（圖1-D、1-E、1-F）。感病樣品的大多結(jié)構(gòu)無明顯異常，進(jìn)一步放大觀察可以發(fā)現(xiàn)感病前期樣品的韌皮部有極少數(shù)的篩管被堵塞，感病后期樣品篩管堵塞量比前期略多（圖1-H、1-I），未觀察到淀粉粒積累的現(xiàn)象。

2.2 差異表達(dá)基因及功能注釋

馬蜂柑感病前期，與健康對照相比，有149個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，32個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，共計(jì)出現(xiàn)181個(gè)差異表達(dá)基因；馬蜂柑感病后期，與健康對照相比，有386個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，998個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，共計(jì)出現(xiàn)1 384個(gè)差異表達(dá)基因。馬蜂柑感病前期與后期比較，有542個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，1 115個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，共計(jì)1 657個(gè)差異表達(dá)基因。

將差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分類，主要分為生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞組分（cell component，CC）三大類。對三大功能類單獨(dú)進(jìn)行進(jìn)一步的分類和富集，得到不同時(shí)期、不同類別差異表達(dá)基因富集最多的前5個(gè)GO分類。馬蜂柑感病前期，生物過程共富集差異基因63個(gè)，富集最多的GO分類是光合作用和信號過程等；分子功能共富集差異基因68個(gè)，富集最多GO分類是轉(zhuǎn)移酶活性和電子載體活性等；細(xì)胞組分共富集差異基因37個(gè)，富集最多的是膜和膜部分相關(guān)等；馬蜂柑感病后期，生物過程共富集差異基因536個(gè)，富集最多GO分類是多糖代謝過程和外部封裝結(jié)構(gòu)組織等；分子功能共富集差異基因623個(gè)，富集最多的是催化活性和轉(zhuǎn)移酶活性等；細(xì)胞組分共富集差異基因298個(gè)，富集最多是膜和膜部分等。

2.3 差異表達(dá)基因比較分析

利用MapMan軟件進(jìn)行Pageman分析，將馬蜂柑感染CLas后兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的差異表達(dá)基因代謝途徑富集可視化（圖2）。在馬蜂柑感染黃龍病前期，生物脅迫反應(yīng)和核苷酸代謝下調(diào)表達(dá)，蛋白質(zhì)降解（半胱氨酸蛋白酶）和LRR XII受體激酶上調(diào)表達(dá)；在馬蜂柑感染黃龍病后期，細(xì)胞壁相關(guān)、脂類代謝、過氧化物酶代謝、蛋白質(zhì)降解（天冬氨酸蛋白酶）和氨基酸代謝下調(diào)表達(dá)，生物脅迫、激素代謝（水楊酸和茉莉酸）、細(xì)胞色素P450、RNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控（MADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族和WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族）、蛋白質(zhì)降解（泛素相關(guān)）和受體激酶等代謝途徑上調(diào)表達(dá)。

為進(jìn)一步明確與耐病機(jī)制相關(guān)代謝途徑中差異基因表達(dá)的具體情況，利用Mapman軟件將馬蜂柑兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)感染黃龍病菌后的差異表達(dá)基因按功能進(jìn)行分類，差異基因主要集中在糖代謝、光合作用、細(xì)胞壁代謝、激素代謝、PR-蛋白、氧化還原反應(yīng)等代謝途徑。

2.3.1 淀粉和蔗糖代謝與光合作用相關(guān)差異基因的表達(dá)分析 CLas侵染寄主植物后，葉片出現(xiàn)黃化現(xiàn)象與CLas造成寄主植物葉片中淀粉過度累積進(jìn)而導(dǎo)致葉綠體分解有關(guān)。在馬蜂柑感病前期，與蔗糖分解有關(guān)的-呋喃果糖苷酶轉(zhuǎn)化酶A基因（）和己糖激酶基因（）均下調(diào)表達(dá)；淀粉合成途徑中，在馬蜂柑感病前期并未出現(xiàn)相關(guān)基因的差異表達(dá)。馬蜂柑感病后期，與蔗糖分解有關(guān)的蔗糖合酶基因（）和己糖激酶基因（）呈下調(diào)表達(dá)；淀粉合成途徑中，葡萄糖-1-磷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因（）下調(diào)表達(dá)（圖3-A）。

CLas的侵染在一定程度上抑制了馬蜂柑寄主的光合作用。馬蜂柑感病前期，與光系統(tǒng)Ⅱ相關(guān)的PsbD 和PsbC蛋白相關(guān)基因下調(diào)表達(dá)；感病后期，與光系統(tǒng)Ⅱ相關(guān)的PsbW和PsbP蛋白相關(guān)基因和多個(gè)捕光復(fù)合體II葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因（）均下調(diào)表達(dá)（圖3-B）。

A：健康植株Mock plants；B：感病前期CLas-infection at the early stage；C：感病后期CLas-infection at the late stage；D：健康對照葉中脈leaf midrib of healthy control；E：感病前期葉中脈CLas-infected leaf midrib at the early stage；F：感病后期的葉中脈CLas-infected leaf midrib at the late stage；G：D局部放大照片magnification of D；H：E局部放大照magnification of E；I：F局部放大照片magnification of F；Co：皮層細(xì)胞cortex；Fi：纖維細(xì)胞fiber；Ph：韌皮部phloem；Pi：髓心細(xì)胞pith；X：木質(zhì)部xylem；Sc：分泌腔secretory cavity；圖中箭頭所指的藍(lán)色斑點(diǎn)代表堵塞的篩管The blue spot indicated by arrow represents phloem plugging

CH-M-VS-CH-HLB-E：馬蜂柑染病前期與健康對照相比DEGs in CLas-infected C. hystrix at the early stagecompared withhealthy control； CH-M-VS-CH-HLB-L：馬蜂柑染病后期與健康對照相比DEGs in CLas-infected C. hystrix at the late stage compared withhealthy control。下同The same as below

彩色方塊代表上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的差異基因Colored squares indicate up- or down-regulated genes。圖4同The same as Fig. 4

2.3.2 細(xì)胞壁代謝相關(guān)差異基因的表達(dá)分析 在馬蜂柑感病前期，編碼與纖維素合成相關(guān)的類纖維素合酶C基因家族基因（）、類纖維素合成酶D基因家族基因（）和果膠酯酶合成相關(guān)的果膠酯酶抑制因子基因（）均下調(diào)表達(dá)。在馬蜂柑感病后期，細(xì)胞壁代謝相關(guān)基因均呈下調(diào)表達(dá)，且下調(diào)表達(dá)倍數(shù)較大，包括纖維素合成相關(guān)的類纖維素合酶A基因家族基因（纖維素合酶A基因（）和COBRA-like蛋白基因（）；半纖維素合成相關(guān)的半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1樣蛋白基因（）、木聚糖-葡糖醛酸糖基轉(zhuǎn)移酶基因（）、-1,4-木糖基轉(zhuǎn)移酶基因（）；細(xì)胞壁蛋白相關(guān)的簇狀阿拉伯膠原蛋白基因（）；細(xì)胞壁降解相關(guān)的木葡聚糖內(nèi)糖基酶基因（）、內(nèi)切葡聚糖酶基因（）、鼠李糖半乳糖酸裂解酶B基因）；細(xì)胞壁修飾相關(guān)的擴(kuò)張蛋白基因（、）、果膠酯酶基因（）和果膠酯酶抑制因子基因（）以及胼胝質(zhì)合成相關(guān)的胞間連絲與胼胝質(zhì)結(jié)合蛋白3基因（）和胼胝質(zhì)合成酶3基因（）（圖4）。

2.3.3 激素相關(guān)差異基因的表達(dá)分析 在馬蜂柑感病前期，茉莉酸途徑中，多個(gè)具有ZIM結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄抑制因子基因（）下調(diào)表達(dá)。在馬蜂柑感病后期，茉莉酸途徑中，與茉莉酸合成相關(guān)的脂氧合酶2基因（）上調(diào)表達(dá)、與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因（）下調(diào)表達(dá)；水楊酸途徑中，水楊酸合成相關(guān)的異分質(zhì)酸合成酶基因（）、水楊酸甲酯化相關(guān)的苯甲酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶基因（）均下調(diào)表達(dá)，水楊酸甲酯化相關(guān)的水楊酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶基因（）與水楊酸糖基化相關(guān)的病原菌誘導(dǎo)的UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因（）以及水楊酸下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的病程相關(guān)蛋白1基因（）均上調(diào)表達(dá)（圖4）。

2.3.4 免疫防御反應(yīng)相關(guān)差異基因的表達(dá)分析 在馬蜂柑感病前期，病原相關(guān)分子模式觸發(fā)的免疫反應(yīng)（PAMP-triggered immunity，PTI）系統(tǒng)中，與Ca2+-CaM信號系統(tǒng)相關(guān)的鈣依賴性蛋白激酶基因（）、鈣調(diào)蛋白基因（）、呼吸爆發(fā)氧化酶基因（）均表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，與識別相關(guān)的多個(gè)受體蛋白基因（）上調(diào)表達(dá)但下游相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子未出現(xiàn)差異表達(dá)；效應(yīng)蛋白觸發(fā)的免疫反應(yīng)（effector-triggered immunity，ETI）系統(tǒng)中，無相關(guān)基因的差異表達(dá)。而在馬蜂柑感病后期，PTI系統(tǒng)中，與Ca2+-CaM信號系統(tǒng)相關(guān)的環(huán)核苷酸門控通道蛋白基因（）的多個(gè)相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，鈣依賴性蛋白激酶基因（）、鈣調(diào)蛋白基因（）和呼吸爆發(fā)氧化酶基因（）輕微上調(diào)表達(dá)，與識別相關(guān)的多個(gè)受體蛋白基因（）上調(diào)表達(dá)且個(gè)數(shù)增多但下游相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子依舊未出現(xiàn)差異表達(dá)；ETI系統(tǒng)中，相關(guān)的抗病蛋白基因（1.8倍）（1.7倍）（2.1倍）出現(xiàn)了上調(diào)表達(dá)（圖4）。

2.3.5 病程相關(guān)蛋白與抗病相關(guān)基因的表達(dá)分析 在馬蜂柑感病前期，多個(gè)抗病蛋白基因被CLas誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)，主要是TMV抗性蛋白。而在感病后期，前期下調(diào)的TMV抗性蛋白基因表現(xiàn)出回升趨勢，同時(shí)也新增多個(gè)抗病蛋白基因的差異表達(dá)，上調(diào)表達(dá)的基因包括抗病性蛋白（CC-NBS-LRR類）家族基因的等，含NB-ARC結(jié)構(gòu)域抗病性蛋白基因的等；以及同時(shí)受SA和PTI調(diào)控的蛋白基因；屬于Kunitz家族胰蛋白酶和蛋白酶抑制劑蛋白的神秘果素樣蛋白基因（）和21 kD種子樣蛋白基因（）在馬蜂柑感病后期下調(diào)表達(dá)。在馬蜂柑感病后期，5個(gè)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶基因（）以及2個(gè)熱休克蛋白基因（）均上調(diào)表達(dá)（圖4）。

圖4 馬蜂柑感染黃龍病菌不同時(shí)期生物脅迫相關(guān)差異表達(dá)基因

2.4 RT-qPCR驗(yàn)證

從不同的基因功能分類中挑選了12個(gè)基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，10個(gè)基因RT-qPCR結(jié)果與RNA-seq測序結(jié)果的相對表達(dá)量變化趨勢基本保持一致，證明RNA-seq測序結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性。其中細(xì)胞壁代謝相關(guān)的在前期二者趨勢一致；在后期RNA-seq結(jié)果中下調(diào)1.6倍，而RT-qPCR結(jié)果則輕微上調(diào)，后期與前期相比上調(diào)幅度較大。胼胝質(zhì)沉積相關(guān)的和抗病相關(guān)的在前期RT-qPCR結(jié)果與RNA-seq測序結(jié)果有細(xì)微偏差，但后期變化趨勢保持一致。值得關(guān)注的是：蔗糖和淀粉代謝相關(guān)的，激素代謝相關(guān)的以及抗病相關(guān)的的RT-qPCR結(jié)果均高于RNA-seq測序結(jié)果（圖5）。

3 討論

3.1 馬蜂柑響應(yīng)CLas早期侵染的耐病機(jī)制

在感病柑橘的葉片中脈、莖和根中觀察到不同程度的淀粉積累和韌皮部堵塞現(xiàn)象[5,27]。Folimonova等[8]研究了30 種不同基因型的柑橘對黃龍病的響應(yīng)，根據(jù)癥狀發(fā)展和持續(xù)生長的能力，將不同基因型分為敏感、中度耐受和耐受3類。對耐受型粗檸檬與敏感型甜橙的葉、莖和根組織進(jìn)行解剖學(xué)比較分析，發(fā)現(xiàn)在粗檸檬中觀察到的破壞性解剖結(jié)構(gòu)變化（韌皮部細(xì)胞塌陷、淀粉沉積、韌皮部纖維缺乏）比甜橙少。同樣的現(xiàn)象在Fan等[28]的研究中也得到了印證。Deng等[29]比較觀察敏感型‘Valencia’甜橙和耐病型‘LB8-9 Sugar Belle’雜柑、‘Bearss’檸檬的葉片和葉中脈顯微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)與敏感型‘Valencia’甜橙的韌皮部相比，耐病型‘LB8-9 Sugar Belle’雜柑、‘Bearss’檸檬的韌皮部有大量的再生；韌皮部分裂程度越低，韌皮部再生能力越強(qiáng)，是影響不同柑橘品種HLB耐受性的兩個(gè)關(guān)鍵因素。馬蜂柑感病前期、后期均未明顯的黃龍病癥狀；比較觀察馬蜂柑健康和感病樣品的中脈組織切片，二者結(jié)構(gòu)無明顯異常，且到感病后期所受影響依舊較小，表明馬蜂柑韌皮部結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，使其對CLas具有一定的耐病性。

A: CH-M-VS-CH-HLB-E; B: CH-M-VS-CH-HLB-L; C: CH-HLB-E-VS-CH-HLB-L

CLas的侵染可導(dǎo)致韌皮部損傷和篩孔堵塞，這可能限制礦物質(zhì)營養(yǎng)素和各種有機(jī)化合物從根際到植物或從老葉到新芽的吸收和運(yùn)輸[13]。纖維素酶、擴(kuò)張蛋白和果膠酯酶均與細(xì)胞壁的破壞有關(guān)，這些基因的高表達(dá)可能是導(dǎo)致敏感寄主表現(xiàn)癥狀的原因之一[30]。甜橙感染黃龍病后，多個(gè)編碼CESA、CSLA和COBL蛋白的基因顯著下調(diào)表達(dá)，使得寄主的適應(yīng)能力減弱，從而有利于病原菌的侵染[26]。擴(kuò)張蛋白、PP2和胼胝質(zhì)與CLas感染引起的韌皮部損傷有關(guān)[31-32]。相關(guān)研究表明擴(kuò)張蛋白可能導(dǎo)致CLas影響的葉片種類變硬，韌皮部細(xì)胞壁扭曲[32]。Wang等[30]研究發(fā)現(xiàn)編碼該蛋白的基因在感病品種‘Marsh’葡萄柚中表達(dá)水平高于耐病品種‘Jackson’葡萄柚，推測其可能與品種對黃龍病的敏感性相關(guān)。本研究中，相關(guān)基因的下調(diào)表達(dá)比例、數(shù)量隨病原菌侵染時(shí)間的推移而不斷增加，說明馬蜂柑細(xì)胞壁對CLas侵染的限制能力隨時(shí)間的推移在不斷減弱。而在馬蜂柑感病后期，擴(kuò)張蛋白和木葡聚糖內(nèi)糖基酶的表達(dá)下調(diào)，推測可能與抵抗病原菌侵染相關(guān)，但其具體調(diào)節(jié)模式有待進(jìn)一步研究。

韌皮部壞死導(dǎo)致運(yùn)輸受阻是蔗糖、淀粉等碳水化合物在葉片中大量積累的主要原因[33]。早期研究發(fā)現(xiàn)，甜橙感染黃龍病后，與淀粉合成有關(guān)的酶基因上調(diào)表達(dá)[27]。本研究中，蔗糖分解在感病前期受到抑制且隨病原菌侵染時(shí)間的推移而不斷加強(qiáng)；而淀粉合成途徑在感病前期不受影響、隨病原菌侵染時(shí)間的推移開始抑制；光合作用中光的吸收在馬蜂柑侵染過程中會(huì)受到持續(xù)的干擾，但差異表達(dá)相關(guān)基因較少。由此推測在蔗糖分解和淀粉合成通路上相關(guān)基因的下調(diào)表達(dá)和光合作用所受影響較小，是馬蜂柑對CLas侵染作出的耐病性調(diào)節(jié)反應(yīng)。

3.2 馬蜂柑響應(yīng)CLas后期侵染的主要耐病機(jī)制

植物通過激活病原物相關(guān)分子模式（pathogen- associated molecular pattern，PAMP）誘發(fā)免疫反應(yīng)（PTI）或效應(yīng)蛋白觸發(fā)免疫反應(yīng)（ETI），保護(hù)自身免受病原體的攻擊[34-35]。植物PAMP的信號在細(xì)胞膜表面，而CLas存在于細(xì)胞內(nèi)，由于這種物理隔離的存在，推測寄主對CLas進(jìn)行防御反應(yīng)時(shí)可能無PTI的參與[36-37]。Shi等[38]通過對耐病型‘Sun Chu Sha’雜柑和敏感型‘Duncan’葡萄柚的研究表明，兩種基因型間PTI水平的差異與HLB耐受性水平相關(guān)。高度或中度耐病的柑橘基因型中沒有發(fā)現(xiàn)PTI反應(yīng)的跡象，由此推測其耐病性可能與抗性相關(guān)基因的表達(dá)、病程相關(guān)蛋白（PRs）的分泌和防御型植物激素（如水楊酸、茉莉酸）的激活相關(guān)[39]。本研究中，隨病原菌侵入時(shí)間的增加PTI系統(tǒng)中相關(guān)的上游調(diào)控基因種類和數(shù)目不斷增加，差異表達(dá)也由原來的下調(diào)表達(dá)轉(zhuǎn)變?yōu)樯险{(diào)表達(dá)模式，但未發(fā)現(xiàn)其下游調(diào)控基因的變化。因此，推測馬蜂柑在響應(yīng)CLas的侵染過程中PTI免疫系統(tǒng)未能被激活。隨著侵染時(shí)間延長，在后期3種抗性蛋白的相關(guān)基因均出現(xiàn)了上調(diào)表達(dá)，且上調(diào)幅度較大，說明ETI系統(tǒng)參與了馬蜂柑后期防御CLas的過程。

植物激素在植物與病原菌互作的過程中扮演重要角色，參與植物抗病機(jī)制。以水楊酸、茉莉酸和乙烯為代表的免疫反應(yīng)得到了廣泛的討論。植物受到病原菌侵染時(shí)，水楊酸介導(dǎo)產(chǎn)生的過敏性反應(yīng)（HR）和系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）使植物獲得一定的抗/耐病能力[40]。水楊酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶（SAMT）是植物在遠(yuǎn)端葉片累積水楊酸或水楊酸葡糖糖苷（SAG），轉(zhuǎn)化水楊酸的關(guān)鍵基因[41]。MeSA與柑橘黃龍病的耐受性有關(guān)，CsSAMT1和CsSABP2-1參與了MeSA與水楊酸的相互轉(zhuǎn)化，與耐病酸柚中MeSA的累積有關(guān)，耐病酸柚具有較強(qiáng)的SAR反應(yīng)[42]。水楊酸依賴的通路，通常導(dǎo)致SAR標(biāo)記致病相關(guān)（PR）基因（和編碼基因等）在局部和系統(tǒng)植物組織中的誘導(dǎo)表達(dá)[43]。根部中的上調(diào)表達(dá)使得施文格枳柚（×）與Cleopatra桔（）相比，其能更有效地抵抗CLas[44]。馬蜂柑感病后期，水楊酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶基因（）的上調(diào)表達(dá)與甲基化水楊酸，遠(yuǎn)距離傳輸防御信號，觸發(fā)相關(guān)防御反應(yīng)；UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因（）的上調(diào)表達(dá)將水楊酸糖基化轉(zhuǎn)化為非生理活性的水楊酸酰葡萄糖酯（SGE）和SAG兩種水楊酸苷儲存在液泡中，為后續(xù)持續(xù)激活水楊酸觸發(fā)的反應(yīng)做儲備；水楊酸途徑的標(biāo)志基因的上調(diào)表達(dá)與抵抗CLas、提高馬蜂柑抗性相關(guān)。

不同類別的病程相關(guān)蛋白在CLas侵染后被誘導(dǎo)差異表達(dá)，包括受體蛋白激酶、含TIR-NBS-LRR、CC-NBS-LRR和NB-ARC等結(jié)構(gòu)域的抗性蛋白、Kunitz家族胰蛋白酶和蛋白酶抑制劑蛋白等[16,18,45-46]。在本研究中，從前期抗病蛋白的下調(diào)表達(dá)，再到后期抗病蛋白表達(dá)的回升和新增抗病蛋白的上調(diào)，表明馬蜂柑后期防衛(wèi)反應(yīng)更強(qiáng)烈。研究表明，在CLas侵染檸檬后，某些防御蛋白反而下調(diào)表達(dá)，推測該類蛋白不是CLas誘導(dǎo)的特異蛋白，而是參與非寄主抗性的蛋白，這些蛋白的降低表達(dá)有助于CLas侵染下的寄主保留能量[19]。因此，在馬蜂柑中下調(diào)表達(dá)的病程相關(guān)蛋白，是否與馬蜂柑耐病性相關(guān)有待進(jìn)一步研究。

Martinelli等[47]通過比較感病品種臍橙和耐病品種‘Volkameriana’檸檬感染黃龍病后的蛋白組學(xué)差異，發(fā)現(xiàn)與植物解毒途徑有關(guān)的4個(gè)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）僅在耐病品種‘Volkameriana’檸檬上調(diào)表達(dá)，推測解毒途徑可能在提高黃龍病抗性中發(fā)揮重要作用，并提出的高表達(dá)是HLB耐受基因型的潛在候選標(biāo)記。本研究中，在馬蜂柑感病后期，5個(gè)均上調(diào)表達(dá)，可能與提高馬蜂柑對CLas的耐受性相關(guān)。

4 結(jié)論

通過比較耐病品種馬蜂柑在感染黃龍病不同時(shí)期的生物學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)差異，發(fā)現(xiàn)馬蜂柑響應(yīng)CLas早期侵染主要表現(xiàn)為韌皮部結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，細(xì)胞壁代謝、淀粉合成和光合作用等途徑不受干擾；而水楊酸介導(dǎo)的抗性信號、效應(yīng)蛋白觸發(fā)免疫反應(yīng)激活病程相關(guān)蛋白、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶參與的解毒作用是感病后期的主要耐病機(jī)制。

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Biologic and Transcriptomic Analysis ofResponses to ‘Liberibacter asiaticus’ at Different Infection Stages

TENG CaiLing1, ZHONG Xi1, WU HaoDi1, HU Yan2, ZHOU ChangYong1, WANG XueFeng1

(1National Citrus Engineering Research Center, Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712;2Ganzhou Bureau of Fruit Industry, Ganzhou 341000, Jiangxi)

【】Citrus Huanglongbing (HLB), associated with phloem-colonized ‘Liberibacter asiaticus’ (CLas), severely impedes worldwide citrus production. The objective of this study is to analyze the biological symptoms, microstructures and transcriptomes ofin response to CLas infection at different stages, to reveal the tolerance mechanism of, and to provide a basis for further screening of resistance genes and HLB-tolerant/resistant citrus breeding. 【】The budwoods ofgrafted on two-year-old Carrizo citrange rootstocks (×) used in this study were graft-inoculated with budwoods from a CLas (strain GZBJT)-infected Guanximiyou pummelo maintained in a greenhouse at Citrus Research Institute. The budwoods used as inoculum were tested CLas positive and free of other potential phloem-limited pathogens, such as(CTV) or Citrus tatter leaf virus (CTLV) by PCR before grafting. Inoculated plants were kept in greenhouse along with mock-inoculated healthy control plants. Real-time quantitative PCR (qPCR) was performed every 15 days after inoculation. Four months after inoculation (the earliest establishment of CLas by qPCR) and 14 months after inoculation were defined as the early infection stage and the late infection stage, respectively.The biological symptoms and microstructures were observed to analyze the structural changes of different infection stages. combined with comparative transcriptome and RT-qPCR validation, the response mechanism ofagainst HLB was explored.【】No typical symptom was observed inat the early and late stages of infection. Light microscopy observation from the midribs of HLB-affected and uninfectedrevealed that no significant structure change was found at the early infection stage and only a few sieves in the phloem were blocked at the late stage. By comparing the RNA-seq data, 181 and 1 384 genes were found to be differentially expressed at the early stage and late stage, respectively. Differentially expressed genes (DEGs) mainly involved incell wall metabolism, host defense response, starch and sucrose metabolism, callose synthesis and signal transduction. Comparative transcriptome analysis showed that the expression of related genes in starch and sucrose metabolism and cell wall metabolism was down-regulated at the early infection stage, and the expression of related genes in salicylic acid metabolism, salicylic acid signal transduction pathway, pathogenesis-related protein and glutathione-S-transferases was up-regulated at the late infection stage.【】The early response ofto CLas infection is mainly characterized by stable physical structure, undisturbed pathways such as starch synthesis and photosynthesisSalicylic acid-mediated resistance signals, effector-triggered immunity (ETI), and glutathione-S-transferases mediated detoxification contribute to the tolerance ofagainst CLas at the late infection stage.

citrus Huanglongbing; ‘Liberibacter asiaticus’ (CLas);; disease tolerance; transcriptome

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.07.007

2019-09-01；

2019-10-15

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD0201500）、國家自然科學(xué)基金（31871925，31671992）

滕彩玲，E-mail：864569130@qq.com。鐘晰，E-mail：767911863@qq.com。滕彩玲和鐘晰為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者王雪峰，E-mail：wangxuefeng@cric.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）