羅牡康，賈栩超，張瑞芬，劉磊，董麗紅，池建偉，白亞娟，張名位

楊桃的酚類成分含量及其生物可及性與抗氧化活性

羅牡康1,2，賈栩超2，張瑞芬2，劉磊2，董麗紅2，池建偉2，白亞娟2，張名位2

（1長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434020；2廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510610）

【】探討楊桃果實(shí)中酚類物質(zhì)的組成、含量、生物可及性及其抗氧化活性，為楊桃的鮮食消費(fèi)和深加工利用提供參考。以廣州紅楊桃（GZ）、香蜜楊桃（XM）、臺(tái)灣蜜絲楊桃（TW）3個(gè)品種的果實(shí)為材料，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）檢測(cè)楊桃果實(shí)中主要的酚類物質(zhì)，選用ABTS+自由基清除能力和氧自由基吸收能力（ORAC）兩種方法測(cè)定其抗氧化能力，采取體外模擬胃腸消化法分析各楊桃品種果實(shí)在消化過(guò)程中消化液總酚、總黃酮、單體酚物質(zhì)及抗氧化能力的變化，并計(jì)算其酚類物質(zhì)生物可及性。從楊桃果實(shí)提取物中檢測(cè)到了3種酚酸（原兒茶酸、對(duì)香豆酸和阿魏酸）和3種黃酮類物質(zhì)（原花青素B2、表兒茶素和異槲皮苷），其中原花青素B2和表兒茶素是含量最高的單體酚。供試楊桃品種的總酚、總黃酮含量的變異范圍分別為234.41—293.30 mg GAE/100g FW和165.75—278.97 mg CE/100g FW。模擬胃消化后，楊桃消化液中生物可及性多酚和黃酮的總含量分別為151.57—180.45 mg GAE/100 g FW和113.06—164.45 mg CE/100 g FW，總酚和總黃酮的生物可及性分別為54.05%—76.98%和47.58%—93.88%。進(jìn)一步經(jīng)腸消化后，釋放入消化液中的生物可及性酚類成分有所減少，生物可及性多酚和黃酮的總含量分別為116.64—155.76 mg GAE/100 g FW和78.47—148.44 mg CE/100 g FW，總酚和總黃酮的生物可及性分別為46.57%—66.45%和40.12%—84.75%。胃消化釋放入消化液的原花青素B2和表兒茶素分別達(dá)到56.60%—87.54%和65.33%—85.92%，而胃腸消化液中檢測(cè)到的原花青素B2和表兒茶素含量分別為楊桃果實(shí)提取物的51.90%—80.94%和32.81%—37.50%。楊桃胃消化液的ABTS和ORAC抗氧化值分別為楊桃果實(shí)提取物的97.56%、102.42%、92.36%和122.73%、118.50%、107.14%，而經(jīng)進(jìn)一步腸消化后消化液的ABTS和ORAC值分別降低12.33%—26.60%和37.95%—43.28%。楊桃中主要的酚類物質(zhì)包括原兒茶酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、原花青素B2、表兒茶素和異槲皮苷，其中原花青素B2和表兒茶素的含量顯著高于其他4種酚類物質(zhì)。楊桃果實(shí)經(jīng)模擬胃液消化后消化液中有較高的酚類物質(zhì)含量，而腸消化過(guò)程使生物可及性的酚類物質(zhì)含量顯著降低。

楊桃；酚類物質(zhì)；黃酮；生物可及性；抗氧化

0 引言

【研究意義】楊桃（L.）又名陽(yáng)桃或洋桃，其橫截面呈星形而得名“星果”，因其特殊的風(fēng)味和口感，在我國(guó)以及東南亞深受歡迎[1-2]。楊桃是一種有效的天然抗氧化食品，含有豐富的酚類成分[3-5]，其酚類含量在20種熱帶水果中排名第四[6]。楊桃酚類物質(zhì)具有抗氧化[2]、抑制脂肪酶[7]、抑制脂肪生成[8]和抑制脂肪肝變性[9]等生物活性，對(duì)維持人體健康具有重要意義。通常情況下，酚類物質(zhì)從食品基質(zhì)中的釋放決定著其被吸收、利用的可能性，攝入富含酚類物質(zhì)的食物并不一定意味著有著較多的酚類物質(zhì)被人體所吸收[10-11]。前人研究表明水果多酚與自身食物基質(zhì)的其他成分有很強(qiáng)的自然聯(lián)系和相互作用，這些相互作用限制了多酚在胃腸消化過(guò)程中從食物基質(zhì)中完全釋放[12]，進(jìn)而影響多酚類物質(zhì)的吸收代謝和生理功效的發(fā)揮。綜上所述，酚類物質(zhì)的生物可及性是多酚發(fā)揮人體健康效應(yīng)的前提。因此，探究楊桃果實(shí)的酚類構(gòu)成譜、生物可及性及其抗氧化活性，對(duì)研究楊桃果實(shí)多酚生物利用度和體內(nèi)吸收代謝具有重要意義，也為楊桃的品質(zhì)育種和精深加工提供理論指導(dǎo)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，楊桃酚類物質(zhì)的研究主要集中在其化學(xué)結(jié)構(gòu)表征和生物活性評(píng)價(jià)等方面。Zainudin等[13]研究發(fā)現(xiàn)楊桃果實(shí)中總酚含量高達(dá)（234.89±19.85）mg GAE/100 g FW；PANG等[14]對(duì)4個(gè)楊桃品種中的游離酚、結(jié)合酚和總酚含量進(jìn)行了測(cè)定，并通過(guò)高效液相色譜鑒定到表兒茶素等7個(gè)單體酚類成分；也有學(xué)者通過(guò)分離純化結(jié)合核磁共振等波譜手段對(duì)楊桃中的酚類成分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，報(bào)道的成分主要包括花青素類[15]、查爾酮類[2,8-9]、木脂素類和酚酸[16]等。楊桃中的酚類物質(zhì)也被報(bào)道具有良好的生物活性。MAHATTANATAWEE等[17]研究了14種熱帶水果的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)楊桃具有最高的DPPH抗氧化活性，其ORAC抗氧化活性僅次于番石榴；龐道瑞[7]研究發(fā)現(xiàn)楊桃游離酚提取物對(duì)3T3-L1細(xì)胞分化脂滴的產(chǎn)生有一定的抑制作用，對(duì)脂肪酸誘導(dǎo)的L02肝細(xì)胞脂肪變性也有一定的緩解作用，并通過(guò)db/db小鼠模型進(jìn)一步確證了楊桃游離酚提取物有較好的降血脂和降肝脂活性；AZEEM等[18]通過(guò)對(duì)白化小鼠腹腔注射CCl4誘導(dǎo)肝毒性模型發(fā)現(xiàn)，楊桃水提物對(duì)四氯化碳所致小鼠肝損傷具有良好的保護(hù)作用；JIA等[16]研究結(jié)果表明從新鮮楊桃中分離出的11種酚類化合物具有良好的ABTS和FRAP抗氧化活性，其中部分化合物還表現(xiàn)出中等強(qiáng)度的豬胰脂肪酶抑制活性。【本研究切入點(diǎn)】目前楊桃果實(shí)酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)表征及生物活性已有研究報(bào)道，但缺少關(guān)于楊桃酚類物質(zhì)在消化過(guò)程中的釋放與生物可及性的研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以廣州紅楊桃（GZ）、香蜜楊桃（XM）、臺(tái)灣蜜絲楊桃（TW）3個(gè)品種的楊桃果實(shí)為材料，利用HPLC-MS/MS對(duì)楊桃果實(shí)提取物的酚類物質(zhì)組成及含量進(jìn)行測(cè)定，并采用體外模擬胃腸消化的方法研究楊桃酚類物質(zhì)的生物可及性，以了解楊桃果實(shí)在模擬胃腸消化過(guò)程中活性成分及其抗氧化能力的變化規(guī)律，為楊桃的功能活性研究和相關(guān)營(yíng)養(yǎng)保健食品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019年3—7月在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

3個(gè)品種的新鮮楊桃見(jiàn)圖1，廣州紅楊桃（GZ）產(chǎn)自廣東省東莞市大朗鎮(zhèn)，地處東經(jīng)113.52°，北緯22.65°。香蜜楊桃（XM）產(chǎn)自福建省云霄縣下河村，地處東經(jīng)117.33°，北緯23.95°。臺(tái)灣蜜絲楊桃（TW）產(chǎn)自臺(tái)灣省彰化縣二林鎮(zhèn)，地處東經(jīng)120.50°，北緯24.06°。選取成熟度相同的果實(shí)，儲(chǔ)存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

圖1 三個(gè)品種楊桃的照片

胃蛋白酶（400 U?mg-1）、胰蛋白酶（4×USP）、膽鹽、2, 2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、熒光素鈉、2, 2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（AAPH）、福林酚試劑購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；沒(méi)食子酸、兒茶素、水溶性維生素E（Trolox）、對(duì)香豆酸、異槲皮苷、原花青素B2、表兒茶素、原兒茶酸、阿魏酸購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；色譜級(jí)乙腈購(gòu)于美國(guó)Fisher公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BIOFUGE Stratos Sorvall高速冷凍離心機(jī)、ULT2586-4-V超低溫冰箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），Vortex-Genie2多用途渦旋混合器（美國(guó)Scientific Industries公司），Infinite M200pro酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司），LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司），Ultimate 3000超高壓液相色譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），TSQ Endura三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），THZ-82A水浴恒溫振蕩器（常州榮華儀器制造有限公司），PHSJ-5型實(shí)驗(yàn)室PH計(jì)（上海雷磁儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 楊桃果實(shí)酚類物質(zhì)的提取 采用傳統(tǒng)的有機(jī)試劑浸提法提取楊桃果實(shí)中的酚類物質(zhì)，作為楊桃中的總酚。準(zhǔn)確稱取10.0 g楊桃樣品，加入甲醇30 mL，高速勻漿3 min后置于50 mL離心管內(nèi)，用37℃恒溫水浴搖床120 r/min振搖提取2 h，然后4℃離心（10 000 r/min）10 min，取上清液，殘?jiān)瓷鲜鲞^(guò)程重復(fù)提取兩次，合并上清液，于45℃下減壓旋蒸濃縮，濃縮液用去離子水定容至30 mL，得到楊桃酚類提取液，分裝后置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 模擬體外消化及生物可及性分析 參照LIANG等[19]的方法，通過(guò)模擬體外胃腸消化法測(cè)定楊桃果實(shí)中酚類物質(zhì)生物可及性，略作修改。消化過(guò)程分為兩個(gè)階段。第一階段胃液消化（gastric digestion，GD）。稱取10.0 g楊桃樣品，置于50 mL離心管內(nèi)，加入去離子水30 mL，高速勻漿3 min后，用6.0 mol·L-1HCl將混合液pH調(diào)至2.0，混勻，然后加入胃蛋白酶（12 000 U），混勻，置于37℃恒溫水浴搖床中120 r/min振搖2 h，快速冰浴冷卻后在4℃離心（10 000 r/min）10 min，取2 mL上清液作為胃液消化的樣品儲(chǔ)存在-80℃。第二階段腸消化（intestinal digestion，ID）。用1.0 mol·L-1Na2CO3溶液將胃液消化后的混合液pH調(diào)節(jié)至7.5，然后加入胰蛋白酶（1 mL，4 g·L-1）和膽鹽（1 mL，25 g·L-1），混勻，置于37℃恒溫水浴搖床中120 r/min振搖2 h。消化結(jié)束后，立即取出，冰浴使其冷卻，將混合液的pH調(diào)節(jié)至2，然后4℃離心（10 000 r/min）10 min，取上清液作為胃腸消化的樣品（GID）。

生物可及性是模擬消化過(guò)程中釋放的化合物含量與樣品中化合物含量的比值，根據(jù)以下公式計(jì)算[20]：

1.3.3 總酚含量的測(cè)定 總酚含量測(cè)定采用Folin- Ciocalteu法[21]。分別取125 μL適當(dāng)稀釋（適當(dāng)稀釋是指：使樣品反應(yīng)液的吸光值在標(biāo)曲范圍內(nèi)，下同）的樣品溶液加到含有0.5 mL去離子水的試管中，加入125 μL福林酚試劑，混勻后反應(yīng)6 min。再向試管中加入1.25 mL 7%（w﹕v）Na2CO3溶液和1 mL水，使整個(gè)反應(yīng)體系總體積為3 mL。將混合液混勻后避光靜置90 min，每管吸取200 μL至透明96孔板，在酶標(biāo)儀760 nm下測(cè)定各孔的吸光值，每個(gè)樣品平行操作3次。用沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，各樣品的總酚含量以每100 g新鮮楊桃果肉中所含沒(méi)食子酸當(dāng)量表示（mg GAE/100 g FW）。

1.3.4 總黃酮含量的測(cè)定 總黃酮含量測(cè)定采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法[22]。將250 μL適當(dāng)稀釋的樣品溶液加入到含有1.25 mL去離子水的試管中，加入75 μL 5%（w﹕v）NaNO2溶液，充分混勻后反應(yīng)6 min。向混合液中加入150 μL（w﹕v）AlCl3·6H2O（10%）溶液，靜置5 min后，再加入0.5 mL NaOH（1 mol·L-1）溶液和275 μL去離子水，每管吸取200 μL至透明96孔板，在酶標(biāo)儀510 nm下測(cè)定各孔的吸光值，每個(gè)樣品平行操作3次。用兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，各樣品的總黃酮含量以每100 g新鮮楊桃果肉中所含兒茶素當(dāng)量表示（mg CE/100 g FW）。

1.3.5 楊桃酚類物質(zhì)的定性分析 采用UPLC- ESI-QqQ液質(zhì)聯(lián)用儀結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)楊桃提取物中的部分酚類物質(zhì)進(jìn)行定性分析。液相條件：超高壓液相（Ultimate 3000，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；色譜柱：Hypersil GOLD（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱溫：35℃；流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；DAD掃描波長(zhǎng)范圍：190—600 nm；流動(dòng)相：A：0.1%乙酸水溶液，B：甲醇；流動(dòng)相梯度：0—10 min，10%—20% B；10—15 min，20%—45% B；15—20 min，45%—70% B；20—23 min，70%—75% B。

質(zhì)譜條件：三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（TSQ Endura，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子（NI）模式；噴霧電壓2 500 V；掃描區(qū)間：m/z 0—600；霧化壓力：30 psi；干燥氣體流速：9.0 L·min-1；霧化器溫度：300℃；錐孔電壓：135 V；使用兼顧選擇性和靈敏度的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（SRM）對(duì)楊桃提取物中的色譜峰進(jìn)行定性分析。

1.3.6 酚類物質(zhì)含量測(cè)定 楊桃中單體酚的鑒定參考PANG等[14]的測(cè)定方法稍作修改。色譜柱為Shimadzu（C18，S-5 μm，12 nm，250 mm×4.6 mm），流動(dòng)相A為0.2%的乙酸水溶液（v/v），流動(dòng)相B為乙腈。流速為1.0 mL·min-1，進(jìn)樣體積為10 μL。梯度洗脫程序如下：0—30 min，10%—20% B；30—35 min，20% B；35—45 min，20%—45% B；45—60 min，45%—70% B；60—68 min，70%—75% B。檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)保留時(shí)間對(duì)酚類物質(zhì)進(jìn)行指認(rèn)。通過(guò)高效液相色譜建立標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)提取物中的6個(gè)單體酚進(jìn)行含量測(cè)定。單體酚的含量以mg/100 g FW表示。每個(gè)樣品平行操作3次。

1.3.7 ABTS＋清除能力的測(cè)定 2.6 mmol·L-1過(guò)硫酸鉀溶液和7.4 mmol·L-1ABTS+溶液體積比1﹕1混合，室溫避光放置12 h后，稀釋至吸光度值為0.7±0.05，作為ABTS+工作液。取200 μL適當(dāng)稀釋的樣品加入到含有5.8 mL ABTS+工作液的試管中，混勻后反應(yīng)6 min，每管吸取200 μL至透明96孔板，在酶標(biāo)儀734 nm下測(cè)定各孔的吸光值，每個(gè)樣品平行操作3次。用Trolox標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，各樣品的ABTS＋清除能力以每g新鮮楊桃果肉中所含Trolox當(dāng)量表示（mg TE/g FW）。

1.3.8 ORAC抗氧化活性分析 ORAC抗氧化活性分析參照OU[23]和ZULUETA等[24]報(bào)道的方法并稍作修改。樣品用75 mmol·L-1pH 7.4磷酸鹽緩沖液稀釋到適當(dāng)濃度后，各取20 μL加到黑色96孔板中，另設(shè)空白孔、對(duì)照孔、不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液孔（Trolox）和陽(yáng)性對(duì)照孔（沒(méi)食子酸），各處理均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將96孔板放入提前調(diào)節(jié)溫度至37℃的酶標(biāo)儀中孵育10 min，每孔加入200 μL 0.96 μmol·L-1熒光素鈉工作液，繼續(xù)孵育20 min后，除對(duì)照孔外，每孔再加入20 μL新鮮配置的119 mmol·L-1AAPH溶液。最后，將96孔板立即放入酶標(biāo)儀中，激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)520 nm下測(cè)定各孔熒光值，每4.5 min測(cè)定一次，共35個(gè)循環(huán)。計(jì)算各孔熒光強(qiáng)度曲線下的面積（AUG），減掉空白孔的AUG，即得到各孔的net AUG，根據(jù)不同濃度Trolox的net AUG做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣品的ORAC值，以Trolox當(dāng)量表示（μmol TE/g FW）。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)所得結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用Origin 8.0軟件繪圖，使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行Duncan’s多重比較分析。不同字母表示差異顯著（＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 楊桃果實(shí)主要酚類成分的鑒定

采用超高壓液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀首先對(duì)單體酚的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，篩選其對(duì)應(yīng)的特征離子對(duì)，并確定標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間。為提高定性的準(zhǔn)確性，6個(gè)單體酚標(biāo)準(zhǔn)品選擇兩對(duì)特征離子對(duì)進(jìn)行分析，優(yōu)化結(jié)果如表1所示。隨后采用選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式對(duì)楊桃提取物中進(jìn)行分析，根據(jù)保留時(shí)間和特征離子對(duì)提取物進(jìn)行匹配指認(rèn)。結(jié)果如圖2所示，共從楊桃甲醇提取物中指認(rèn)出6種酚類物質(zhì)，分別為原兒茶酸、原花青素B2、表兒茶素、對(duì)香豆酸、阿魏酸和異槲皮苷。

表1 單體酚類物質(zhì)的優(yōu)化離子碎片

圖2 楊桃甲醇提取物及指認(rèn)酚類物質(zhì)的LC-MS圖譜

2.2 楊桃果實(shí)酚類成分的含量

供試品種總酚含量范圍為234.41—293.30 mg GAE/100 g FW，其中XM的含量顯著高于其他品種（＜0.05），TW次之，GZ的含量最低（（234.41±7.88）mg GAE/100 g FW）?？傸S酮含量范圍為165.75— 278.97 mg CE/100 g FW，XM的含量高達(dá)（278.97± 5.50）mg CE/100 g FW，顯著高于其他品種。GZ和TW的總酚、總黃酮含量無(wú)顯著差異（＞0.05）（圖3）。

除原兒茶酸外，原花青素B2、表兒茶素、對(duì)香豆酸、阿魏酸、異槲皮苷在所有供試品種中均能檢測(cè)到。原花青素B2是供試楊桃中含量最豐富的一種單體酚，其中XM的含量最高，分別為GZ和TW的1.26和1.41倍。XM的表兒茶素含量顯著高于其他品種，分別為GZ和TW的1.25和1.93倍。XM中異槲皮苷的含量顯著低于GZ和TW，僅分別為GZ和TW的47.2%和58.6%。原兒茶酸在TW中含量最高，但在XM中未檢測(cè)到。對(duì)香豆酸和阿魏酸的含量分別為0.89—1.23 mg/100 g FW和1.20—1.40 mg/100 g FW（表2）。

2.3 楊桃的生物可及性

如表3所示，經(jīng)胃消化后，供試楊桃果實(shí)生物可及性多酚的釋放量變異范圍為151.57—180.46 mg GAE/ 100 g FW，總酚的生物可及性為54.05%—76.98%。胃腸消化后生物可及性黃酮的釋放量為113.06— 164.45 mg CE/100 g FW，總黃酮的生物可及性為47.58%— 93.88%。進(jìn)一步經(jīng)腸消化后，消化液中的生物可及性多酚和黃酮的含量較胃消化階段顯著性減少（＜0.05），其生物可及性酚類含量為116.64—155.76 mg GAE/100 g FW，較胃消化后降低了13.69%—23.05%，總酚的生物可及性為46.57%—66.45%。生物可及性黃酮含量變異范圍為78.47—148.44 mg CE/100 g FW，較胃消化后降低9.74%—30.59%，總黃酮的生物可及性為40.12% —84.75%。供試品種中，多酚和黃酮生物可及性最高的是GZ，分別為93.88%和84.75%，XM和TW總酚的可及性相當(dāng)，但TW黃酮的生物可及性較XM高。

GZ：廣州紅楊桃Guangzhou Hong carambola；XM：香蜜楊桃 Xiangmi carambola；TW：臺(tái)灣蜜絲楊桃Taiwan Misi carambola。不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同 Different letters mean significant differences (P＜0.05). The same as below

表2 楊桃果實(shí)中單體酚的含量

同一行不同字母表示差異顯著（＜0.05）。ND：未檢測(cè)到。下同

Different letters within the same row indicate significant difference (＜0.05). ND: Not detected. The same as below

表3 楊桃體外消化過(guò)程中釋放入消化液中的總酚和總黃酮含量及其生物可及性

胃、腸消化對(duì)單體酚的含量也有一定影響。如表4所示，經(jīng)過(guò)模擬胃液消化后，楊桃釋放的原花青素B2生物可及性為56.60%—87.54%，表兒茶素生物可及性為65.33%—85.92%，異槲皮苷生物可及性為61.11%—74.71%。胃消化后，GZ和TW楊桃釋放的原兒茶酸含量?jī)H為果實(shí)中含量的29.60%和14.77%。阿魏酸的生物可及性為59.38%—66.67%，對(duì)香豆酸的生物可及性高達(dá)72.6%—117.35%。進(jìn)一步經(jīng)腸消化后，除原兒茶酸外，消化液中所有被檢單體酚的含量都有所減少。其中，消化液中檢測(cè)到的原花青素B2生物可及性為51.90%—80.94%。表兒茶素生物可及性為32.81%—37.50%。異槲皮苷生物可及性為33.80%—49.43%。阿魏酸生物可及性為53.57%—56.67%。胃、腸消化后，GZ和XM楊桃的對(duì)香豆酸生物可及性分別為59.18%和47.15%，但是對(duì)香豆酸在TW楊桃的消化液中并未檢測(cè)到；GZ和TW楊桃的原兒茶酸生物可及性分別為34.40%和28.86%，而XM楊桃經(jīng)胃、腸消化后第一次檢測(cè)到原兒茶酸。

2.4 楊桃果實(shí)在體外消化過(guò)程中的抗氧化活性變化

圖4顯示楊桃果實(shí)提取液具有良好的抑制ABTS+自由基形成的能力，其變異范圍為49.98— 56.30 mg TE/g FW，其中ABTS抗氧化能力最強(qiáng)的品種是XM，顯著高于其他品種（＜0.05），最弱的是TW。經(jīng)過(guò)模擬胃消化后，上清液的ABTS抗氧化能力為46.16—57.66 mg TE/g FW，是楊桃果實(shí)提取液的92.36%—102.42%，其中XM楊桃消化液的ABTS抗氧化能力最高，為（57.66±0.73）mg TE/g FW。進(jìn)一步經(jīng)腸消化后，消化上清液的ABTS抗氧化能力為33.88—49.39 mg TE/g FW，是楊桃果實(shí)提取液的67.79%—87.73%，其中ABTS抗氧化能力最強(qiáng)的仍然是XM楊桃的消化液，為（49.39±3.62）mg TE/g FW。

楊桃果實(shí)提取液具有良好的ORAC抗氧化能力（圖5），其變化范圍為30.67—37.09 μmol TE/g FW。經(jīng)模擬胃液消化后，上清液的ORAC抗氧化能力為32.86—43.95 μmol TE/g FW，是楊桃果實(shí)提取液的107.14%—122.73%，其中XM楊桃消化液的ORAC抗氧化能力最高。進(jìn)一步經(jīng)腸消化后，消化上清液的ORAC抗氧化能力為19.51—26.67 μmol TE/g FW，是楊桃果實(shí)提取液的63.61%—76.13%，其中ORAC抗氧化能力最強(qiáng)的是GZ楊桃消化液，最弱的是TW。

AC：楊桃果實(shí)提取液；GD：胃消化液；GID：胃腸消化液。下同

表4 楊桃果實(shí)中單體酚含量及其在體外消化過(guò)程中的釋放情況

圖5 楊桃果實(shí)在體外消化過(guò)程中ORAC總抗氧化能力的變化

3 討論

3.1 楊桃果實(shí)酚類物質(zhì)組成及含量特征

大量研究表明，酚類物質(zhì)的組成與含量因果實(shí)種類而異。RAMFUL等[25]測(cè)定了36種柑橘類水果的酚類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)總酚為28.2—692.3 mg GAE/100 g FW，總黃酮為78.1—561.5 mg QE/100 g FW。ZHANG等[26]發(fā)現(xiàn)不同品種荔枝果肉中酚類物質(zhì)含量差異顯著，總酚含量變幅為101.51—259.18 mg GAE/100 g FW。DERRADJI等[27]曾報(bào)道各品種葡萄果肉中總酚含量為121—335 mg GAE/100 g FW，總黃酮含量為40—109 mg CE/100g FW。本研究測(cè)定了3個(gè)品種楊桃果實(shí)的酚類物質(zhì)組成及含量，3個(gè)品種中總酚、總黃酮分別為234.41—293.30 mg GAE/100 g FW和165.75—278.97 mg CE/100 g FW，可見(jiàn)楊桃果實(shí)的酚類物質(zhì)含量低于部分柑橘類水果，高于大部分荔枝，其黃酮含量甚至高于葡萄。在受試品種中酚類物質(zhì)含量最高的品種是XM，稍高于龐道瑞[7]測(cè)得的結(jié)果，這可能是由于原料產(chǎn)地、原料成熟度等因素造成的結(jié)果差異。

在3個(gè)品種的楊桃果實(shí)中都檢測(cè)到了原花青素B2、表兒茶素、異槲皮苷、原兒茶酸、對(duì)香豆酸和阿魏酸，與前人研究報(bào)道一致[28-30]。其中原花青素B2和表兒茶素含量最高。龐道瑞[7]檢測(cè)了4個(gè)品種楊桃的游離酚提取物，其中Xiangmi和Taiguo的表兒茶素和原花青素B2含量最高，其品種間差異與本研究的結(jié)果基本一致。前人也從楊桃中檢測(cè)到了沒(méi)食子酸[7]、丁香酸[7]和香草酸[28]，本研究中未能檢測(cè)到，可能是由于這些化合物的含量過(guò)低，也有可能是由于不同產(chǎn)地楊桃化學(xué)成分有一定差異。除了上述指認(rèn)的酚類成分，楊桃中分離報(bào)道最多的是一類二氫查耳酮碳苷類成分[2,8-9]，是楊桃中一類特征性酚類物質(zhì)，本研究液相色譜圖中（圖2）保留時(shí)間在20—22 min的3個(gè)主要色譜峰具有二氫查耳酮類化合物的紫外吸收特征（223 nm、280 nm），并且洗脫極性也與文獻(xiàn)報(bào)道的較為接近，因此推測(cè)為二氫查耳酮碳苷類成分，但由于缺少標(biāo)準(zhǔn)品，具體還有待進(jìn)一步確認(rèn)。

3.2 楊桃果實(shí)酚類物質(zhì)的生物可及性分析

食物中多酚的生物利用度取決于幾個(gè)因素，包括它們?cè)谖改c道消化過(guò)程中釋放（即生物可及性）、吸收、代謝以及循環(huán)系統(tǒng)中的運(yùn)輸[11]。由于食物基質(zhì)的復(fù)雜性，酚類物質(zhì)可能與其他成分（主要是多糖）交互，從而減少了酚類物質(zhì)的釋放，使得其含量被低估[31]。而生物可及性研究可以讓人們更近距離地了解在食用某些食物時(shí)，體內(nèi)會(huì)發(fā)生什么，因而可以更科學(xué)、客觀地評(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

不同種類食品中酚類物質(zhì)的生物可及性已有報(bào)道，蔬菜、豆類、谷物的平均生物可及性分別為26.01%、25.47%、28%[32-33]，而水果的生物可及性顯著高于其他食物[34]，且由于果實(shí)基質(zhì)成分的不同，不同種類水果多酚的釋放和吸收機(jī)制可能大不相同[35]。LINGUA等[36]研究發(fā)現(xiàn)紅葡萄在胃消化后釋放的生物可及性花青素、黃酮和酚酸分別達(dá)到了總含量的45%、73%和80%；腸消化后在可透析的部分中測(cè)得6%生物可及性的總酚含量，而在不可透析的部分中發(fā)現(xiàn)了10%的酚類物質(zhì)，代表可能的結(jié)腸可用化合物。SUN等[37]曾報(bào)道柑橘類水果經(jīng)過(guò)胃腸消化后黃酮類物質(zhì)的生物可及性達(dá)到79%。本研究結(jié)果顯示，胃消化后樣品生物可及性的總酚含量變化范圍為54.05%—76.98%，生物可及性的總黃酮含量變化范圍為47.58%—93.88%，與葡萄的生物可及性相當(dāng)。表明模擬胃液消化能夠促進(jìn)楊桃中酚類物質(zhì)的釋放，可能是在胃蛋白酶和胃酸作用下，酚類物質(zhì)從蛋白、多糖等的交聯(lián)作用中釋放，并從結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化為游離態(tài)[38-39]。TOYDEMIR等[40]發(fā)現(xiàn)酸櫻桃經(jīng)胃消化后總酚含量顯著高于去離子水組，生物可及性增加，與本研究結(jié)果一致。胃腸消化后測(cè)得所有供試品種楊桃消化液中的總酚、總黃酮含量均比胃消化液低，生物可及性也大大降低，生物可及性的總酚含量變化范圍為46.57%—66.45%，生物可及性的總黃酮含量變化范圍為40.12%—84.75%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葡萄的生物可及性。其中GZ楊桃在胃腸消化后釋放的生物可及性黃酮達(dá)到84.75%，與柑橘水平相當(dāng)。劉國(guó)艷等[41]發(fā)現(xiàn)，芹菜汁在胃消化過(guò)程中其總酚含量增加較快，腸消化后總酚含量降低；TAGLIAZUCCHI等[42]利用模擬胃腸條件的體外模型研究了葡萄多酚的生物可及性，發(fā)現(xiàn)在胃消化過(guò)程中，生物可及的多酚、黃酮類化合物和花青素的數(shù)量增加，而腸道環(huán)境的轉(zhuǎn)變導(dǎo)致所有被分析的多酚類物質(zhì)的含量均下降，分析原因可能是花青素和其他黃酮類化合物在中性或微堿性環(huán)境下不穩(wěn)定而發(fā)生降解[43-44]。GZ楊桃提取物的總酚含量不高，但胃消化、胃腸消化后釋放的生物可及性多酚水平均顯著高于其他品種，而XM楊桃雖然酚類物質(zhì)含量在3個(gè)品種中最高，但是胃消化、胃腸消化后釋放的生物可及性多酚遠(yuǎn)少于GZ楊桃，可見(jiàn)，食用富含多酚的XM品種時(shí)，消費(fèi)者真正吸收利用的酚類物質(zhì)可能反而低于酚類物質(zhì)相對(duì)較低的GZ品種?？赡艿脑蚴遣煌贩N楊桃果實(shí)的基質(zhì)成分存在差異，食物基質(zhì)可以是碳水化合物、脂類、蛋白質(zhì)和植物化學(xué)物質(zhì)等組成的非常復(fù)雜的混合物，它們之間的相互作用可能會(huì)減少通過(guò)胃腸道釋放多酚的數(shù)量[45-46]?；|(zhì)成分中存在的不可消化的化合物，如纖維，抗性淀粉，蛋白質(zhì)等也會(huì)降低多酚的生物可及性[47-48]。也可能是由于不同品種楊桃酚類化合物的構(gòu)成譜和分子大小存在差異，使酚類物質(zhì)釋放的難易程度不一[49]。GZ楊桃可能含有更多生物可及性高的單體酚。

除原兒茶酸外，所有被檢單體酚的含量在胃腸消化后均顯著降低了（表4）。3個(gè)品種楊桃的原花青素B2、表兒茶素和異槲皮苷含量較胃消化后顯著下降，可能是由于腸道消化的化學(xué)環(huán)境呈弱堿性，而黃酮類物質(zhì)對(duì)堿性條件比較敏感，容易在堿性條件下降解為其他化合物，因此，黃酮類物質(zhì)在腸消化液中的含量與胃消化液相比有所減少[50]。XM楊桃中原兒茶酸在胃腸消化后第一次被檢測(cè)到，這可能是由于黃酮和原花青素等酚類成分在消化過(guò)程中發(fā)生降解反應(yīng)生成了原兒茶酸[51]。

3.3 楊桃果實(shí)酚類物質(zhì)的抗氧化活性分析

酚類物質(zhì)是果蔬中重要的活性物質(zhì)，其在貢獻(xiàn)電子后能產(chǎn)生穩(wěn)定的中間體，能有效的在細(xì)胞和生理水平上防止氧化[52]。本研究中楊桃果實(shí)的抗氧化活性是通過(guò)ABTS+自由基清除能力和ORAC抗氧化能力來(lái)測(cè)定的。XM楊桃的ABTS和ORAC抗氧化能力均為受試品種中最強(qiáng)，胃消化后，GZ和TW楊桃消化液的ABTS抗氧化能力與楊桃果實(shí)提取物相當(dāng)，而XM楊桃消化液的ABTS抗氧化能力顯著高于楊桃果實(shí)提取物（＜0.05）。胃消化后所有受試品種楊桃消化液的ORAC抗氧化能力都顯著高于楊桃果實(shí)提取物，與樊梓鸞等[53]得到的結(jié)果相似，并分析可能是由于胃酸水解和胃蛋白酶酶解等消化作用，結(jié)合態(tài)多酚轉(zhuǎn)變成游離態(tài)多酚，也說(shuō)明酚類物質(zhì)在胃液消化后有更優(yōu)的抗氧化能力，功能活性更強(qiáng)。而經(jīng)進(jìn)一步腸消化后，3個(gè)品種楊桃消化液的抗氧化能力較胃消化液均顯著降低（＜0.05）。這可能是與酚類物質(zhì)在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定，部分發(fā)生降解有關(guān)[53]；也可能是由于黃酮類化合物與胰蛋白酶結(jié)合后形成絡(luò)合物，其溶解性降低，給電子能力被顯著抑制，進(jìn)而降低了其抗氧化活性[54]。

大量研究表明，果蔬的抗氧化能力與其酚類物質(zhì)含量有密切的聯(lián)系[55-56]。XU等[57]測(cè)定了31種葡萄的ABTS抗氧化活性變化范圍為19.09—162.53 mg TE/g FW，LI等[58]測(cè)定了11種葡萄的果皮和果肉的ORAC抗氧化活性，結(jié)果顯示葡萄皮的ORAC值變化范圍為9.62—190.57 μmol TE/g FW，而葡萄果肉的ORAC值最大僅為16.24 μmol TE/g FW。ZHANG等[59]測(cè)定了19種柑橘類水果的ABTS抗氧化活性變化異范圍為64.24—97.31 mg TE/g FW，而其ORAC值達(dá)到395.66—834.37 μmol TE/g DW。在本研究中，受試楊桃果實(shí)提取物的ABTS值變化范圍為49.98—56.30 mg TE/g FW，ORAC值變化范圍為30.67—37.09 μmol TE/g FW，均高于葡萄果肉的抗氧化活性，但不如柑橘類水果的抗氧化能力強(qiáng)。其中XM楊桃的ABTS和ORAC抗氧化值最高，這與其總酚、總黃酮含量最高是一致的。無(wú)論是胃消化后還是胃腸消化后，GZ楊桃釋放入消化液的總酚、總黃酮含量都是受試品種中最高的，但其ABTS清除自由基能力卻顯著低于XM楊桃，這可能是由于不同品種楊桃酚類物質(zhì)構(gòu)成譜有所差異。不同結(jié)構(gòu)的酚類物質(zhì)抗氧化活性差異較大[60-61]，相比于GZ楊桃，XM楊桃中可能富含一些高抗氧化活性的酚類成分。在本研究中，受試楊桃中含量最高的兩種單體酚是原花青素B2和表兒茶素，已有研究表明原花青素B2和表兒茶素具有良好的ABTS自由基清除能力和綜合抗氧化能力[62-63]。本研究中，胃消化后受試楊桃（GZ、XM、TW）消化液的ABTS值和ORAC值均降低，原花青素B2和表兒茶素含量也表現(xiàn)為減少，通過(guò)SPSS 24.0軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)性雙尾檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，楊桃消化液的ABTS值與原花青素B2、表兒茶素的相關(guān)性系數(shù)分別為0.847*和0.900*，ORAC值與原花青素B2、表兒茶素的相關(guān)性系數(shù)分別為0.935**和0.980**，呈顯著性相關(guān)，提示原花青素B2和表兒茶素可能是楊桃果實(shí)抗氧化能力的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)。

本研究也存在一些不足，比如水果的抗氧化活性不僅僅只與酚類物質(zhì)有關(guān)，類胡蘿卜素、維生素C等也有一定活性[64]，本研究未對(duì)其他成分進(jìn)行研究。另外，在食物消化的過(guò)程中，大多數(shù)的游離態(tài)酚類物質(zhì)是在上消化道中酶的作用下釋放出來(lái)的，而結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)主要是在下消化道酶及微生物酶的作用下釋放[65-66]，龐道瑞[7]測(cè)定了4個(gè)品種楊桃果實(shí)的游離酚和結(jié)合酚，發(fā)現(xiàn)結(jié)合酚僅占總酚含量的2.18%— 7.70%，因此本研究沒(méi)有對(duì)楊桃果實(shí)結(jié)合酚進(jìn)行研究。許多研究結(jié)果表明，進(jìn)入下消化道的酚類物質(zhì)同樣具有健康功效[67-70]。今后，可以對(duì)楊桃果實(shí)酚類物質(zhì)在下消化道的變化規(guī)律進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

原兒茶酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、原花青素B2、表兒茶素和異槲皮苷是楊桃中主要的酚類物質(zhì)，其中原花青素B2和表兒茶素的含量較高。楊桃經(jīng)模擬胃液消化后消化液含有較高的總酚、總黃酮含量及抗氧化活性，其中總酚含量變化范圍為54.05%—76.98%，生物可及性的總黃酮含量變化范圍為47.58%—93.88%；而模擬胃腸消化后消化液中酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性均顯著降低。

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Phenolic Content, Bioavailability and Antioxidant Activity of Carambola

LUO MuKang1,2, JIA XuChao2, ZHANG RuiFen2, LIU Lei2, DONG LiHong2, CHI JianWei2, BAI YaJuan2, ZHANG MingWei2

(1College of Life Science, Yangtze University, Jingzhou 434020, Hubei;2Sericultura & Agri-Food Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Functional Foods, Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing, Guangzhou 510610)

【】The aim of this study was to explore the phenolic composition, content, bioaccessibility and antioxidant activity of phenolic compounds in different carambola fruit varieties, so as to provide reference for the fresh consumption and deep processing of carambola. 【】Phenolic compounds of three cultivars, including Guangzhou Hong cultivar (GZ), Xiangmi cultivar (XM), and Taiwan Misi cultivar (TW), were determined by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). Their antioxidant capacity was evaluated by ABTS+radical scavenging capacity (ABTS) and oxygen radical absorbance capacity assay (ORAC). The change of total phenol, flavonoids, mono-phenol and their antioxidant capacity, as well as their bioaccessibility were analyzed duringsimulated gastrointestinal digestion. 【】Three phenolic acids (protocatechuic acid, p-coumaric acid and ferulic acid) and three flavonoids (procyanidin B2, epicatechin and isoquercetin) were detected from the extracts of carambola fruit, among which proanthocyanin B2 and epicatechin were the predominant phenolics. The variation ranges of total phenolics and total flavonoids in tested varieties were 234.41-293.30 mg GAE/100 g and 165.75-278.97 mg CE/100 g, respectively. After simulated gastric digestion, the contents of phenolics and flavonoids in carambola digestive juice were 151.57-180.45 mg GAE/100 g FW and 113.06-164.45 mg CE/100 g FW, respectively. And their bioaccessibility were 54.05%-76.98% and 47.58%- 93.88%, respectively. After further intestinal digestion, the content of phenolic compounds released into the digestive fluid was reduced. The phenolics and flavonoids contents were 116.64-155.76 mg GAE/100 g FW and 78.47-148.44 mg CE/100 g FW, respectively, and their bioaccessibility were 46.57%-66.45% and 40.12%-84.75%, respectively. The contents of procyanidins B2 and epicatechin released into digestive fluid were 56.60%-87.54% and 65.33%-85.92% with gastrointestinal digestion and these only accounted for 51.90%-80.94% and 32.81%-37.50% of carambola fruit extract, respectively. The antioxidant capacity of ABTS and ORAC of digestive juice of three carambola fruit with gastric digestion were 97.56%, 102.42%, 92.36% and 122.73%, 118.50% and 107.14%, respectively. After further intestinal digestion, their antioxidant capacity of ABTS and ORAC were reduced by 12.33%-26.60% and 37.95%-43.28%, respectively. 【】Protocatechuic acid, p-coumaric acid, ferulic acid, procyanidin B2, epicatechin and isoquercetin were the main phenolic substances in carambola, and the contents of procyanidin B2 and epicatechin were the highest among them. After simulated gastric digestion, a high content of phenolic compounds in the digestive juice were detected, while their contents were significantly reduced with intestinal digestion.

carambola; phenolic substances; flavonoid; bioaccessibility; antioxidant

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.07.014

2019-08-21；

2019-10-22

廣東省自然科學(xué)基金（2018A030310199）、廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長(zhǎng)基金（201904）

羅牡康，E-mail：luomk1127@163.com。通信作者張名位，E-mail：mwzhh@vip.tom.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）