張珍珍，鄭達文，寧 冬，劉文秀，黃小桃，陳冰菲

(東莞泛亞太生物科技有限公司，廣東 東莞 523808)

油脂是人和動物生存和生活所必需的重要成分。油脂不僅是一種食物資源，也是醫(yī)藥、化工、農業(yè)等行業(yè)的一種基本原料[1]。油脂的降解大部分會依托于生物體自身的脂肪代謝過程，對人和單胃動物而言，油脂的消化主要集中在十二指腸下部和空腸上部，經過腸道膽汁的乳化作用使得其表面積增加，然后在胰脂肪酶的作用下將游離脂肪酸從三酰甘油分子中水解[2-5]。

除了人體和動物體能自身分泌的內源脂肪酶外，外源脂肪酶也在食品烘焙、奶酪制備、動物飼料方面[6-8]作為添加劑被廣泛使用，以提高產品品質。近年研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酶在人造奶和廢油脂降解等方面也同樣具有很好的開發(fā)前景。Qin等[9]利用脂肪酶催化酸解豬板油與油茶籽油脂肪酸的反應從而制備富含OPO的嬰幼兒人乳替代品；趙璞[10]通過對9種植物油添加脂肪酶進行酯交換反應模擬母乳化脂肪脂質的制備；彭元懷等[11]嘗試通過添加脂肪酶優(yōu)化水解地溝油工藝，提高其利用附加值等。

目前脂肪酶降解油脂的研究大多集中在對原始動物油脂和少部分植物油脂上，而脂肪酶的主要作用階段是在小腸階段，此時油脂經過口腔、胃和小腸前端的蠕動早已進入到乳化狀態(tài)[12-13]，其更有利于脂肪酶的后續(xù)作用。本文對豬油、鴨油、菜籽油、大豆油等油脂進行初步乳化，再測定添加脂肪酶后生成的脂肪酸含量。由于動物的飲食相對固定并更有規(guī)律，且豬的消化道結構及消化生理與人體的非常接近[14]，本文采用與人消化道結構接近的豬模型，模擬豬的胃腸道消化過程，研究經過胃液處理階段的脂肪酶是否仍有降解油脂的功效。這對于進一步了解脂肪酶在不同動植物油脂中的作用效果及在食品和飼料中的合適添加劑量都具有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菜籽油、大豆油，購于農產品市場；豬油、鴨油、棕櫚油，由東莞興業(yè)飼料有限公司提供；脂肪酶，來源于東莞泛亞太生物科技有限公司，初始酶活為80 000 U/g。

聚乙烯醇(PVA)，酚酞，胃蛋白酶(Sigma-7000)，α-淀粉酶(Sigma A3306)，胰蛋白酶(Amresco 0785)，糜蛋白酶(Amresco 0164)，氯霉素，磺基水楊酸。

分光光度計，高速勻漿機，電磁攪拌器，恒溫振蕩培養(yǎng)箱，抽濾裝置，Whatman無氮濾紙，IKA200量熱儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳化油脂的制備

乳化方法參考GB/T 23535—2009。稱取聚乙烯醇(PVA)40 g，加水800 mL，在沸水浴中加熱、攪拌直至全部溶解，冷卻后定容至1 000 mL，用干凈的雙層紗布過濾，取濾液150 mL，加入50 mL待測油脂樣品，用高速勻漿機處理6 min，得到乳白色PVA乳化油脂，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 乳化油脂酶解時間的確定

分別取4 mL大豆油、菜籽油、棕櫚油、鴨油和豬油的乳化油脂，加入5 mL pH 7.5磷酸緩沖液，40℃、180 r/min恒溫振蕩箱預熱5 min，加入10 U脂肪酶，充分搖勻，分別反應0、0.5、1、2、3、4、5、6 h，加入95%乙醇15 mL，終止反應。反應液中加入10 g/L酚酞指示劑2滴，用氫氧化鈉標準溶液滴定，直至微紅色并保持30 s不褪色為滴定終點，記錄消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，計算脂肪酸含量，根據脂肪酸含量確定酶解時間。

1.2.3 乳化油脂酶解酶活劑量的確定

分別取4 mL大豆油、菜籽油、棕櫚油、鴨油和豬油的乳化油脂，加入5 mL pH 7.5磷酸緩沖液，40℃、180 r/min恒溫振蕩箱預熱5 min，分別加入0、5、10、20、40、80、170、200、230、260 U脂肪酶，充分搖勻，按照1.2.2確定的酶解時間及方法進行試驗，最終確定最佳酶活劑量。

1.2.4 體外模擬胃腸道消化

1.2.4.1 試驗日糧及組成

試驗日糧以乳仔豬玉米、豆粕日糧為主要原料，參照NRC[15]推薦的營養(yǎng)需求標準。日糧配方見表1。

表1 試驗日糧組成和營養(yǎng)水平 %

1.2.4.2 消化樣品的制備

將飼料樣品粉碎，過60目篩，置于干燥器內保存待測。

1.2.4.3 干物質含量測定

飼料樣品水分測定參見GB/T 6435—2014《飼料中水分的測定》。干物質含量=1-水分含量。

1.2.4.4 胃腸道消化

小腸緩沖液、模擬豬胃液和模擬豬小腸液均按照趙峰等[16]的方法配制，因是高油脂原料，故體外消化過程參考何科林等[17]方法，并略作改動。

模擬豬胃液：稱取184.375 kU胃蛋白酶于250 mL pH 2.0的鹽酸溶液中(39℃下標定pH)，緩慢攪拌直至溶解，臨用前配制。

小腸緩沖液：稱取8.32 g無水磷酸氫二鈉，40.96 g無水磷酸二氫鈉，11.55 g氯化鈉和2.45 g氯化鉀，氯霉素5 g，放入2 000 mL燒杯中，加入1 800 mL去離子水溶解，并用無水氫氧化鈉在39℃下調節(jié)溶液的pH至6.44，再用去離子水定容至2 000 mL。

模擬豬小腸液：分別稱取60.89 kUα-淀粉酶，19.00 kU胰蛋白酶，2.39 kU糜蛋白酶，溶解于25 mL去離子水中，并緩慢攪拌至溶解，臨用前配制。

準確稱取1 g過60目篩的飼料樣品，根據1.2.3酶活劑量的結果加入稀釋后指定酶活的脂肪酶，加入15 mL的模擬豬胃液和0.5 mL 0.5%氯霉素溶液，小心混合均勻后，具塞封口，于39℃、120 r/min消化1 h。

胃消化階段結束后，向食糜中加入14 mL小腸緩沖液，并用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調整食糜pH至6.44，加入2 mL模擬小腸液，39℃、120 r/min消化4 h。

待消化完畢，向消化殘渣中加入5 mL 20%磺基水楊酸，室溫放置30 min，將消化液真空抽濾，并用1%磺基水楊酸對消化瓶進行完全沖洗，隨后將殘渣連同已知質量的Whatman無氮濾紙取出，參考1.2.4.3方法測定殘渣干物質含量，按下式計算樣品的干物質消化率，隨后用量熱儀測定干燥殘渣能值，按下式計算能量消化率。

干物質消化率=(M1-M2)/M1×100%

能量消化率=(E1-E2)/E1×100%

式中：M1為飼料樣品干物質質量，g；M2為殘渣干物質質量，g；E1為飼料樣品總燃燒熱值，J；E2為殘渣總燃燒熱值，J。

1.2.5 數據分析

試驗數據先用Microsoft Excel進行初步整理后，再用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 酶解時間對乳化油脂酶解的影響

不同乳化油脂添加10 U脂肪酶后在不同酶解時間下生成的脂肪酸含量變化如表2所示。

表2 添加10 U脂肪酶時不同酶解時間乳化油脂生成的脂肪酸含量變化

由表2可知，酶解4 h時，不同乳化油脂生成的脂肪酸含量已經趨于穩(wěn)定，故將脂肪酶酶解時間定為4 h。從表2中也可看出：棕櫚油、豬油的乳化油脂中的初始脂肪酸含量較高，加酶后產生的脂肪酸的增長幅度也顯著大于大豆油、鴨油和菜籽油的乳化油脂(P<0.05)，這可能與大豆油、菜籽油和鴨油脂肪酸組成中中短鏈脂肪酸含量要遠低于長鏈脂肪酸有關[18-19]，且此類油脂中含量較高的不飽和脂肪酸大都分布于Sn-2位[20]，不利于脂肪酶的消化分解，所以產生的脂肪酸量相對較低；而棕櫚油和豬油中16碳原子的飽和棕櫚酸含量較高，分別達到了43%和23%，且多分布于Sn-1,3位[21]，說明當該脂肪酶不足時，可能更傾向于優(yōu)先結合Sn-1,3位酯鍵發(fā)生水解反應。

2.2 酶活劑量對乳化油脂酶解的影響

添加不同酶活劑量的脂肪酶到乳化油脂中反應4 h后生成的脂肪酸含量變化如表3所示。

由表3可知，隨著脂肪酶酶活劑量的增加，各乳化油脂的脂肪酸生成量也越大，脂肪酶酶活劑量達到200 U時，各乳化油脂生成的脂肪酸含量均已趨于飽和，故將200 U定為隨后模擬動物試驗的最終酶活劑量。由表3也可看出：在添加0～260 U脂肪酶時，棕櫚油、豬油乳化油脂產生的脂肪酸量始終大于大豆油、鴨油和菜籽油乳化油脂(P<0.05)，也更早達到其峰值(170 U)；縱向分析加酶后產生的脂肪酸總增加量，大豆油、菜籽油、棕櫚油、豬油、鴨油乳化油脂的脂肪酸總增加量分別為1.64、1.54、1.66、1.67、1.67 mmol/L，脂肪酸總增加率分別為546.7%、810.5%、325.5%、347.9%、596.4%，各組間脂肪酸總增加量差異并不大，以菜籽油的為略低，菜籽油脂肪酸組成中大于18碳原子的脂肪酸達到80%以上[22]，這其實也與Pouton等[23]研究的中鏈脂肪酸比長鏈脂肪酸水溶解性更好的結論一致；另外，由于菜籽油乳化油脂膏的初始脂肪酸量基準較低(0.19 mmol/L)，其脂肪酸總增加率反而達到了810.5%，遠高于其他乳化油脂的。

表3 添加不同酶活劑量脂肪酶時乳化油脂生成的脂肪酸含量變化

2.3 脂肪酶對單胃動物消化吸收的影響(見表4)

表4 脂肪酶對乳仔豬干物質消化率、能量消化率的影響

由表4可知：當脂肪酶添加量為125 g/t(以飼料質量計，下同)時，脂肪酶對大豆油的添加量等同于1 mL大豆油添加200 U脂肪酶，此時干物質消化率和能量消化率相比不加酶組分別增長0.86個百分點和0.83個百分點，這在僅添加單酶的基礎上，對動物的營養(yǎng)消化吸收效果可謂非常明顯，也從側面說明該脂肪酶具有一定的抗胃液特性；當脂肪酶添加量為250 g/t時，消化率相比125 g/t組的略有提升，但并不明顯，添加量繼續(xù)增加則消化率基本不再變化。由于飼料配方原料結構的多樣性，飼料中其他成分也會含有少量脂肪，故脂肪酶添加量略高于125 g/t或與其他酶，如淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶和半纖維素酶結合使用，則對飼料降解的協(xié)同效應可能會更好[24]。

3 結 論

由于油脂必須先乳化成乳糜顆粒，然后才能在腸道中進一步降解吸收，而脂肪酶又主要是在小腸階段與內源胰脂肪酶一起發(fā)揮作用的。故本文放棄采用原始油脂，而對油脂進行初步乳化后來測定脂肪酶對其降解效果。研究發(fā)現(xiàn)：①添加200 U脂肪酶到4 mL乳化油脂(即1 mL原始油脂)中反應4 h后，產生的脂肪酸量即可基本達到峰值；②添加不同劑量脂肪酶時，棕櫚油和豬油乳化油脂生成的脂肪酸量始終大于大豆油和鴨油乳化油脂的，而菜籽油乳化油脂的最低，組間差異顯著(P<0.05)，相比不加酶組，加入260 U脂肪酶后，大豆油、菜籽油、棕櫚油、豬油和鴨油乳化油脂的脂肪酸總增加量均大于1.50 mmol/L，但各油脂組間差異不大，脂肪酸總增加率均提高300%以上(脂肪酶加入260 U時)，其中菜籽油提升率可達到810.5%，加酶后效果顯著;③乳豬料中添加脂肪酶(脂肪酶酶活80 000 U/g)可提高干物質消化率和能量消化率，添加量以略高于125 g/t為佳。

本文僅采用1種微生物來源的脂肪酶進行試驗，而不同脂肪酶的酶活、溫度特性、酸度特性、底物特異性及抗胃蛋白酶特性等各有差別，故本文油脂中脂肪酶添加量僅可作為參考，不同來源脂肪酶劑量可能會有所浮動。另外，不同脂肪酶水解位點也會有不同，如母乳中胰脂酶和大部分商業(yè)脂肪酶會優(yōu)先水解作用于甘油三酯的Sn-1位或Sn-3位酯鍵，而豬胰脂肪酶水解甘油三酯時卻沒有選擇性，故脂肪酶的作用機理也是下一步探索的方向。