閆金國 王大鵬 孔麗娜 趙著梅

（濰坊護(hù)理職業(yè)學(xué)院 山東濰坊 262500）

植物組織培養(yǎng)技術(shù)利用植物細(xì)胞的全能性原理，能夠在較短的時間獲得大量性狀一致的組培苗，可以用來解決制約多肉植物產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的繁殖問題。早期多肉植物組培的外植體主要是花莖和子房[1-2]，近年來多選用葉片[3]，但是對不同部位組培的比較研究較少。本研究以景天科擬石蓮花屬大和錦為試驗(yàn)材料，探究不同消毒方式、不同部位對愈傷組織誘導(dǎo)、分化的影響，以期對多肉植物的組培快繁、商業(yè)化快速生產(chǎn)和新品種的培育提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用大和錦于2018 年購自山東省青州市南環(huán)路新花卉市場。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基

誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基+6-MA 3mg/L+NAA 0.5mg/L，增殖培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基+6-MA 3mg/L+NAA 0.1mg/L。上述所有培養(yǎng)基pH5.8～6.0。

1.2.2 外植體的消毒

本試驗(yàn)選擇次氯酸鈉（NaClO）作為消毒劑，通過調(diào)整消毒劑濃度和消毒時間以獲得最佳的消毒方式。選取成熟、無病害的大和錦葉片，先用流水沖洗30min，然后分別用1%、2%、10%次氯酸鈉溶液浸泡消毒5、10、20min。取出葉片，用無菌蒸餾水沖洗5次，放置在無菌濾紙上吸干多余的水分后，將葉片切成0.5cm 見方的小塊，接種到MS 培養(yǎng)基中，每個處理接種30 個外植體。30d后觀察其生長情況，并統(tǒng)計(jì)污染率。

污染率=污染數(shù)/30×100%

1.2.3 愈傷組織的誘導(dǎo)與分化

將大和錦葉片、花朵和幼嫩花莖洗消毒后進(jìn)行切分。將葉片沿中脈方向橫切兩刀、縱切一刀，平均分成六塊；將花朵沿縱軸將平均分成兩份；將花莖裁成1.5cm 左右的小段。將葉尖、葉中、近葉柄、花朵、花莖五種外植體分別接種到誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中，接種后定期觀察愈傷組織的生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方式對外植體消毒效果的影響（表1）

由表1 可知，隨著消毒劑次氯酸鈉濃度的升高，外植體的污染率逐漸降低，在次氯酸鈉濃度相同的情況下，消毒時間越長，外植體的污染率越低。處理5～9 的污染率都在10%左右，都明顯低于其它處理，其中處理6 的污染率最低，為6.7%，但是仍有2個污染發(fā)生，這可能是由消毒后的操作或環(huán)境污染導(dǎo)致。過高濃度的次氯酸鈉或長時間的消毒處理，可能會對外植體造成傷害，影響其后的生長。在處理6、7 中，外植體的生長開始變慢，在處理8 中生長明顯緩慢，并有少數(shù)葉片邊緣出現(xiàn)發(fā)黑甚至死亡的現(xiàn)象，在處理9 中出現(xiàn)較多葉片發(fā)黑死亡。綜合污染率和消毒后外植體的生長情況，處理5 是最佳的消毒方式，流水沖洗30min，2%次氯酸鈉浸泡消毒10min。

表1 不同消毒方式對外植體消毒效果的影響

2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)與分化

五種外植體的污染率差別不大，都在10%左右，證明篩選得到的消毒方式有效?；ǘ涞奈廴韭噬愿?，可能與花朵本身結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以消毒徹底有關(guān)。

三種葉片外植體的誘導(dǎo)率較高，都超過了60%，其中葉中的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到了70.4%。葉尖愈傷組織的形成稍晚，生長較慢，誘導(dǎo)芽數(shù)也最少；葉中易形成的較大愈傷組織，但是質(zhì)地較疏松，誘導(dǎo)芽數(shù)稍少；近葉柄愈傷組織的生長較適中，誘導(dǎo)芽數(shù)最多?；ǘ浣臃N后，子房部分膨大形成愈傷組織，初時生長緩慢，隨后逐漸加快，但是始終與葉片有較大差距，可能是由花朵形狀不規(guī)則，與培養(yǎng)基接觸較少，不利于對營養(yǎng)元素的吸收導(dǎo)致?；ǘ湔T導(dǎo)形成的愈傷組織體積較小，質(zhì)地致密，顏色黃綠，質(zhì)量較高，相同體積愈傷組織上誘導(dǎo)出的芽數(shù)要明顯高于葉片。花莖纖細(xì)，與培養(yǎng)基接觸最少，愈傷組織的發(fā)生最晚，生長十分緩慢，最終形成的愈傷組織體積很小，雖然誘導(dǎo)芽數(shù)最少，平均只有1.6個，但是幾乎每個花莖愈傷組織都有不定芽產(chǎn)生，且芽體粗壯，長勢最好?；ǘ浜突ㄇo分化出芽的能力明顯優(yōu)于葉片，但是兩者誘導(dǎo)形成愈傷組織的能力較弱，特別是花莖，難以支持大量不定芽的產(chǎn)生。將花朵和花莖作為外植體使用還有更大的局限，母本植物抽莖開花具有季節(jié)性，材料獲取的難度遠(yuǎn)高于葉片。大和錦葉片更易獲得，誘導(dǎo)形成愈傷組織的能力很強(qiáng)，誘導(dǎo)芽數(shù)也較多，特別是近葉柄，達(dá)到了6.7。所以，使用成熟葉片，特別是近葉柄，作為外植體更適合大和錦組織培養(yǎng)體系的建立。

3 討論與結(jié)論

污染現(xiàn)象是植物組培的三大難題之一。本試驗(yàn)以次氯酸鈉為消毒劑，對外植體的消毒方式進(jìn)行篩選，最終選擇2%次氯酸鈉溶液浸泡消毒10min，污染率得到了有效控制，外植體活力也較好。

大和錦的不同部位均能誘導(dǎo)出愈傷組織。雖然花莖和花朵分化出芽的能力更優(yōu)，但是受限于材料獲取困難。成熟葉片組織細(xì)胞高度特化，分化出芽的能力受到影響，但其誘導(dǎo)形成愈傷組織的能力很強(qiáng)，誘導(dǎo)出芽總數(shù)和平均誘導(dǎo)芽數(shù)都明顯多于花莖和花朵。所以以大和錦成熟葉片，特別是近葉柄端，作為外植體建立的組培體系可以有效避免使用花莖和花朵作為外植體的時限性，在較短的時間內(nèi)繁殖出大量的組培苗，為后續(xù)的商業(yè)化快速生產(chǎn)和新品種的培育提供了技術(shù)支持。