許國富 黃國強

[摘要] 目的 探討RON及其致癌型變異體RONΔ160在60例乳腺癌組織中的表達特征及其在診斷、臨床靶向治療及預(yù)后判斷中的潛在價值。 方法 用免疫組化、qPCR、Western blot等方法分析RON及RONΔ160在我院2016年10月～2018年1月收集的30例正常乳腺組織、30例乳腺良性腫瘤、60例乳腺癌患者及相對應(yīng)的60例癌旁組織中的表達特征及其與乳腺癌臨床分期、復(fù)發(fā)、組織學(xué)分型和組織轉(zhuǎn)移的關(guān)系。 結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示，RON在正常和癌旁及良性乳腺腫瘤組織中都低表達而在乳腺癌中高表達;而RONΔ160在正常和癌旁都不表達，在良性乳腺腫瘤組織中有輕微表達，而在乳腺癌中高表達。qPCR及Western blot結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。而結(jié)合臨床分析發(fā)現(xiàn)RON及RONΔ160的高表達與臨床分期、組織學(xué)分級及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)且具有統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論 RON及RONΔ160的表達與乳腺癌的發(fā)生相關(guān)及與其臨床分期和組織學(xué)分級及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，是乳腺癌診斷、臨床靶向治療及預(yù)后判斷的關(guān)鍵標志。

[關(guān)鍵詞] 乳腺癌;RON;RONΔ160;臨床分期

[中圖分類號] R735.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）02-0005-04

Expression of RON and its oncogenic variant RON Δ160 in breast cancer

XU Guofu? ?HUANG Guoqiang

Department of Pathology， the Second Affiliated Hospital of Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou? ?310005， China

[Abstract] Objective To investigate the expression characteristics of RON and its oncogenic variant RON Δ160 in 60 cases of breast cancer and their potential value in diagnosis， clinical targeted therapy and prognosis. Methods Immunohistochemistry， qPCR， Western blot and other methods were used to analyze the expression characteristics of RON and RONΔ160 in 30 normal breast tissues， 30 benign breast tumors， 60 para-breast cancer patients and 60 cases breast cancer tissues in our hospital from October 2016 to January 2018， and their relationship with clinical stage， recurrence， histological type and tissue metastasis of breast cancer. Results The results of immunohistochemistry showed that RON was lowly expressed in normal， para-breast cancer tissues and benign breast tumor tissues and highly expressed in breast cancer. RONΔ160 was not expressed in normal and para-breast cancer tissues， slightly expressed in benign breast tumor tissues， while highly expressed in breast cancer. qPCR and Western blot were consistent with the results of immunohistochemistry. Combined with clinical analysis， it was found that high expression of RON and RONΔ160 was associated with clinical stage， histological grade， and whether lymph node metastasis occurred， with statistically significant difference. Conclusion The expression of RON and RONΔ160 is positively correlated with the occurrence of breast cancer and its clinical stage and histological grade and lymph node metastasis. It is a key marker for breast cancer diagnosis， clinical targeted therapy and prognosis.

[Key words] Breast cancer; RON; RONΔ160; Clinical stage

乳腺癌作為女性最常見的惡性腫瘤，已經(jīng)威脅到了越來越多女性的生活，且發(fā)病趨勢年輕化。受體型酪氨酸激酶（RON）屬于MET原癌基因家族成員[1]，研究表明與正常組織相比，RON在乳腺癌組織中高表達，且與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]，但具體機制不知。RON表達的變化?？梢酝ㄟ^產(chǎn)生不同的mRNA剪切體、選擇性轉(zhuǎn)錄、蛋白平截等來產(chǎn)生不同的剪切異構(gòu)體，現(xiàn)已知有9種RON變異體[3]，研究顯示部分與癌癥的發(fā)病相關(guān)。其中RONΔ160具有誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)化、刺激腫瘤形成、促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的功能，同時還能誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及改變RON的磷酸酶活性[4，5]。由此我們猜測乳腺上皮細胞的癌變及惡化可能與RON的異型性表達相關(guān)。因此，本研究對我院2016年10月～2018年1月收集的60例乳腺癌患者及相對應(yīng)的60例癌旁組織、30例正常乳腺組織及30例乳腺良性腫瘤組織用免疫組化、實時熒光定量PCR（Real-time qPCR，qPCR）、Western blot等方法對RON及致癌性變異體RONΔ160在乳腺癌組織中的表達特征，及其與乳腺癌診斷的關(guān)系、與臨床的相關(guān)性進行了分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集我院2016年10月～2018年1月60例乳腺癌患者及相對應(yīng)的60例癌旁組織，同時收集30例正常乳腺組織和30例乳腺良性腫瘤組織。乳腺癌患者性別女，年齡25～81歲，中位年齡51歲。腫瘤直徑0.61～5.2 cm，平均3 cm。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例（58%）。組織學(xué)分級：高、中級分化46例（77%），低級分化14例（23%）。臨床分期：Ⅰ期4例（6.7%），Ⅱ期6例（10.0%），Ⅲ/Ⅳ期50例（83.3%）。

1.2 方法

1.2.1 實驗試劑? 4%PFA上海翊圣，TaKaRa RNAiso試劑盒，免疫組化試劑盒碧云天，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR購自TaKaRa，抗體購自CST，熒光定量PCR儀，包埋切片機，顯微鏡等儀器。

1.2.2 免疫組化? 乳腺組織經(jīng)收集后4%PFA固定2 d后，用石蠟進行包埋，切成4 μm厚的切片后用于免疫組化染色。切片梯度脫蠟后，抗原修復(fù)，之后恢復(fù)室溫，封閉1 h后，一抗過夜，此后以推薦濃度滴加相應(yīng)二抗37℃濕盒孵育20～30 min，PBS搖床漂洗5 min×3次，3% H2O2封閉10 min去除內(nèi)源性過氧化物酶。DAB顯色后，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化后反藍，此后用中性樹脂封片。以PBS為陰性，已知RON及RONΔ160表達組織為陽性，觀察著色情況。根據(jù)每張切片的陽性細胞百分數(shù)和染色強度計分的乘積來判定，<2分為陰性，2～3分為弱陽性，4～6分為陽性，>6分為強陽性。

1.2.3 qPCR? 用TaKaRa RNAiso試劑盒來提取組織中的總RNA后用分光光度計測定總mRNA的濃度。測定外濃度后用于逆轉(zhuǎn)成cDNA，所得產(chǎn)物用于熒光定量，20 μL體系，10 μL SYBR，上下游引物各0.5 μL，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL，雙蒸水8 μL。以18 s作為內(nèi)參基因。數(shù)值以（RQ=2-△△Ct）進行比較。CT=靶基因CT值-內(nèi)參考基因子CT值。

1.3 觀察指標

Western blot顯示結(jié)果及免疫組化染色情況和qPCR的比值與臨床之間的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)結(jié)果用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用t 檢驗，計數(shù)資料行χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RON及RON△160在乳腺癌組織中表達情況

封三圖1免疫組化結(jié)果所示，RON在乳腺的正常組織、乳腺癌癌旁組織及乳腺癌良性腫瘤中的表達量較低，而在乳腺癌中呈現(xiàn)出明顯的高表達狀態(tài);RONΔ160在正常和乳腺癌癌旁組織中不表達，在良性乳腺腫瘤組織中輕微表達，而在乳腺癌中呈高表達狀態(tài)。表1的qPCR及圖1的Western blot實驗的結(jié)果也證實了以上在免疫組化中得到的結(jié)論。

表1? qPCR檢測RON及RONΔ160在不同類型乳腺組織的表達量比較（x±s）

2.2 RON及RONΔ160的表達與乳腺癌進展的關(guān)系

將Western blot結(jié)果分成相應(yīng)的四個等級，陰、弱、中、強。然后通過結(jié)合臨床收集資料后進行分析。由表2，3可知RON及RONΔ160表達高低與乳腺癌是否發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，且RON及RONΔ160表達越高的患者，組織學(xué)分級及臨床分期都越高。

表2、3顯示，RON及RONΔ160的表達量與乳腺癌患者的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在乳腺癌患者中，兩者的表達量越高預(yù)示著腫瘤的轉(zhuǎn)移，同時也意味著組織學(xué)分級及臨床的病理分期越高，并且三個指標都具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。

表2? ?RON在不同病理分型分級的乳腺癌樣本中的表達量[n（%）]

表3? RONΔ160在不同病理分型分級的乳腺癌樣本中的表達量[n（%）]

3 討論

乳腺癌作為危害女性健康的首要疾病，成為表達女性主要病亡原因之一。且其近年來有發(fā)病比率升高及發(fā)病患者呈年輕化等趨勢[6]。乳腺癌作為一種高度異質(zhì)性腫瘤，目前的療法是以手術(shù)為主的化療、放療、生物及內(nèi)分泌治療等綜合療法，但是療效不佳。隨著近年來臨床研究和基礎(chǔ)研究的相結(jié)合，科研工作者發(fā)現(xiàn)很多信號通路都參與到乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，如PR、HER-2、Ki-67、BRCA1、BRCA2等分子通過對不同信號通路的調(diào)控來影響乳腺癌的發(fā)病進程[7，8]，通過對乳腺癌患者這些基因的檢測診斷后進行分子分型治療，能夠?qū)崿F(xiàn)對乳腺癌患者的精準醫(yī)療同時能夠有效的提高乳腺癌患者的預(yù)后生存水平[9]。而隨著基礎(chǔ)研究的深入及與臨床的結(jié)合，RON與乳腺癌的關(guān)系逐漸被研究者關(guān)注。

RON作為一種受體型酪氨酸激酶，是MET家族的一員，首先作為一種原癌基因被認識。最先在人的皮膚角化細胞中發(fā)現(xiàn)，后研究表明其表達具有組織和細胞特異性，主要表達于上皮細胞。在肺泡、甲狀腺等處幾乎全部缺失。作為其唯一配體，巨噬細胞刺激蛋白（MSP）與其結(jié)合有關(guān)[10]，能使RON快速二聚化后影響下游信號通路從而影響細胞行為。近年來，研究表明RON的信號失常是腫瘤發(fā)生及惡化的原因之一?，F(xiàn)已在多種癌癥中發(fā)現(xiàn)其異?；罨彤惓１磉_，但表現(xiàn)形式不同，大致分為表達增高，剪切異構(gòu)體的生成及與下游信號共同激活等幾種形式。此外，RON與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白間的功能交聯(lián)可導(dǎo)致腫瘤進展和惡變[11-12]。

同時基礎(chǔ)研究表明，RON的表達對于胚胎的正常發(fā)育具有必須的作用。RON全敲轉(zhuǎn)基因小鼠會死于胚胎形成期。而轉(zhuǎn)錄因子SP1（transcription factor Sp1，SP1）對于RON的激活具有重要的作用，SP1導(dǎo)致的RON的激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

近年來研究表明，RON在正常乳腺組織中低表達，而在50%的臨床分型乳腺癌樣本中高表達，且基礎(chǔ)小鼠體內(nèi)研究表明，構(gòu)建RON過表達或RON受體組成性激活的轉(zhuǎn)基因小鼠后乳腺組織RON表達明顯增高，乳腺增生和乳腺細胞高度轉(zhuǎn)移。RON過表達會導(dǎo)致乳腺癌的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)[13]，當(dāng)乳腺癌沒有出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移時，RON和c-MET之間的共表達的產(chǎn)生也會導(dǎo)致患者的預(yù)后變差，十年生存率僅11.8%，遠遠低于無兩者表達的患者的生存率，提示我們兩者可能相互協(xié)同作用，促進了乳腺癌的轉(zhuǎn)移及侵襲[14]。而MSP和RON位于染色體的3p21位置，研究表明兩者在癌癥中，同時該基因區(qū)在包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤和癌癥細胞系中發(fā)生基因擴增，該擴增可能會導(dǎo)致MSP或RON在乳腺癌患者中呈高表達狀態(tài)[15-16]，從而導(dǎo)致乳腺癌的惡化。而體外實驗表明，RON過表達會導(dǎo)致腫瘤細胞的遷移侵襲能力增強，抑制腫瘤細胞凋亡，促進細胞的增殖。而抑制RON的活性則會出現(xiàn)相反的結(jié)果。

但目前對于RON如何導(dǎo)致乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機制尚不清楚。而其剪切異構(gòu)體表達的變化可能是導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生及惡化的原因。RON的改變同時常常與選擇性前-mRNA剪接、蛋白的截短以及選擇性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RON變異體生成相伴隨[17]。在各種原發(fā)癌樣本和腫瘤細胞系中，目前至少有9個RON變異體已被識別出來，包括RONΔ160、RONΔ165、RONΔ155、RONΔ170、RONE5/6in等。根據(jù)缺陷部位的不同，RON變異體可以分為組成型激活、致瘤性或無生物活性[18]。而在乳腺癌等腫瘤中，主要的以RON△155、RONΔ165，RONΔ160出現(xiàn)較高的表達[19]。其中RONΔ160的作用是誘導(dǎo)細胞的轉(zhuǎn)化，通過各種因子刺激腫瘤發(fā)生，提高腫瘤的遷移侵襲能力。而RONΔ160的形成是由于RON的5號及6號外顯子109個氨基酸的缺失形成的，使得其在細胞外的半胱氨酸殘基失衡，從而導(dǎo)致自身二聚體的形成，引發(fā)持續(xù)激活[20-21]，從而誘導(dǎo)腫瘤細胞的內(nèi)生長相關(guān)信號處于級聯(lián)激活狀態(tài)，導(dǎo)致腫瘤在體內(nèi)的持續(xù)增長。同時研究表明，RONΔ160可以誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程中，細胞黏連相關(guān)蛋白如E-鈣粘蛋白等表達減少，而間質(zhì)細胞相關(guān)蛋白表達量上升，細胞變成梭形后具有更強的遷移和侵襲能力。因此我們推測RON過表達導(dǎo)致的乳腺癌的轉(zhuǎn)移及惡化可能與其剪切變異體RONΔ160的異常表達相關(guān)。

本研究首先用免疫組化的方法檢測了RON在乳腺組織的表達，結(jié)果顯示RON在正常組織中及癌旁和良性乳腺腫瘤中都表達量較低，而在乳腺癌組織中卻異常高表達。同時，獲取特異制備的RONΔ160抗體后，同樣用免疫組化的方法對相關(guān)組織進行檢測。發(fā)現(xiàn)RONΔ160在正常組織及癌旁組織中都不表達，在良性的乳腺腫瘤組織中有輕微表達，而在乳腺癌中卻呈現(xiàn)高表達。同時用熒光定量以及Western blot來檢測兩者在不同乳腺組織中的表達，結(jié)果都和組化顯示的結(jié)果一致，證明在乳腺癌中RON的高表達導(dǎo)致了RONΔ160的高表達，有可能是引起RON過表達所致乳腺癌的遷移和侵襲能力增強及惡化的原因。此后收集60例乳腺癌患者病灶及癌旁組織，通過Western blot實驗結(jié)合臨床記錄發(fā)現(xiàn)RON和RONΔ160高表達的患者的臨床分期以及組織學(xué)分級等級高，同時其高表達與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移的發(fā)生相關(guān)。且結(jié)果顯示具有統(tǒng)計學(xué)差異。

綜上所述，RON和RONΔ160在乳腺癌組織中相比正常組織高表達，并且其高表達導(dǎo)致了乳腺癌患者病情的惡化及淋巴轉(zhuǎn)移。因此對RON和RONΔ160在乳腺癌患者的異常表達及對腫瘤的影響，使得其有可能成為腫瘤進行分子分型的標志。同時可以作為臨床上判斷腫瘤惡性程度及是否轉(zhuǎn)移的標志。而對RON和RONΔ160表達與乳腺癌患者的耐藥與預(yù)后的相關(guān)性還有待研究。同時，臨床和基礎(chǔ)上對RON和RONΔ160在細胞生物學(xué)上如何影響細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來影響細胞的生物學(xué)行為將成為重要及必要的研究。

[參考文獻]

[1] Wang MH，Wang D，Chen YQ. Oncogenic and invasive potentials of human macrophage stimulating protein receptor，the RON receptor tyrosine kinase[J]. Carcinogenesis，2003，23（8）：1291-1300.

[2] Zinser GM，Leonis MA，Toney K，et al.Mammary-specific Ron receptor overexpression induces highly metastatic mammary tumors associated with beta-catenin activation[J].Cancer Res，2006，66（24）：11967-11974.

[3] Lu Yi，Yao HP，Wang MH. Multiple variants of the RON receptor tyrosine kinase：Biochemical properties，tumorigenic activities， and potential drug targets[J]. Cancer Letters，2007，257（2）：157-164.

[4] Kretschmann KL，Eyob H，Buys SS，et al.The macrophage stimulating protein /Ron pathway as a potential therapeutic target to impede multiple mechanisms involved in breast cancer progression[J].Curr Drug Targets，2010，11（9）：1157-1168.

[5] Greenbaum A，Rajput A，Wan G.RON kinase isoforms demonstrate variable cell motility in normal cells[J].Heliyon，2016，2（9）：e00153

[6] Goldhirsch A，Wood WC，Coates AS，et al. Strategies for subtypes-dealing with the diversity of breast cancer：Highlights of the St.Gallen international expert consensus on the primary therapy of early breast cancer 2011[J]. Ann Oncol，2011，22（8）：1736-1747.

[7] Robidoux A，Tang G，Rastogi P，et al. Lapatinib as a componen of neoadjuvant therapy for HER2-positive operable breast cancer（NSABP protocol B-41）：An open label，randomised phase 3 trial[J]. Lancet Oncol，2013， 14（12）：1183-1192.

[8] Venkitaraman AR. Cancer suppression by the chromosome custodians，BRCA1 and BRCA2[J].Science，2014， 343（6178）：1470-1475.

[9] 李挺.乳腺癌分子分型及臨床意義[J].中國實用外科雜志，2011，31（10）：952-954.

[10] Wang MH，Lee W，Luo YL，et al.Altered expression of the RON receptor tyrosine kinase in various epithelial cancers and its contribution to tumourigenic phenotypes in thyroid cancer cells[J].J Pathol，2007，213（4）：402-411.

[11] Sehrawat A，Singh SV.Short-form RON overexpression augments benzyl isothiocyanate-induced apoptosis in human breast cancer cells[J]. Mol Carcinog，2016，55（5）：473-485.

[12] 馬琪，虞碧霞，陳俊豐，等.受體型酪氨酸激酶RON及其在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用研究進展[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2016，30（7）：784-789.

[13] Camp ER，Liu W，F(xiàn)an F，et al. RON，a tyrosine kinase receptor involved in tumor progression and metastasis[J].Annals of Surgical Oncology，2015，12（4）：273-281.

[14] Thangasamy A，Rogge J，Ammanamanchi S.Regulation of RON tyrosine kinase-mediated invasion of breast cancer cells[J].J Biol Chem，2008，283（9）：5335-5343.

[15] Zabarovsky ER，Lerman MI，Minna JD，et al.Tumor suppressor genes on chromosome 3p involved in the pathogenesis of lung and others cancers[J].Oncogene，2002， 21：6915-6935.

[16] Welm AL，Sneddon JB，Taylor C，et al. The macrophage stimulating protein pathway promotes metastasis in a mouse model for breast cancer and predicts poor prognosis in humans[J].Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（18）：7570-7575.

[17] Chakedis J，F(xiàn)rench R，Babicky M，et al. A novel protein isoform of the RON tyrosine kinas receptor transforms human pancreatic duct epithelial cells[J]. Oncogene，2016， 35（25）：3249-3259.

[18] Wang MH，Kurtz AL，Chen YQ.Identification of a novel splicing product of the RON receptor tyrosine kinase in human colorectal carcinoma cells[J]. Carcinogenesis，2000， 21：1507-1512.

[19] Zhou YQ，He C，Chen YQ，et al. Altered expression of the RON receptor tyrosine kinase in human colorectal adenocarcinomas：Generation of different splicing variants and their oncogenic potential[J]. Oncogene，2003， 22：186-197.

[20] Ronsin C，Muscatelli F，Mattei MG，et al. A novel putative receptor protein tyrosine kinase of the met family[J].Oncogene，1993，8：1195-1202.

[21] Zhang K，Zhou YQ，Yao HP，et al. Alterations in a defined extracellular region of the RON receptor tyrosine kinase promote RON-mediated motile and invasive phenotypes in epithelial cells[J]. Int J Oncol，2010;36：255-264.

（收稿日期：2019-07-09）