劉春燕 張旗

根尖周囊腫是頜骨內(nèi)常見(jiàn)的牙源性囊腫，約占牙源性囊腫發(fā)病率的54.6%[1]。根尖周囊腫多由根管內(nèi)或根尖周部位的感染造成根尖區(qū)炎癥及免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致頜骨組織的吸收破壞[2]。在炎癥導(dǎo)致的骨吸收過(guò)程中，血管的增生有利于釋放細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，募集炎癥細(xì)胞及破骨細(xì)胞前體，從不同方面參與骨吸收過(guò)程[3]，提示血管生長(zhǎng)與骨破壞密切相關(guān)。根尖周囊腫長(zhǎng)期處于慢性炎癥刺激下，囊壁中毛細(xì)血管大量增生，調(diào)控其血管的生長(zhǎng)可能影響其骨吸收，但血管增生在其骨破壞過(guò)程中的作用尚未明確。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種強(qiáng)有力的促內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂因子，通過(guò)影響內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化和遷移調(diào)控血管生長(zhǎng)[4]。VEGF能夠增加血管通透性，促進(jìn)血漿蛋白滲出，造成炎癥組織水腫[5]。同時(shí)，VEGF還具有單核細(xì)胞趨化功能，促進(jìn)破骨細(xì)胞前體滲出并聚集于局部組織[6]；也有研究表明VEGF與M-CSF作用相似，可直接促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化與成熟[7]。已有學(xué)者證實(shí)VEGF在根尖周囊腫中高表達(dá)[8]，但其在根尖周囊腫骨吸收過(guò)程中的作用有待進(jìn)一步探討。

本研究探討根尖周囊腫骨破壞與血管增生之間的相關(guān)性，同時(shí)闡釋VEGF在囊腫血管化與骨破壞過(guò)程中扮演的角色。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

根尖周囊腫標(biāo)本(同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科)；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)試劑盒、VEGF抗體(武漢博士德)；CD34抗體(Abcam，美國(guó))；二抗及DAB顯色液(北京中杉金橋)；α-MEM培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))；胎牛血清(Excel，澳洲);RANKL(R&D，美國(guó))，小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7(ATCC?SC-6003)、貝伐單抗(Genentech Inc.,USA)；I型膠原酶、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)試劑盒(Sigma，美國(guó))；Trizol Reagent、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Life Technologies，美國(guó))；SYBR GREEN(Roche，瑞士)。

1.2 病例收集

收集2016 年9 月～2017 年12 月同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科經(jīng)根尖手術(shù)切除的根尖周囊腫病例32 例，納入標(biāo)準(zhǔn)為：由復(fù)旦大學(xué)腫瘤醫(yī)院病理科根據(jù)臨床特征、影像學(xué)及病理信息診斷為根尖周囊腫；全景片顯示根尖周囊腫邊界清晰；病歷信息完整(包括姓名、性別、年齡、及影像學(xué)信息等)； 3 個(gè)月內(nèi)未服用抗生素和其他激素類(lèi)藥物；無(wú)全身系統(tǒng)性疾病。選取6 例正頜手術(shù)患者頜骨骨松質(zhì)，提取骨髓間充質(zhì)成纖維細(xì)胞作為對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)已獲得患者知情同意，并取得同濟(jì)大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.3 HE染色及骨破壞面積測(cè)量

根尖周囊腫石蠟標(biāo)本切片4 μm厚，常規(guī)脫蠟、水化后， HE染色觀察。使用Image-Pro Plus 6.0測(cè)量全景片中根尖周囊腫低密度影像面積作為其骨破壞面積。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

根尖周囊腫石蠟標(biāo)本切片4 μm厚，常規(guī)脫蠟、水化后，以鼠抗人CD34抗體(1∶500)、鼠抗人VEGF抗體(1∶200)4 ℃過(guò)夜孵育，羊抗鼠生物素標(biāo)記二抗(1∶200) 37 ℃孵育1 h， DAB顯色，常規(guī)脫水、透明、封片[9]。使用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。隨機(jī)選取5 個(gè)400 倍鏡下視野，Image-Pro Plus 6.0測(cè)量血管腔面積，每個(gè)視野下血管面積之和計(jì)為微血管密度。VEGF表達(dá)量采用累積光密度(IOD)計(jì)算染色強(qiáng)度[10]。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

酶消化法與組織塊法分離提取14 例根尖周囊腫囊壁成纖維細(xì)胞和6 例頜骨骨髓間充質(zhì)成纖維細(xì)胞，原代培養(yǎng)于α-MEM[含1%雙抗(青霉素100 U/ml， 鏈霉素100 U/ml)， 2 mmol/L L-谷氨酰胺，10% 胎牛血清]中。于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6 ELISA及RT-qPCR

酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)檢測(cè)(ELISA)：取實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組P3代細(xì)胞的培養(yǎng)上清，用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)雙抗夾心法檢測(cè)上清中VEGF的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)：收集兩組P3代細(xì)胞，加入Trizol裂解液，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行定量PCR。引物設(shè)計(jì)如下：VEGF：5′-TTATGCGGATCAAACCTCACC-3′，5′-GAAGCTCAT-CTCTCCTATGTGC-3′； β-actin： 5′-CATGTACGGTTGCTATCCAGGC-3′，5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。

1.7 制備條件培養(yǎng)基和誘導(dǎo)RAW264.7破骨向分化

將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞接種于100 mm培養(yǎng)皿，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%～80%匯合時(shí)，更換無(wú)血清α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d， 550 g離心10 min，棄沉淀后，取50%上清、40%新鮮α-MEM、10% FBS和20 ng/μl RANKL混合制備條件培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)組條件培養(yǎng)基一式兩份，其中一份加入貝伐單抗作為加藥組。Raw264.7細(xì)胞以每孔1 000 個(gè)細(xì)胞接種于24 孔板， 3 組條件培養(yǎng)基分別誘導(dǎo)，每2 天換液至第10天。 TRAP染色，計(jì)數(shù)破骨細(xì)胞，僅TRAP陽(yáng)性且細(xì)胞核≥3 個(gè)的細(xì)胞計(jì)為破骨細(xì)胞。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 根尖周囊腫HE染色及影像學(xué)表現(xiàn)

本實(shí)驗(yàn)所有病例均表現(xiàn)出典型的根尖周囊腫特點(diǎn)，HE染色顯示囊腫纖維囊壁內(nèi)襯復(fù)層鱗狀上皮，上皮釘突發(fā)生不規(guī)則增生、伸長(zhǎng)，相互融合成網(wǎng)狀，纖維囊壁內(nèi)富含膠原纖維，可見(jiàn)較多慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。影像學(xué)表現(xiàn)為圍繞根尖的圓形或橢圓形低密度透射影像，周?chē)加忻芏仍龈叩墓前拙€(圖1)。

圖1 根尖周囊腫HE染色(A～B)及影像學(xué)表現(xiàn)(C) (A: ×40; B: ×200)

2.2 根尖周囊腫骨破壞面積與VEGF的表達(dá)及微血管密度成正相關(guān)

VEGF在根尖周囊腫的上皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)中呈陽(yáng)性表達(dá)。CD34陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞包繞形成的微血管廣泛分布于囊壁間質(zhì)中(圖2)?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果表明根尖周囊腫骨破壞面積與年齡、性別、部位等無(wú)關(guān)，但與VEGF的表達(dá)以及微血管密度成正相關(guān)(P<0.05)(表1)。

圖2 根尖周囊腫VEGF及血管免疫組織化學(xué)染色 (A、C： ×100； B、D： ×400)

表1 骨破壞面積與臨床病理特征的聯(lián)系 [n(%)]

2.3 根尖周囊腫囊壁成纖維細(xì)胞較對(duì)照組VEGF表達(dá)增高

RT-qPCR檢測(cè)根尖周囊腫囊壁成纖維細(xì)胞及頜骨骨髓間充質(zhì)成纖維細(xì)胞中VEGF的含量，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組VEGF的表達(dá)顯著增多(P<0.05)。ELSA檢測(cè)上述2 組細(xì)胞培養(yǎng)上清中的VEGF蛋白含量，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞較對(duì)照組分泌更多的VEGF，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

圖3 VEGF在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中的表達(dá)

2.4 根尖周囊腫囊壁成纖維細(xì)胞分泌的VEGF能有效促進(jìn)破骨細(xì)胞分化

收集上述2 組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，制備條件培養(yǎng)基，誘導(dǎo)細(xì)胞系RAW264.7破骨向分化，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組破骨細(xì)胞分化效率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。在根尖周囊腫組條件培養(yǎng)基中加入貝伐單抗抑制VEGF后，其破骨細(xì)胞誘導(dǎo)效率顯著下降(P<0.05)，如圖4所示。

A： 對(duì)照組(×400)； B： 實(shí)驗(yàn)組(×400)； C： 加藥組 (×400)

3 討 論

根尖周囊腫一般經(jīng)歷根尖周組織炎癥反應(yīng)、馬拉瑟上皮剩余增殖、液化壞死囊性變等一系列病理過(guò)程，造成頜骨組織破壞[11]。骨質(zhì)破壞范圍較大時(shí)可引起病理性骨折，但其骨破壞機(jī)制尚未明確。Zizzi等[12]研究發(fā)現(xiàn)囊腫中微血管密度增加、炎癥浸潤(rùn)程度增強(qiáng)、炎性蛋白滲出可能造成組織水腫，對(duì)頜骨產(chǎn)生壓迫性骨吸收。也有研究表明VEGF在慢性根尖周炎過(guò)程中表達(dá)增多，促進(jìn)血管增生及血管通透性增加[13]，但他們并未直接證實(shí)囊腫中血管增生及VEGF的表達(dá)與骨破壞之間的相關(guān)性，以及VEGF對(duì)破骨細(xì)胞的直接作用。因此本研究將從這兩方面對(duì)VEGF在根尖周囊腫骨破壞過(guò)程中的作用進(jìn)行探討。

本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)染色方法顯示VEGF在根尖周囊腫囊壁成纖維細(xì)胞、炎癥細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)中均有表達(dá)，微血管廣泛分布于囊壁間質(zhì)中。根尖周囊腫的骨破壞面積與囊壁中微血管密度、VEGF的表達(dá)強(qiáng)度成正相關(guān)。此結(jié)果表明囊腫中高表達(dá)的VEGF可通過(guò)促進(jìn)血管的增生從而增加其骨吸收功能。這與前人的研究結(jié)果一致[13-14]，Graziani等[15]研究證實(shí)根尖周囊腫囊壁間質(zhì)較上皮表達(dá)更高的VEGF，且其表達(dá)強(qiáng)度與微血管數(shù)目相關(guān)，后者與炎癥浸潤(rùn)程度相關(guān)。提示血管化在炎癥導(dǎo)致的骨吸收過(guò)程中的重要作用。而VEGF則能通過(guò)促進(jìn)血管生長(zhǎng)，增加血管通透性，從而使血漿蛋白滲出，囊液聚集，囊內(nèi)壓力增加，進(jìn)而促進(jìn)囊腫擴(kuò)大對(duì)頜骨產(chǎn)生壓迫性骨吸收[8,12,16]。

骨組織的破壞由破骨細(xì)胞所介導(dǎo)，破骨細(xì)胞表面表達(dá)VEGF受體，VEGF與其受體結(jié)合后能夠直接激活破骨細(xì)胞，促進(jìn)其成熟、分化并發(fā)揮骨吸收活性[17]。為進(jìn)一步探究VEGF對(duì)破骨細(xì)胞的作用，本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)了根尖周囊腫囊壁成纖維細(xì)胞，與頜骨骨髓間充質(zhì)成纖維細(xì)胞對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其較對(duì)照組高表達(dá)VEGF，且其破骨細(xì)胞誘導(dǎo)效率更高，而在加入貝伐單抗抑制VEGF后破骨細(xì)胞誘導(dǎo)效率顯著下降。這說(shuō)明根尖周囊腫囊壁成纖維細(xì)胞所分泌的VEGF能夠有效促進(jìn)破骨細(xì)胞分化。也有研究表明在多種骨吸收疾病中，VEGF作為一種募集破骨細(xì)胞前體的重要分子[6]，能夠增加破骨細(xì)胞前體從血管中滲出，從而增加局部組織中破骨細(xì)胞的來(lái)源。VEGF通過(guò)影響破骨細(xì)胞的來(lái)源、分化、成熟及其功能，最終促進(jìn)骨質(zhì)吸收破壞[18]。

綜上所述，根尖周囊腫囊壁高表達(dá)的VEGF一方面可通過(guò)促進(jìn)血管增生，血管通透性增加，炎癥因子及血漿蛋白滲出，導(dǎo)致囊液聚集，囊腫擴(kuò)大而產(chǎn)生壓迫性骨吸收；另一方面，VEGF通過(guò)募集破骨細(xì)胞前體，并直接作用于破骨細(xì)胞促進(jìn)其分化成熟，進(jìn)一步加劇了根尖周囊腫的骨破壞。VEGF在囊腫骨破壞過(guò)程中的重要作用，使得它可能成為臨床上對(duì)于根尖周囊腫診斷及治療的一個(gè)新靶點(diǎn)，但還需進(jìn)一步深入研究其中的作用機(jī)制。