王一航，洪仕君，鐘磊磊，解潤芳，彭艷霞，李利華

（昆明醫(yī)科大學法醫(yī)學院，云南昆明 650500）

甲基苯丙胺（methamphetamine，MA），俗稱冰毒，是一種人工合成的中樞神經(jīng)興奮劑，是當前濫用人數(shù)最多的毒品。氯胺酮（ketamine，KET）為苯環(huán)己哌啶衍生物，俗稱“K”粉，是非競爭性N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）受體拮抗劑，為靜脈麻醉藥，具有一定的致幻效應和精神依賴性，已成為第二大濫用的合成毒品[1]。研究表明，MA 與KET 主要作用于中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)（mesolimbic dopamine system，MLDS），導致多巴胺（dopamine，DA）、五羥色胺（5-HT）等神經(jīng)遞質釋放，使中腦邊緣系統(tǒng)DA 濃度增加從而產(chǎn)生欣快感，使精神活動增強，致藥物成癮[2-4]。目前MA 與KET 聯(lián)合濫用趨勢嚴重，已成為當今全球最嚴重的公共衛(wèi)生問題之一[5-6]。MA 和KET 聯(lián)合濫用者出現(xiàn)的興奮癥狀、精神病性癥狀和停藥后的戒斷期癥狀都比單一濫用者要嚴重[7-8]。因此，本研究旨在探討甲基苯丙胺和氯胺酮聯(lián)合濫用依賴大鼠DA、5-HT、MAO 的表達變化及其對大鼠條件位置偏愛的影響，對甲基苯丙胺、氯胺酮及兩藥聯(lián)合濫用的精神依賴性和成癮機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠，體重（200±20）g，由昆明醫(yī)科大學實驗動物學部提供。

1.2 藥品及試劑

甲基苯丙胺鹽酸鹽（云南公安刑事科學技術研究所提供甲基苯丙胺片劑，由云南大學化學實驗室提純）；鹽酸氯胺酮注液（云南雙鶴醫(yī)藥有限公司，批號130221），所有藥物用生理鹽水溶解后配制成所需濃度，所有藥物配制后放置4℃冰箱保存。

BCA 蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術研究所）；大鼠多巴胺（DA）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒、大鼠單胺氧化酶（MAO）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒、大鼠五羥色胺（5-HT）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（上海將來實業(yè)股份有限公司，貨號JL12965、JL13513、JL13043）。

1.3 儀器

鼠博士·條件性位置偏愛視頻分析系統(tǒng)（包括計算機、攝像頭、RD1111-CPP-R1 實驗箱體、動物行為學視頻分析系統(tǒng)，版本V2.8.9.5）（上海移數(shù)信息科技有限公司）；超凈工作臺（蘇州凈化公司產(chǎn)品）；手持超聲波細胞破碎儀（上海啟前電子科技有限公司）；高速低冷離心機（湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司）；Synergy HT 酶標儀（美國Bio-Tek 公司）。

1.4 方法

1.4.1 甲基苯丙胺依賴大鼠模型的建立、分組和給藥給藥前用鼠博士·條件性位置偏愛視頻分析系統(tǒng)對實驗大鼠進行位置偏愛測定，將停留時間短的實驗箱作為伴藥箱。剔除對某一側實驗箱有明顯偏愛的大鼠。

實驗動物分組:取符合實驗條件的36 只大鼠，按隨機原則分為六個組:即（1）正常對照組（Sal組）；（2）甲基苯丙胺(2 mg/kg)組（MA 組）；（3）氯胺酮低劑量(15 mg/kg)組（K15 組）；（4）氯胺酮中劑量(30 mg/kg)組（K30 組）；（5）甲基苯丙胺＋氯胺酮低劑量(2 mg/kg+15 mg/kg)組（MK15組）；（6）甲基苯丙胺+氯胺酮中劑量(2 mg/kg+30 mg/kg)組（MK30 組）（聯(lián)用組是藥物混合同時給藥）。

條件性位置偏愛實驗（CPP）模型建立：（2）～（6）組奇數(shù)天上午（8:00）腹腔注射（ip）相應劑量藥物，偶數(shù)天上午（8:00）ip 等體積生理鹽水；（1）組每天上午（8:00）ip 同體積生理鹽水；共計10 d。第11 天上午（8:00）進行條件位置偏愛檢測。

1.4.2 ELISA 法檢測腦內MAO、DA、5-HT 表達變化完成CPP 測定后，立即將各組大鼠麻醉后快速斷頭處死，根據(jù)包新民的大鼠腦立體定位圖譜，冰上迅速分離前額葉皮質、伏隔核及中腦腹側被蓋區(qū)，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將所取腦區(qū)精確稱重后放入預冷的PBS（含有蛋白酶抑制劑）中在冰上進行勻漿，提取蛋白，用BCA 法測定蛋白濃度，采用ELISA 法分別檢測相關腦區(qū)MAO、DA、5-HT 的含量變化。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 行為學結果

2.1.1 與給藥前比較Saline 組大鼠給藥前后在伴藥箱中的停留時間無明顯變化（P＞0.05）；MA 組、K15 組、K30 組、MK15 組、MK30 組大鼠給藥后在伴藥箱中的停留時間均明顯延長，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明MA 組、K15 組、K30 組、MK15 組、MK30 組大鼠經(jīng)給藥后，形成明顯的條件性位置偏愛，大鼠CPP 模型成功建立，見表1。

2.1.2 與Saline 組比較MA 組、K15 組、K30組、MK15 組、MK30 組大鼠給藥前后的伴藥箱停留時間差均明顯延長，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1。

2.1.3 單用藥組與聯(lián)合用藥組比較與MA 組比較，MK15、MK30 聯(lián)合用藥組大鼠給藥后在伴藥箱中的停留時間增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與對應劑量的氯胺酮組比較，聯(lián)用組大鼠給藥后在伴藥箱中的停留時間減少，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1。

表1 各組大鼠給藥前后在伴藥箱中的停留時間［s，（±s）］Tab.1 Duration of the stay of the rats in each group in the drug-paired compartment before and after the administration［s，（±s）］

表1 各組大鼠給藥前后在伴藥箱中的停留時間［s，（±s）］Tab.1 Duration of the stay of the rats in each group in the drug-paired compartment before and after the administration［s，（±s）］

與給藥前比較，**P＜0.01，***P＜0.001。

圖1 CPP 指數(shù)Fig.1 CPP Score

2.2 ELISA 檢測結果

2.2.1 大鼠腦內DA 的含量如圖2 所示，與MA組相比，MK15 組前額葉皮質，伏隔核DA 含量呈降低趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；MK30組伏隔核及中腦腹側被蓋區(qū)DA 含量呈降低趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。與K15 組相比，MK15 組伏隔核，中腦腹側被蓋區(qū)DA 含量都呈升高趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。與K30組相比，MK30 組伏隔核DA 含量呈升高趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.2.2 大鼠腦內5-HT 的含量如圖2 所示，與MA 組相比，MK15 組前額葉皮質，伏隔核5-HT含量呈降低趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與K15 組相比，MK15 組伏隔核5-HT 含量呈升高趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2.3 大鼠腦內MAO 的含量如圖2 所示，與MA 組相比，MK15 組伏隔核及中腦腹側被蓋區(qū)MAO 含量呈降低趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；MK30 組伏隔核及中腦腹側被蓋區(qū)MAO 含量呈降低趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與K15 組相比，MK15 組伏隔核，中腦腹側被蓋區(qū)MAO 含量呈升高趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖2 DA、5-HT、MAO 在前額葉皮質，伏隔核和中腦腹側被蓋區(qū)的表達情況Fig.2 Expression of DA，5-HT and MAO in prefrontal cortex，nucleus accumbens and ventral tegmental area

3 討論

CPP 是評價心理依賴的經(jīng)典模型[9]。本實驗結果顯示，與Saline 組大鼠相比，MA 組、K 組及MK 組大鼠均出現(xiàn)了明顯的CPP 效應（有顯著性差異），這表明無論是單獨給藥還是聯(lián)合給藥均可以誘導大鼠產(chǎn)生CPP 效應。此外，在同等KET 劑量下，MK 組伴藥箱停留時間較KET 單用組短；MK組比KET 組產(chǎn)生的CPP 效應低，比MA 組產(chǎn)生的CPP 效應高（無顯著性差異），表明聯(lián)合給藥可以誘導大鼠產(chǎn)生CPP 效應，但相對于單獨用藥，這種CPP 效應并沒有顯著提高，甚至發(fā)生了降低。有學者通過對斑馬魚的依賴模型研究發(fā)現(xiàn)，氯胺酮可以減弱甲基苯丙胺的CPP 效應[10-12]。單胺氧化酶（MAO）對DA、5-HT、去甲腎上腺素等單胺類神經(jīng)遞質具有高度親和性，是DA 降解過程中的限速酶，在單胺類神經(jīng)遞質的降解代謝過程中發(fā)揮著重要的作用。有研究報道，MA 可抑制MAO 活性，使DA 的代謝受到抑制，導致腦內DA 積聚而產(chǎn)生神經(jīng)和精神作用[13]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，MA 組的DA 與5-HT 表達均呈一致性增加，而MAO 在不同腦區(qū)的酶活性表達存在一定的差異，在前額葉皮質中MAO 表達降低，在伏隔核及中腦腹側被蓋區(qū)中MAO 表達增加，表明DA、5-HT 及MAO 表達可能與MA 的CPP 效應有關，同時，提示藥物在不同腦區(qū)中作用存在差異性以及MAO 在不同腦區(qū)存在一定的表達差異。MAO 分解DA 產(chǎn)生氧活性代謝產(chǎn)物，氧化應激導致DNA、蛋白質等的損傷和功能喪失，為神經(jīng)毒性的重要機制[14]。本實驗MA 組的MAO 與DA、5-HT 的表達趨勢基本相同，可能此給藥方式?jīng)]有造成嚴重的神經(jīng)毒性。Morgan 等[15]表示小劑量的MA 或KET 多次濫用很少產(chǎn)生神經(jīng)毒性。提示本實驗可能表現(xiàn)為輕微的神經(jīng)遞質變化和大鼠的成癮效應，但沒有引起顯著的毒理性改變。通過與MA 組對比發(fā)現(xiàn)，聯(lián)用組的DA、5-HT 及MAO 表達均呈一致性降低，結合行為學實驗結果表明DA、5-HT 及MAO 的表達水平與聯(lián)用組的CPP 效應沒有顯著提升有關，可能是動物行為學改變的神經(jīng)生物學機制之一。

綜上所述，DA、5-HT 及MAO 在甲基苯丙胺與氯胺酮成癮中發(fā)揮著重要作用，甲基苯丙胺與低中劑量氯胺酮單用及聯(lián)合都可形成明顯的CPP 效應，但聯(lián)合給藥相對于單獨用藥，這種CPP 效應并沒有顯著提高，同時，聯(lián)合濫用大鼠腦內DA、5-HT 及MAO 的表達較單獨MA 給藥的水平降低，提示DA、5-HT 及MAO 表達降低與聯(lián)用組的CPP效應沒有顯著提高有關，其中的作用機制及甲基苯丙胺與氯胺酮聯(lián)合濫用致成癮的機制仍需進一步研究。