馬敏，張顏茹，張?zhí)K玲，張臻，樊進(jìn)補(bǔ)，吳昌琦，劉志強(qiáng)，任雅倩，張紹鈴 ，王利斌

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210095）

梨（Pyrusspp.）是世界性的重要的落葉果樹，我國是世界上最大的梨生產(chǎn)國，主要分布在河北、遼寧、山東、江蘇等省。翠玉梨是一種早熟梨品種，品質(zhì)好，營養(yǎng)價(jià)值高，深受消費(fèi)者喜愛。梨樹春季開花較早，經(jīng)常遭遇晚霜危害[1]。我國地域廣闊，農(nóng)作物栽培面積廣，每年平均霜凍危害面積達(dá)34 萬hm2，最嚴(yán)重的年份達(dá)到77 萬hm2，造成至少30 億元的損失[2]。近年來，我國北方地區(qū)晚霜凍害尤其嚴(yán)重。一些春季開花早的果樹經(jīng)常遇到晚霜危害，輕者減產(chǎn)，重者絕收[3]。霜凍，又稱為凍害，是指0 ℃或0 ℃以下的低溫使植物組織內(nèi)結(jié)冰引起的傷害[1]。霜凍的種類有多種，依據(jù)霜凍發(fā)生的季節(jié)，分為春季霜凍、秋季霜凍、冬季霜凍。其中，春季霜凍（俗稱“倒春寒”）對(duì)果樹危害最嚴(yán)重，因?yàn)榇藭r(shí)果樹多處于花期或幼果期，器官對(duì)低溫的抵抗能力較弱[1,4]。凍害程度與植物的種類、器官、生育時(shí)期、生理狀態(tài)等有很大的關(guān)系[1,5-6]。對(duì)果樹而言，樹勢(shì)越弱或樹體營養(yǎng)越不足，凍害越嚴(yán)重。霜凍強(qiáng)度愈大，持續(xù)時(shí)間愈長，受害程度也愈重[1]。相關(guān)研究表明，霜凍導(dǎo)致落花落果多是由于花和幼果細(xì)胞膜被破壞而引起的[3]。活性氧自由基包括羥自由基（·OH）、單線態(tài)氧（'O2）、H2O2、O2·-等與脂氧合酶（LOX）共同啟動(dòng)了膜質(zhì)過氧化[3]。在正常植物細(xì)胞中存在酶促和非酶促抗氧化防御系統(tǒng)，使活性氧自由基保持在一定范圍內(nèi)，阻止其對(duì)細(xì)胞膜的攻擊[7]。當(dāng)植物體遇到低溫脅迫時(shí)，活性氧快速積累，活性氧清除能力下降，膜脂過氧化加劇，使膜透性增加，細(xì)胞內(nèi)含物大量流失導(dǎo)致細(xì)胞死亡[8]。丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，它是由體內(nèi)活性氧自由基引發(fā)的不飽和脂肪酸降解而產(chǎn)生的[9]。MDA 的積累在一定程度上反映了體內(nèi)活性氧自由基活動(dòng)的狀態(tài)。

多年來，國內(nèi)外許多學(xué)者圍繞果樹凍害方面做了一些研究，但有關(guān)梨幼果凍害的研究相對(duì)較少。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，某些防凍劑可提高抗氧化酶活性，抑制花或幼果膜脂過氧化[1,3]。如李志軍等[3]在黃金梨子房膨大期采用3 種防凍劑（天達(dá)2116、必博PBO 和碧護(hù)）處理低溫脅迫下幼果膜脂過氧化，結(jié)果表明，天達(dá)2116 和必博PBO 處理對(duì)減輕梨幼果凍害的效果較好。但是該研究存在以下諸多缺陷：以帶黃金梨幼果的枝條為試材，與植株相比，存在一定的差異；降溫過程與實(shí)際生產(chǎn)實(shí)踐存在一定的差距；防凍劑的用量也并未標(biāo)明，缺乏試驗(yàn)驗(yàn)證。因此，試驗(yàn)結(jié)果對(duì)實(shí)踐的指導(dǎo)意義有限。本研究以翠玉梨花后12 d 子房膨大期的幼果為試材，采用帶幼果的植株（2 年生），模擬田間霜降過程，比較了不同防凍劑（必博PBO、天達(dá)2116、調(diào)環(huán)酸鈣、SA、維生素E+丙三醇、脫落酸、6-BA、甜菜堿、脯氨酸、γ-氨基丁酸和殼聚糖）處理對(duì)幼果膜質(zhì)過氧化的影響，并結(jié)合試驗(yàn)驗(yàn)證，篩選出可減輕翠玉梨幼果凍害的防凍劑，為預(yù)防和緩解果樹晚霜凍害提供理論依據(jù)現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料翠玉于2017 年3 月20 日采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)湖熟實(shí)驗(yàn)基地，樹齡為2 年，果園土壤為沙壤土，管理水平較高。選擇生長勢(shì)一致的植株為試驗(yàn)樹。

1.2 試驗(yàn)試劑及濃度

必博PBO 300 倍液：主要成分有稀效唑、細(xì)胞分裂素BA、生長素衍生物ORE 和增糖著色劑、早熟劑、膨大劑、防凍劑、防裂素、殺菌劑、光亮潔凈劑以及10 多種微量元素，是一種功能較齊全的果樹營養(yǎng)型生長調(diào)節(jié)劑。由四川省（農(nóng)科院）月蘭科技開發(fā)公司生產(chǎn)。

天達(dá)2116 1 000 倍液：主要成分為海洋生物活性物質(zhì)、細(xì)胞膜穩(wěn)態(tài)物質(zhì)、誘導(dǎo)抗病物質(zhì)，內(nèi)含復(fù)合氨基低聚糖、有機(jī)質(zhì)、微量元素等23 種成分，具有肥藥雙功能。在植物遭受霜凍后，有一定的修復(fù)作用。由山東天達(dá)生物制藥股份有限公司生產(chǎn)。

50 mg/L 調(diào)環(huán)酸鈣，南京億迅生物科技有限公司；3.62 mmol/L 水楊酸（Salicylic acid，SA），麥克林；0.25%維生素E，麥克林；5%丙三醇，阿拉??；18 mg/L 脫落酸，源葉生物；0.5 mg/L 6-芐氨基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）、10 mmol/L 甜菜堿、5 mmol/L 脯氨酸、10 mmol/Lγ-氨基丁酸、0.75%殼聚糖，均為源葉生物生產(chǎn)。

1.3 儀器與設(shè)備

JA1203 精密電子天平（10D101-150-0001-0500），上海良平儀器儀表有限公司；CT15RT 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，日立/Hitach；Tecan Infinite F200/M200 Molecular Devices型多功能酶標(biāo)儀，瑞士/Tecan。

1.4 試驗(yàn)設(shè)置

1.4.1 霜凍時(shí)間對(duì)幼果膜脂過氧化的影響

授粉12 d 后，利用人工氣候室模擬自然界的霜降過程——以4 ℃/h 的速度從15 ℃開始降溫，在-2 ℃下維持0、1、2、3、4、5 h 后，分別在不同時(shí)間點(diǎn)取大小一致、位置不同的幼果測(cè)定MDA 含量。依據(jù)MDA-凍害時(shí)間變化曲線，選擇MDA 含量提高40%左右的時(shí)間點(diǎn)作為低溫處理時(shí)間。

人工氣候室中具體的溫度變化見圖1。以4 ℃/h 的速度從15 ℃開始降溫，在-2 ℃下維持3 h 后，再以5 ℃/h的速度升溫至18 ℃并維持2 h，分別在不同時(shí)間點(diǎn)取大小較為一致、位置不同的幼果測(cè)定其中MDA 含量。

1.4.2 不同防凍劑的篩選

于授粉后10 d 即在幼果期，選擇生長狀況好的幼苗分別進(jìn)行10 種化學(xué)防凍劑的噴施，連續(xù)噴施3 d，每次噴至雨淋狀（500 mL），每種防凍劑設(shè)置3 棵，掛牌標(biāo)明每棵樹噴施的防凍劑種類和噴施時(shí)間對(duì)照樹每天噴施500 mL 清水，2 d 后放入人工氣候室進(jìn)行低溫處理。取大小一致、位置不同的幼果測(cè)定MDA 含量。

1.4.3 6-BA、SA 防凍效果驗(yàn)證

將試驗(yàn)1.4.2 選出來的防凍劑0.5 mg/L 6-BA、3.62 mmol/L SA 進(jìn)行單獨(dú)/組合噴施，噴至雨淋狀（500 mL），以清水處理（CK）為對(duì)照，2 d 后放入人工氣候室進(jìn)行低溫處理。取大小一致、位置不同的幼果測(cè)定MDA 含量。

1.4.4 次年進(jìn)一步驗(yàn)證抗凍劑的效果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)1.4.3 的結(jié)果，次年于授粉后10 d 即幼果期噴施化學(xué)防凍劑，噴至雨淋狀（500 mL），以清水處理（CK）為對(duì)照，2 d 后放入人工氣候室進(jìn)行低溫處理。取大小一致、位置不同的幼果測(cè)定MDA 含量。

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

MAD 含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸比色法[10]。取0.5 g幼果樣品，加5%三氯乙酸（TCA）5 mL，研磨后所得的研漿在3 000 r/min 下離心10 min。取上清液2 mL，加0.67%硫代巴比妥酸（TBA）2 mL，混合后于100 ℃水浴30 min，冷卻后離心。分別測(cè)定上清液在450、532、600 nm處的吸光值。丙二醛濃度計(jì)算公式見式（1），再進(jìn)一步計(jì)算出單位鮮重植物組織中MDA 含量。

MDA 濃度c/(nmol/L)=6.45×(A532-A600)-0.56×A450（1）

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA），多重比較檢驗(yàn)差異顯著性，用Excel 軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 霜凍時(shí)間對(duì)幼果膜脂過氧化的影響

有研究表明，霜凍導(dǎo)致的落花落果多是由于花和幼果細(xì)胞膜被破壞而引起的，活性氧自由基在這一過程中起重要作用[3]。低溫脅迫下幼果MDA 含量的變化可直接反映出細(xì)胞膜被氧化的程度以及細(xì)胞膜的通透性。如圖2 所示，低溫脅迫起始時(shí)，翠玉梨幼果MDA 含量為4.02 nmol/g。隨著低溫處理時(shí)間的延長，MDA 含量逐漸增加。低溫處理3 h 和5 h，幼果中MDA 含量分別為5.71 nmol/g和7.09 nmol/g；與低溫脅迫起始時(shí)相比，分別顯著提高了42.21%和極顯著提高了76.56%。依據(jù)MDA-凍害時(shí)間變化趨勢(shì)圖，選擇MDA 含量提高40%左右的時(shí)間點(diǎn)作為以下試驗(yàn)的低溫處理時(shí)間，即低溫處理時(shí)間定為3 h。

2.2 不同防凍劑對(duì)幼果凍害的效果

前人研究發(fā)現(xiàn)，防凍劑可有效減輕梨幼果的凍害[3]，不同防凍劑處理對(duì)減輕梨幼果膜脂過氧化傷害的效果見圖3。由圖可知，6-BA 和SA 處理的幼果中MDA 含量顯著低于對(duì)照組（P<0.05），分別為5.490、5.537 mmol/L，凍害減輕了18.46%和17.78%，說明其可有效減輕翠玉梨幼果膜脂過氧化。調(diào)環(huán)酸鈣、脯氨酸、天達(dá)2116、γ-氨基丁酸、殼聚糖、必博PBO、甜菜堿，維生素E+丙三醇處理對(duì)減輕果實(shí)凍害無明顯效果。此外，維生素E+丙三醇反而加重了果實(shí)的凍害（P<0.05）。

2.3 不同防凍劑組合對(duì)幼果凍害的效果

將篩選出來6-BA 和SA 進(jìn)行單獨(dú)/組合噴施，并于低溫處理后測(cè)定翠玉梨幼果MDA 含量，結(jié)果見圖4。由圖4 可知，6-BA、SA 及其組合處理均可顯著抑制幼果中MDA 的增加（P<0.05）；其中，6-BA 結(jié)合SA 處理效果更好。低溫處理3 h 后，6-BA+SA 處理組果實(shí)MDA 含量為5.143 nmol/g，與對(duì)照組相比，下降了20.14%。

2.4 6-BA+SA 組合對(duì)低溫凍害效果的驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證2.3 試驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性，次年對(duì)篩選出來的0.5 mg/L 6-BA+3.62 mmol/L SA 做進(jìn)一步的低溫凍害試驗(yàn)，結(jié)果見圖5。由圖5 可知，低溫脅迫后，對(duì)照組和6-BA+SA 處理組果實(shí)中MDA 含量分別為7.022、5.736 nmol/g，兩者差異顯著（P<0.05）。研究結(jié)果表明，0.5 mg/L 6-BA+3.62 mmol/L SA 可顯著減輕翠玉梨幼果的凍害。

3 討論

Cao 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長，果實(shí)中活性氧（H2O2和O2·-等）含量逐漸提高。李志軍等[3]以黃金梨幼果為試材，研究發(fā)現(xiàn)隨著低溫脅迫時(shí)間延長，細(xì)胞膜的破壞程度越大，MDA 和相對(duì)電導(dǎo)率越高。

6-BA 是一種較活躍的細(xì)胞分裂素，也是農(nóng)業(yè)和園藝生產(chǎn)上應(yīng)用最廣的細(xì)胞分裂素之一[12]。6-BA 可以促進(jìn)細(xì)胞分裂、促進(jìn)芽的分化、促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)大、延緩葉片衰老、提高植物的抗逆性等[12,13]。SA 是植物體內(nèi)產(chǎn)生的一種簡單酚類物質(zhì)，在植物抵御病原菌入侵以及提高植物非生物脅迫的抗逆中有重要作用[14]。前人研究發(fā)現(xiàn)，外源6-BA或SA 處理均可顯著提高植株/果實(shí)的抗寒能力[15-18]。

本研究與李志軍等[3]的研究結(jié)果存在差異，分析原因可能是梨品種不一致，防凍劑的最適濃度也不盡相同。本研究表明，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長，翠玉梨幼果膜脂過氧化程度逐漸增加；霜凍前采用0.5 mg/L 6-BA 或3.62 mmol/L SA 處理均可有效抑制膜脂過氧化，減輕幼果凍害。進(jìn)一步對(duì)篩選出來的抗凍劑進(jìn)行組合和驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，0.5 mg/L 6-BA+3.62 mmol/L SA 處理對(duì)減輕翠玉梨幼果凍害的效果最好。