柳曉峰 安玉芳 崔立建

摘 要 目的：考察烏頭注射液對膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）模型兔體內(nèi)軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（COMP）、抑癌基因p53編碼蛋白（p53蛋白）、骨形成蛋白2（BMP-2）等因子的影響，探討該注射液治療KOA的作用機(jī)制。方法：將24只兔隨機(jī)分為空白組、模型組、玻璃酸鈉組、烏頭注射液組，每組6只。除空白組兔不作任何處理外，分別在第1、4、7天時(shí)于模型組、玻璃酸鈉組、烏頭注射液組兔關(guān)節(jié)腔注射2%木瓜蛋白酶溶液-0.03 mol/L L-半胱氨酸溶液以建立KOA模型;在造模成功后第1、4、7天時(shí)，分別于其關(guān)節(jié)腔注射生理鹽水、玻璃酸鈉注射液、烏頭注射液各0.1 mL/kg。上述4組兔分別在給藥結(jié)束后抽取關(guān)節(jié)液，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定COMP和p53蛋白含量;肉眼觀察兔膝關(guān)節(jié)軟骨形態(tài);取膝關(guān)節(jié)軟骨組織，采用蘇木精-伊紅法染色后于光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)改變并進(jìn)行Mankin評(píng)分;采用PV二步法制作膝關(guān)節(jié)軟骨組織的免疫組化標(biāo)本，檢測BMP-2的相對表達(dá)量。結(jié)果：與空白組比較，模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨邊緣破壞，軟骨面有缺損;組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，膝關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)明顯不規(guī)則，軟骨細(xì)胞可見明顯擴(kuò)大，有白泡樣改變，細(xì)胞間分布紊亂，且Mankin評(píng)分顯著升高（P<0.05）;膝關(guān)節(jié)液中COMP、p53蛋白含量顯著升高，膝關(guān)節(jié)軟骨組織中BMP-2相對表達(dá)量顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組兔膝關(guān)節(jié)軟骨的外觀和組織形態(tài)學(xué)變化均有所改善，Mankin評(píng)分顯著降低（P<0.05）;膝關(guān)節(jié)液中COMP、p53蛋白含量顯著降低，膝關(guān)節(jié)組織中BMP-2相對表達(dá)量顯著升高（P<0.05），但烏頭注射液組與玻璃酸鈉組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：烏頭注射液具有改善KOA模型兔膝關(guān)節(jié)滑膜炎癥、延緩關(guān)節(jié)軟骨退變、保護(hù)關(guān)節(jié)的作用;其機(jī)制可能與抑制COMP分泌、降低p53蛋白表達(dá)、促進(jìn)BMP-2釋放有關(guān)。

關(guān)鍵詞 烏頭注射液;膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎;軟骨寡聚基質(zhì)蛋白;p53蛋白;骨形態(tài)發(fā)生蛋白2;兔

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the effects of Aconitum injection on cartilage oligomeric matrix protein（COMP）， encoded protein by tumor suppressor gene p53 （p53 protein） and bone morphogenetic protein 2（BMP-2） in knee osteoarthritis （KOA） model rabbit， so as to explore the mechanism of the injection in the treatment of KOA. METHODS： Totally 24 rabbits were randomly divided into blank group，model group， Sodium hyaluronate group and Aconitum injection group， with 6 rabbits in each group. KOA model was established by injecting 2% papain-0.03 mol/L L-cysteine solution into the articular cavity of rabbits in model group， sodium hyaluronate group and Aconitum injection group at the 1st， 4th and 7th day， respectively， except the blank group. At the 1st， 4th and 7th day after modeling succeeded， 0.1 mL/kg of normal saline， Sodium hyaluronate injection and Aconitum injection were injected into the articular cavity of rabbits， respectively. The cartilage tissue of knee joint was taken from above 4 groups， and the contents of COMP and p53 protein were detected by ELISA. The cartilage morphology of rabbit knee joint was observed by naked eye. The cartilage of the knee joint was collected and stained by HE staining， and then the histomorphology changes were observed by light microscope; Mankin scoring was conducted. The two-step method of PV was used to make the immunohistochemical specimens of knee joint cartilage， and the relative expression of BMP-2 was detected. RESULTS： Compared with blank group， the edge of cartilage was damaged and the cartilage surface was damaged in the model group. The results of histomorphology observation showed that the joint tissue structure was obviously irregular， the distribution of chondrocytes was disordered with morphological changes， and the Mankin score was significantly increased （P<0.05）; the contents of COMP and p53 protein in knee joint fluid were increased significantly， while the relative expression of BMP-2 in knee joint tissue decreased significantly （P<0.05）. Compared with model group， the appearance， histomorphology changes of knee joint cartilage in administration groups were improved， Mankin scores were significantly decreased （P<0.05）; the contents of COMP and p53 protein in the knee joint fluid were decreased significantly， and the relative expression of BMP-2 in the knee joint tissue were increased significantly （P<0.05）， but there was no significant difference between Aconitum group and Sodium hyaluronate group （P>0.05）. CONCLUSIONS： Aconitum injection can improve synovitis inflammation，delay articular cartilage degeneration，promote cartilage repair and protect joints of KOA model rabbits. The mechanism may be related to inhibiting COMP secretion， decreasing p53 protein expression and promoting BMP-2 release.

KEYWORDS? ?Aconitum injection; Knee osteoarthritis; Cartilage oligomeric matrix protein; p53 protein; Bone morphogenetic protein 2; Rabbit

骨性關(guān)節(jié)炎（OA）又稱為退行性關(guān)節(jié)炎，是一種軟骨退變損傷、關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨反應(yīng)性增生的退行性病變，多以關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、畸形、活動(dòng)受限為主要臨床表現(xiàn)[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，軟骨退變主要是由細(xì)胞因子表達(dá)異常導(dǎo)致軟骨降解造成的[2]。目前，臨床非手術(shù)治療方案常采用關(guān)節(jié)腔注射玻璃酸鈉注射液，該藥具有潤滑關(guān)節(jié)、緩解疼痛、抑制炎癥的作用。但在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，玻璃酸鈉注射液關(guān)節(jié)腔注射短期療效不佳，且偶有皮疹、一過性疼痛等不良反應(yīng)。中藥烏頭具有祛風(fēng)除濕、抗炎止痛之功效，烏頭注射液是以烏頭提取物制備的中藥注射劑，本課題組前期研究證實(shí)該注射液能抑制關(guān)節(jié)液中炎癥因子的分泌，具有抗炎止痛、保護(hù)軟骨的作用[3]?；诖?，本研究通過建立兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）模型，考察烏頭注射液對關(guān)節(jié)液中軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（COMP）、抑癌基因p53編碼蛋白（p53蛋白）以及關(guān)節(jié)軟骨組織中骨形成蛋白2（BMP-2）等表達(dá)的影響，進(jìn)一步從軟骨細(xì)胞凋亡、軟骨細(xì)胞修復(fù)因子角度探索該注射液對關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用以及治療OA的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

2135型切片機(jī)（德國Leica公司）;Moticam3000型顯微攝影成像系統(tǒng)（美國Moticam公司）;H1650R型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）;BWS-5型電熱恒溫箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;ESJ120-4A型電子天平（沈陽龍騰電子科量儀器有限公司）;CH-20型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）;M2e型多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）。

1.2 藥品與試劑

玻璃酸鈉注射液（山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司，批號(hào)：20160409，規(guī)格：2.5 mL ∶ 25 mg）;烏頭注射液[上海北杰集團(tuán)關(guān)東藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20160401，規(guī)格：1 mL（含烏頭原堿0.62 mg）];L-半胱氨酸（美國Puritans Pride公司，批號(hào)：500872-03）;木瓜蛋白酶（河北林康生物科技有限公司，批號(hào)：2016022951）;COMP、p53酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（北京成林生物公司，批號(hào)：20180210、20180218）;PV-6001兔二步法檢測試劑盒（兔聚合物法檢測系統(tǒng)）（北京中杉金橋生物公司，批號(hào)：1803F0109）;10%EDTA試液（北京中山生物技術(shù)有限公司）;無水乙醇（天津富宇化工廠，批號(hào)：20180105）;蘇木精、伊紅試劑（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20180212、20180118）;戊巴比妥鈉（北京普博斯生物科技有限公司）;0.9%氯化鈉注射液（哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：180726A01，作生理鹽水使用）;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格;水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)別新西蘭大耳白兔24只，雄性，5月齡，體質(zhì)量（2.50～2.80）kg，購自哈爾濱市松北區(qū)翔林養(yǎng)殖場，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（黑）2016-002。動(dòng)物均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

取24只兔，隨機(jī)選取6只設(shè)為空白組，實(shí)驗(yàn)全程均不作處理;其余18只兔參照文獻(xiàn)方法[4]進(jìn)行造模：分別在第1、4、7天時(shí)于兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉溶液（30 mg/kg）麻醉后，在其右后膝關(guān)節(jié)腔一次性注射造模藥液[由2%木瓜蛋白酶溶液和0.03 mol/L L-半胱氨酸溶液按體積比2 ∶ 1配制的混合溶液]0.1 mL/kg，共計(jì)注射3次。造模結(jié)束后繼續(xù)喂養(yǎng)1周，若兔膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)腫脹、活動(dòng)障礙即可認(rèn)為造模成功。

將造模成功的兔隨機(jī)分為模型組、玻璃酸鈉組、烏頭注射液組，每組6只。參照文獻(xiàn)方法[5]，分別在造模成功后第1、4、7天時(shí)分別于其關(guān)節(jié)腔一次性注射生理鹽水、玻璃酸鈉注射液、烏頭注射液各0.1 mL/kg，各組兔均給藥3次。3組兔繼續(xù)飼養(yǎng)3周后，與空白組兔一同取材。

2.2 標(biāo)本采集及處理

各組兔經(jīng)耳緣靜脈注射空氣處死，右后膝關(guān)節(jié)周圍脫毛、消毒后將1 mL生理鹽水注射入關(guān)節(jié)腔內(nèi)沖洗，充分活動(dòng)膝關(guān)節(jié)后抽取關(guān)節(jié)液。將抽取的關(guān)節(jié)液以2 000 r/min離心15 min，取上層清液，在-20 ℃條件下保存。

取完關(guān)節(jié)液后，切開兔右后膝關(guān)節(jié)囊，充分暴露軟骨，取脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)軟骨，用10%EDTA試液脫鈣，進(jìn)行修塊后，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（厚度5 μm），以蘇木精-伊紅（HE）法染色后封片。參照文獻(xiàn)方法[6]，對HE染色切片采用PV二步法制作免疫組化標(biāo)本。

2.3 相關(guān)指標(biāo)觀察與檢測

2.3.1 兔膝關(guān)節(jié)軟骨形態(tài) 在“2.2”項(xiàng)下切開兔膝關(guān)節(jié)囊并充分暴露軟骨之后、取材軟骨組織之前，肉眼觀察關(guān)節(jié)軟骨破壞情況。

2.3.2 兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)變化及Mankin評(píng)分 取“2.2”項(xiàng)下各組HE染色切片，置于光鏡下觀察，拍攝并記錄組織學(xué)變化情況;參照Mankin關(guān)節(jié)軟骨病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[7]進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分越高，則病變程度越高。

2.3.3 兔膝關(guān)節(jié)液中COMP、p53蛋白含量 取“2.2”項(xiàng)下各組關(guān)節(jié)液上層清液樣品，采用ELISA法檢測COMP、p53蛋白含量，嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書要求進(jìn)行操作。

2.3.4 兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中BMP-2表達(dá)情況 取“2.2”項(xiàng)下免疫組化標(biāo)本，用顯微攝影成像系統(tǒng)攝片（200倍），采用Image-pro plus 6.0病理圖像分析系統(tǒng)定量分析，以積分光密度（IOD）表示蛋白相對表達(dá)量。每組兔同一部位選取6個(gè)高倍視野進(jìn)行分析，取平均值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)觀察結(jié)果

肉眼可見，空白組兔膝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑無缺損;模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨邊緣破壞，軟骨面有缺損;玻璃酸鈉組兔膝軟骨表面不光滑，有少量缺損;烏頭注射液組兔膝關(guān)節(jié)軟骨邊緣欠光滑，關(guān)節(jié)軟骨面有輕微缺損。

3.2 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學(xué)觀察及Mankin評(píng)分結(jié)果

光鏡下可見，空白組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)正常，軟骨細(xì)胞分布均勻;模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)明顯不規(guī)則，軟骨細(xì)胞可見明顯擴(kuò)大，有白泡樣改變，細(xì)胞分布紊亂;玻璃酸鈉組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)排列不規(guī)則，軟骨細(xì)胞分布紊亂;烏頭注射液組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)趨于正常，軟骨細(xì)胞分布較均勻。各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學(xué)顯微圖見圖1。

與空白組比較，模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織的Mankin評(píng)分顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，玻璃酸鈉組和烏頭注射液組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織的Mankin評(píng)分均顯著降低（P<0.05）;玻璃酸鈉組和烏頭注射液組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織的Mankin評(píng)分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見表1。

3.3 各組兔膝關(guān)節(jié)液中COMP、p53蛋白含量及膝關(guān)節(jié)軟骨組織中BMP-2相對表達(dá)量檢測結(jié)果

與空白組比較，模型組兔膝關(guān)節(jié)液中COMP、p53蛋白含量均顯著升高，膝關(guān)節(jié)軟骨組織中BMP-2相對表達(dá)量顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，玻璃酸鈉組和烏頭注射液組兔膝關(guān)節(jié)液中COMP、p53蛋白含量均顯著降低，膝關(guān)節(jié)軟骨組織中BMP-2相對表達(dá)量均顯著升高（P<0.05）;烏頭注射液組與玻璃酸鈉組比較，上述因子含量或相對表達(dá)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組兔膝關(guān)節(jié)液中COMP、p53蛋白含量及膝關(guān)節(jié)軟骨組織中BMP-2相對表達(dá)量的檢測結(jié)果見表2，膝關(guān)節(jié)軟骨組織中BMP-2表達(dá)顯微圖見圖2。

4 討論

KOA的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，有學(xué)者認(rèn)為是由多種因素相互作用導(dǎo)致生物力學(xué)紊亂引起的[8]。但現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，KOA基本的病理改變是關(guān)節(jié)軟骨的損傷退變，而軟骨退變主要是由細(xì)胞因子表達(dá)異常導(dǎo)致軟骨降解造成的[9]?？梢?，抑制相關(guān)的骨破壞因子、促進(jìn)保護(hù)因子的釋放可以起到治療KOA的作用。烏頭注射液是以烏頭加工減毒后提取的總生物堿制成的中藥注射劑，具有抗炎、止痛、調(diào)節(jié)免疫等作用，療效確切[10]，因此本研究對該注射液用于KOA治療的作用和相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了考察。此外，關(guān)節(jié)腔注射玻璃酸鈉注射液是目前公認(rèn)的KOA臨床非手術(shù)治療方案之一，故本研究選擇其作為陽性對照藥物。

本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨邊緣破壞，軟骨面有缺損;組織病理學(xué)觀察顯示，膝關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)明顯不規(guī)則，軟骨細(xì)胞可見明顯擴(kuò)大，有白泡樣改變，細(xì)胞間分布紊亂且Mankin評(píng)分顯著升高，表明兔KOA模型成功建立。而采用玻璃酸鈉注射液和烏頭注射液干預(yù)后，與模型組比較，各給藥組兔膝關(guān)節(jié)軟骨表面不光滑和缺損現(xiàn)象均明顯減輕;組織病理學(xué)觀察顯示，玻璃酸鈉組兔軟骨組織結(jié)構(gòu)排列不規(guī)則、軟骨細(xì)胞分布紊亂現(xiàn)象有所改善;烏頭注射液組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)趨于正常，以該組改善更為明顯，表明烏頭注射液能有效促進(jìn)KOA模型兔的軟骨生長，加快關(guān)節(jié)損傷處的修復(fù)。

軟骨細(xì)胞的凋亡是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的重要機(jī)制之一，且軟骨細(xì)胞的代謝受到許多細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。p53基因是一種抑癌基因，其編碼的核內(nèi)磷酸化蛋白被稱為p53蛋白，后者表達(dá)與骨關(guān)節(jié)炎癥程度密切相關(guān)[11]。張志宇等[12]研究證實(shí)，骨關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)p53蛋白的高表達(dá)能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，引起骨關(guān)節(jié)炎的一系列臨床癥狀。COMP是軟骨非膠原蛋白的主要成分，主要功能是結(jié)合Ⅱ型膠原纖維，穩(wěn)定關(guān)節(jié)軟骨的膠原-纖維網(wǎng)絡(luò)，參與調(diào)控膠原纖維的重構(gòu)和軟骨內(nèi)成骨[13]。在關(guān)節(jié)軟骨損傷時(shí)，軟骨基質(zhì)可降解產(chǎn)生COMP并釋放入關(guān)節(jié)液，故關(guān)節(jié)液中COMP水平可反映關(guān)節(jié)軟骨的降解破壞程度和炎癥程度[14]。本研究結(jié)果顯示，模型組兔膝關(guān)節(jié)液中COMP和p53蛋白含量均較空白組顯著升高;而玻璃酸鈉組和烏頭注射液組兔膝關(guān)節(jié)液上述兩種因子含量較模型組均顯著降低，但玻璃酸鈉組與烏頭注射液組比較無顯著差異，提示烏頭注射液可通過抑制COMP的分泌、降低p53蛋白表達(dá)而起到保護(hù)軟骨的作用。

BMP是轉(zhuǎn)化生長因子2β家族中的一員，是多種細(xì)胞生長和分化的多功能調(diào)節(jié)因子，可通過調(diào)控成骨過程來參與骨轉(zhuǎn)換過程，具有促進(jìn)軟骨基質(zhì)合成、抑制軟骨基質(zhì)降解的作用[15]。研究表明，BMP-2能夠增加軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原蛋白和蛋白多糖的合成，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞分化、增殖，使軟骨基質(zhì)的合成增加，維持關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的穩(wěn)定[16-17];還可加快骨損傷后的修復(fù)進(jìn)程，提高軟骨組織的修復(fù)質(zhì)量[18-19]。本研究結(jié)果顯示，模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中BMP-2相對表達(dá)量較空白組顯著降低;玻璃酸鈉組和烏頭注射液組BMP-2相對表達(dá)量較模型組顯著升高，但玻璃酸鈉組與烏頭注射液組比較無顯著差異，提示烏頭注射液可以促進(jìn)保護(hù)因子BMP-2的釋放，從而促進(jìn)軟骨的修復(fù)。

綜上所述，烏頭注射液對于KOA模型兔的關(guān)節(jié)軟骨病理改變有一定作用，包括改善滑膜炎癥、延緩關(guān)節(jié)軟骨退變、保護(hù)關(guān)節(jié)等;其機(jī)制可能與抑制COMP的分泌、降低p53蛋白表達(dá)、促進(jìn)BMP-2釋放有關(guān)。

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（收稿日期：2019-05-26 修回日期：2020-02-15）

（編輯：段思怡）