周志南 吳淵 夏琪琪 黃甜甜 楊啟立 劉鵬鵬

摘 要：目的：提升單核增生李斯特菌的檢測能力，增強實驗室的競爭能力。方法：按照現(xiàn)行的檢驗標準GB 4789.30-2016進行增菌，再用不同的增菌液進行二次增菌，然后分離、生化鑒定，并采用PCR電泳凝膠成像、全自動病原菌檢測系統(tǒng)（BAX Q7）和全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)（VITEK2）對增菌液和疑似菌進行鑒定。結(jié)果：本實驗室2個樣品測試均取得滿意的結(jié)果，單核細胞增生李斯特氏菌的能力驗證滿意率僅為59%。結(jié)論：采用不同增菌液對結(jié)果有一定的影響，為避免漏檢，必要時可將兩種不同增菌液結(jié)合起來使用，并采用多種鑒定手段，以提高目標菌的檢出率。

關(guān)鍵詞：奶粉;單核增生李斯特菌;能力驗證

Abstract：Objective： To strengthen the detection capability of L. monocytogenes and enhancing the competitiveness of laboratories. Methods： The enrichment of samples was carried out under the following present standards GB 4789.30-2016， National food safety standard food microbiological examination， and use different liquid enrichment medium for enrichment， then isolation and biochemical identification. The isolated bacteria of two samples were identified by PCR、BAX Q7 and VITEK2. Results： The test results of two samples were satisfied. The satisfactory rate of ability verification of L. monocytogenes was only 59%. Conclusion： The results showed that different liquid enrichment medium had certain influence on the results. In order to avoid missed detection， two different enrichment liquids could be used together if necessary， and a variety of identification methods could be used to improve the detection rate of target bacteria.

Key words：Milk powder; L. monocytogenes; Proficiency testing

中圖分類號：R155.5

李斯特氏菌屬（Listeria）早在20世紀初即被發(fā)現(xiàn)，它共有7個菌種，革蘭氏染色陽性。其中，單核細胞增生李斯特氏菌（L. monocytogenes）簡稱單增李斯特菌，是唯一能引起人畜共患疾病的病原菌。單增李斯特菌廣泛存在于自然界中，引起李斯特菌病暴發(fā)的食品主要有乳及乳制品、肉類制品、水產(chǎn)品以及蔬菜水果，其中蔬菜水果、乳及乳制品中最為常見。中毒多發(fā)生在夏秋季，感染后能引起李斯特菌病，主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多[1]，對孕婦、嬰兒、老年人及免疫力低下者更容易引起感染。歐美國家曾多次發(fā)生該菌引起的食物中毒，死亡率達30%以上，致死率甚至高達70%[2]。因此，許多國家將其列入進出口必檢項目?，F(xiàn)行的有效標準中都要求不得檢出，而實驗結(jié)果的準確性直接關(guān)系到一個單位的實驗室工作技術(shù)能力水平。通過能力驗證，可以識別實驗室存在的問題并啟動改進措施，以達到不斷提高實驗室檢測技術(shù)和質(zhì)量控制水平的目的[3]。能力驗證作為評價實驗室能力的一個重要手段，一直以來受到國內(nèi)外實驗室管理者的廣泛重視。為了使實驗室的檢驗水平與國際接軌，本實驗室參加了英國食品與環(huán)境研究院（Fera）組織的FAPAS分析實驗室能力驗證（Food Analysis Performance Assessment Scheme）——奶粉中單核增生李斯特菌檢測能力驗證，取得了滿意的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 標準菌株

單核細胞增生李斯特氏菌ATCC 19111、英諾克李斯特氏菌ATCC 33090，購自青島海博生物技術(shù)有限公司;伊氏李斯特氏菌CICC 21663、斯氏李斯特氏菌CICC 21671，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 待測樣品

FAPAS-Food Microbiology Distribution 224奶粉能

力驗證樣品，批號為M224d02，外觀為25 mL塑料廣口瓶，內(nèi)裝25 g奶粉，共兩瓶，樣品編號分別為M224d02A、M224d02B（簡稱A、B，下同），由英國食品與環(huán)境研究院（Fera）提供。

1.3 培養(yǎng)基及試劑

李氏增菌肉湯LB（LB1，LB2）、Fraser增菌肉湯、PLACAM瓊脂培養(yǎng)基、血液瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基、TSA-YE培養(yǎng)基、李斯特菌顯色培養(yǎng)基（以下簡稱李顯培養(yǎng)基）、單增李斯特菌干制生化鑒定試劑盒、PCR所用試劑、單增李斯特菌BAX試劑盒、VITEK2 GP鑒定卡。

1.4 儀器

生物安全柜、培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀、全自動病原菌檢測系統(tǒng)BAX Q7、VITEK2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)。

1.5 方法

按照國家標準GB 4789.30-2016第一法單增李斯特菌定性檢驗的要求進行增菌、分離和鑒定，劃線分離的同時進行涂布分離。同時，采用PCR電泳凝膠成像、全自動病原菌檢測系統(tǒng)（BAX Q7）和全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)（VITEK2）對增菌分離的增菌液和疑似菌進行鑒定，最終綜合以上試驗結(jié)果出具報告。同時，以單增李斯特菌ATCC 19111作為陽性對照菌進行陽性對照試驗。

1.5.1 增菌

在生物安全柜內(nèi)以無菌操作將25 g奶粉樣品加入到含有225 mL LB1增菌液中，充分搖勻。于（30±1）℃培養(yǎng)24～48 h，移取0.1 mL轉(zhuǎn)種于10 mL LB2增菌液內(nèi)，于（30±1）℃培養(yǎng)（24±2）h。同時移取0.1 mL于10 mL于Fraser增菌肉湯中，于（37±1）℃培養(yǎng)（48±2）h。

1.5.2 劃線分離和涂布分離

各從LB2增菌液和Fraser肉湯中挑取培養(yǎng)物一環(huán)劃線接種于李顯平板和PALCAM瓊脂平板，并同時各從LB2增菌液和中Fraser肉湯吸取0.4 mL增菌液涂布接種于李顯平板和PALCAM瓊脂平板，于（36±1）℃培養(yǎng)24～48 h。同時操作陽性對照。

1.5.3 生化反應試驗

從李顯平板和PALCAM瓊脂平板平板上選取典型菌落，劃線接種于TSA-YE平板上，（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h，涂片，進行革蘭氏染色、鏡檢，并用商業(yè)化的單增李斯特菌干制生化鑒定試劑盒進行生化鑒定及溶血試驗。

1.5.4 VITEK2-Compact鑒定

分別從TSA-YE平板上挑取純化菌落，制備0.5～0.8 MCF的菌懸液，用GP鑒定卡上機VITEK2鑒定系統(tǒng)進行鑒定。

1.5.5 PCR法電泳凝膠成像

從LB1和LB2增菌液中各吸取1 mL于EP管中，離心洗菌后，于95 ℃裂解10 min。配制反應體系：12.5 μL 2×PCR TaqMix;上下游引物各0.5 μL;DNA模板1 μL;加雙蒸水補至終體積25 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，74 ℃延伸1 min，共35個循環(huán);最后72 ℃延伸5 min，凝膠電泳成像。

1.5.6 BAX Q7鑒定

按BAX單增李斯特菌檢測試劑盒說明書來操作上機鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩

對增菌液采用PCR法、BAX Q7進行初篩，結(jié)果如表1所示，A樣品僅在Fraser增菌液中有單增李斯特菌檢出，LB增菌液中初篩未檢出。結(jié)果顯示，可能受干擾菌或培養(yǎng)條件等影響，LB增菌液目標菌增菌效果較差，不能達到PCR方法的檢出限。

2.2 劃線分離和涂布分離結(jié)果

通過劃線分離，兩個樣品在李顯培養(yǎng)基和PALCAM

瓊脂平板上都有可疑菌落，染色鏡檢結(jié)果均為革蘭氏陽性菌，需進一步進行生化鑒定。其中，A樣品目標菌增菌效果較差，LB2增菌液劃線分離多塊平板均出現(xiàn)選擇性培養(yǎng)基無菌生長情況，增菌液涂布分離可疑菌落不多于10個;但經(jīng)Fraser增菌后，李顯培養(yǎng)基和PALCAM上菌長有典型菌落。B樣品在PALCAM培養(yǎng)基上也分離到可疑菌落，但在李顯培養(yǎng)基上長有藍色菌落但無白色暈環(huán)，且Fraser增菌比LB2增菌效果較好。

2.3 生化反應試驗結(jié)果

對李顯培養(yǎng)基平板和PALCAM瓊脂平板上的可疑菌落進行分離純化，根據(jù)GB 4789.30-2016進行生化鑒定。結(jié)果顯示，A和B的生化反應僅溶血反應有區(qū)別。結(jié)合菌落形態(tài)生化反應，可以初步判定A樣品檢出單增李斯特菌，與單增李斯特菌陽性對照完全一致;B樣品檢出英諾克李斯特氏菌。VITEK2檢測結(jié)果顯示，A樣品檢出李斯特屬菌（需做溶血反應確認，結(jié)合溶血反應結(jié)果判斷為單增李斯特菌），B樣品檢出英諾克李斯特氏菌。

3 討論

從這次的FAPAS能力驗證的結(jié)果報告中可以看出，本次單增李斯特菌的能力驗證計劃共計有64家實驗室參加，其中只有38家實驗室檢測結(jié)果被評為滿意，占59%;28家實驗室檢測結(jié)果被評為不滿意，占41%[4]。A樣添加目標菌單增李斯特菌，檢測結(jié)果顯示28家實驗室（41%）得到假陰性結(jié)果;B樣添加英諾克李斯特菌作為干擾菌，有10家實驗室（16%）得到假陽性結(jié)果。

常規(guī)培養(yǎng)法是基準方法，檢測成本較低，在一般的實驗室都能開展，但檢測步驟多，檢測周期較長。在二次增菌后還要純培養(yǎng)，生化鑒定步驟中的溶血試驗操作比較難把握，因此在檢測工作者經(jīng)驗不足的情況下容易漏檢和假陽性。

在選擇增菌過程中，應嚴格按照標準方法進行二次增菌。目前國內(nèi)都有報道不同增菌液對檢出單增李斯特菌的檢出效果，總的檢出率沒有很大的差異性，但對不同類食品的檢出率有所不同。這就說明針對不同類食品有必要選擇不同種類的增菌液來達到最好的增菌效果。國家標準的LB二次增菌和Fraser的二次增菌法對不同的食品都有很高的檢出率，增菌范圍都比較廣。但從這一次的FEPAS能力驗證來看，F(xiàn)raser肉湯的二次增菌后檢出單增李斯特菌的效果好于LB的二次增菌，所以必要時可將該兩種方法結(jié)合一起增菌，以達到提高檢出單增李斯特菌的目的。

單增李斯特菌的檢測在食品微生物檢測中對檢測人員經(jīng)驗有較高的要求，尤其是生化反應鑒定。在挑取可疑菌落進行純化的時候，可同時接種木糖，鼠李糖發(fā)酵管進行初篩。鼠李糖（+）和木糖（-）這兩個生化特征可以區(qū)分單增李斯特菌和其他大部分的李斯特菌。另外，無論是選擇用生化鑒定試劑盒還是用VITEK全自動微生物檢測系統(tǒng)，均需進行溶血試驗和協(xié)同溶血試驗才能做最終的確定。而本次能力驗證B樣品添加英諾克李斯特菌作為干擾菌，其生化特征反應僅溶血試驗與單增李斯特菌不同。溶血試驗對檢測人員經(jīng)驗和血平板質(zhì)量要求要求較高，如存在操作不當極有可能造成溶血現(xiàn)象的誤判，這也可能是16%實驗室得到假陽性結(jié)果的重要原因之一。建議使用API Lisiter生化鑒定，即可區(qū)分單增、英諾克及伊氏，又能對選擇性平板分離和初步生化結(jié)果進行驗證。且API省去溶血試驗和協(xié)同溶血試驗的鑒定步驟，即縮短檢測時間又提高檢測準確性。

Hly基因是Lm最重要的毒力基因，它的缺失將會導致細菌毒力的全部喪失[5]。盡管通過生化反應、溶血試驗等試驗可以基本確立單增李斯特菌的檢出，但根據(jù)Hly基因建立的PCR檢出方法與傳統(tǒng)鑒定方法結(jié)合起來，不失為鑒定單增李斯特菌提供了一種準確且特異的方法。無論何種的能力驗證，為了能達到滿意的結(jié)果，力求讓鑒定手段盡可能多樣化，可采用多種鑒定手段來檢出目標菌。從這次的能力驗證的結(jié)果報告中還統(tǒng)計了其他方法或快速方法，如MOLDI-TOF、PCR、Petrifilm（3M）、VIDAS等，通過多種方法進行初篩，或?qū)ΜF(xiàn)有方法進行優(yōu)化，并結(jié)合先進的鑒定手段提高單增李斯特菌檢測的準確性。

參考文獻：

[1]賈俊濤，梁成珠，馬維興.食品微生物檢測工作指南[M].北京：中國標準出版社，2012.

[2]孫靜娟，曾海娟，丁承超，等.單核細胞增生李斯特菌檢測技術(shù)研究進展[J].微生物學雜志，2017，37（4）：120-125.

[3]舒鵑娟，張偉沖，袁 峰，等.食品微生物的檢測能力驗證[J].上海預防醫(yī)學，2014，26（3）：154-157.

[4]FAPAS. Food Microbiology Proficiency Test Report 224[R].London：Fera Science Ltd， 2017.

[5]謝曼曼，劉武康，丁承超，等.單核增生性李斯特菌hly缺失菌株的構(gòu)建及生物特性的初步鑒定[J].食品科學，2017，38（16）：17-22.