張艷峰，王會利

中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085

農(nóng)藥在控制有害生物危害和保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等方面發(fā)揮了重要作用，但是農(nóng)藥的不合理使用也給生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來了很多負(fù)面的影響[1-2]。研究表明約80%的化學(xué)農(nóng)藥施用后會直接進(jìn)入環(huán)境，并在大氣、土壤和水等環(huán)境介質(zhì)之間遷移和擴(kuò)散，而且有可能生物累積和生物放大，進(jìn)而對環(huán)境生物造成嚴(yán)重危害[3]。

蜜蜂是自然界最主要的傳粉昆蟲，同時(shí)為人類提供了豐富的蜂產(chǎn)品[4-5]。蜜蜂在田間采花授粉過程中可通過直接經(jīng)口攝入和體表接觸等途徑暴露于農(nóng)藥中，因此，農(nóng)藥在蜜源作物上使用難免會對蜜蜂造成影響，包括行為變化及個(gè)體死亡，甚至可導(dǎo)致整個(gè)種群的變化。進(jìn)入21世紀(jì)以來，美洲和歐洲相繼爆發(fā)了大規(guī)模的蜂群崩潰失調(diào)癥(Colony Collapse Disorder)，這些都與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中農(nóng)藥的大量使用密切相關(guān)[6-7]。如已被歐盟限制使用的新煙堿類殺蟲劑能夠在極低的劑量下作用于昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)中的煙堿乙酰膽堿受體(nAChRs)，在殺死害蟲的同時(shí)，也會危害蜜蜂等非靶標(biāo)生物[8-9]。與其他昆蟲相比，蜜蜂基因組中缺乏能夠編碼解毒酶的基因，這使得蜜蜂更容易受到農(nóng)藥的危害[10]。國內(nèi)外均將蜜蜂作為監(jiān)測農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的指示昆蟲[11]，保護(hù)蜜蜂種群對于保證環(huán)境安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展關(guān)系重大。

農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評估是在急性毒性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，關(guān)注農(nóng)藥對整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)直接或間接的影響，是將孤立的環(huán)境行為、環(huán)境生態(tài)和非靶標(biāo)生物的毒性資料等進(jìn)行整合，科學(xué)評判農(nóng)藥的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，從而更科學(xué)、直觀地反映農(nóng)藥在使用中對環(huán)境影響的實(shí)際情況，因此，農(nóng)藥風(fēng)險(xiǎn)評估具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文選擇了16種農(nóng)藥制劑，研究其對意大利蜜蜂的急性經(jīng)口毒性和急性接觸毒性，并進(jìn)行初級風(fēng)險(xiǎn)評估，旨在為我國農(nóng)藥的安全合理使用提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為這些農(nóng)藥品種的再評估工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試生物

意大利蜜蜂(ApismelliferaL.)，以下簡稱蜜蜂引種自北京長文山水間養(yǎng)殖中心，實(shí)驗(yàn)室自行保種繁育。試驗(yàn)選用大小一致健康活潑的成年工蜂并在試驗(yàn)前饑餓2 h。

1.1.2 藥劑

30%蟲螨腈懸浮劑、50%丁醚脲可濕性粉劑、10%高效氯氰菊酯水乳劑、10%高效氯氟氰菊酯懸浮劑、30%噻蟲胺懸浮劑、21%噻蟲嗪懸浮劑、15%高效氯氟氰菊酯·噻蟲嗪懸浮劑(3∶2)、10%高效氯氟氰菊酯·噻蟲胺懸浮劑(1∶3)、30%草甘膦水劑、30%草銨膦水劑、45%莎稗磷乳油、30%氰氟草酯乳油、480 g·L-1滅草松可溶液劑、50%吡唑醚菌酯水分散粒劑、20%氰霜唑懸浮劑、50%氟啶胺懸浮劑和98.3%樂果原藥，均由中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心農(nóng)藥與環(huán)境評價(jià)實(shí)驗(yàn)室提供；丙酮(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.1.3 試驗(yàn)設(shè)備

試驗(yàn)蜂籠(長×寬×高為9.3 cm×9.3 cm×7 cm的木質(zhì)方框，上下表面用紗網(wǎng)密封，自制)；飼喂器(底部穿孔的200 μL離心管，美國Axygen公司)；微量點(diǎn)滴儀(Hamilton-DIS50μL，瑞士Hamilton公司)；電子天平(AL104-IC，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；CO2麻醉裝置(自制)。

1.2 試驗(yàn)方法1.2.1 蜜蜂急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

將供試農(nóng)藥制劑用去離子水配制成母液后用50%(m/m)蔗糖水稀釋成一系列濃度，詳細(xì)濃度梯度如表1所示。采用飼喂法對蜜蜂進(jìn)行染毒，具體操作如下：將蜜蜂麻醉后引入試驗(yàn)蜂籠，用飼喂器取100 μL不同濃度供試物藥液飼喂蜜蜂；4 h后取出飼喂器，換用不含供試物的50%(m/m)蔗糖水持續(xù)飼喂至試驗(yàn)結(jié)束，測定每組藥液的消耗量。同時(shí)設(shè)空白對照組，僅飼喂不含供試物的50%(m/m)蔗糖水。處理組和對照組均設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭蜜蜂。處理后24 h和48 h分別觀察蜜蜂的中毒癥狀與死亡情況。暴露實(shí)驗(yàn)在(25±2) ℃、相對濕度為50%～70%的黑暗人工氣候室內(nèi)進(jìn)行。

1.2.2 蜜蜂急性接觸毒性試驗(yàn)

將供試農(nóng)藥制劑用丙酮配制成母液后用丙酮稀釋成一系列濃度，詳細(xì)濃度梯度如表1所示。采用微量點(diǎn)滴法對蜜蜂進(jìn)行染毒，具體操作如下：將蜜蜂麻醉后取出，用微量點(diǎn)滴儀吸取供試物藥液，于蜜蜂中胸背板處點(diǎn)滴1 μL，待蜂身晾干后，將染毒蜜蜂轉(zhuǎn)移至試驗(yàn)蜂籠，用50%蔗糖水(m/m)持續(xù)飼喂至試驗(yàn)結(jié)束。同時(shí)設(shè)空白對照組和溶劑對照組，空白對照組只引入麻醉的蜜蜂不點(diǎn)滴，溶劑對照組只用丙酮進(jìn)行點(diǎn)滴，其他同處理組。處理組、空白對照組和溶劑對照組均設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭蜜蜂。處理后24 h和48 h分別觀察蜜蜂的中毒癥狀與死亡情況。暴露實(shí)驗(yàn)在(25±2) ℃、相對濕度為50%～70%的黑暗人工氣候室內(nèi)進(jìn)行。

表1 16種農(nóng)藥制劑田間推薦最高施用量及染毒濃度Table 1 The maximum recommended application rates (AR) and exposure levels of 16 pesticide formulations

1.2.3 樂果參比試驗(yàn)

參比試驗(yàn)方法同1.2.1和1.2.2。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)蜜蜂實(shí)際暴露量和死亡率，采用SPSS18.0軟件Probit概率統(tǒng)計(jì)法計(jì)算48 h半致死劑量(48 h-LD50)及95%置信區(qū)間。風(fēng)險(xiǎn)商值(RQ)按照噴施暴露場景下的公式RQ=AR/(LD50×50)進(jìn)行計(jì)算，其中，RQ為噴霧暴露場景的風(fēng)險(xiǎn)商值，AR為農(nóng)藥推薦單次最高施用量(g a.i.·hm-2)(表1)，LD50為半致死劑量(μg a.i.·蜂-1)。

1.4 毒性等級和風(fēng)險(xiǎn)等級劃分

蜜蜂急性經(jīng)口毒性和急性接觸毒性的等級劃分，參照農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則 第10部分：蜜蜂急性毒性試驗(yàn)》[12]分為4個(gè)等級：低毒(LD50>11.0 μg a.i.·蜂-1)；中毒(2.0 μg a.i.·蜂-1

對蜜蜂的初級風(fēng)險(xiǎn)評估采用《農(nóng)藥登記 環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評估指南 第4部分：蜜蜂》[13]中的RQ值進(jìn)行表征，RQ≤1時(shí)，風(fēng)險(xiǎn)可接受；RQ>1時(shí)，風(fēng)險(xiǎn)不可接受。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 急性經(jīng)口毒性和初級風(fēng)險(xiǎn)評估

8種殺蟲劑對蜜蜂的急性經(jīng)口毒性均為高毒(表2)。45%莎稗磷乳油的48 h-LD50為5.90 μg a.i.·蜂-1，急性經(jīng)口毒性為中毒。30%草甘膦水劑、30%草銨膦水劑、30%氰氟草酯乳油、480 g·L-1滅草松可溶液劑、50%吡唑醚菌酯水分散粒劑、20%氰霜唑懸浮劑和50%氟啶胺懸浮劑的48 h-LD50均≥100 μg a.i.·蜂-1(表2)，這7種制劑急性經(jīng)口毒性均為低毒。蜜蜂中毒后表現(xiàn)為行動(dòng)遲緩，失去平衡等癥狀，死亡后蜂喙伸出，翅膀展開。30%蟲螨腈懸浮劑、50%丁醚脲可濕性粉劑、30%噻蟲胺懸浮劑、21%噻蟲嗪懸浮劑、15%高效氯氟氰菊酯·噻蟲嗪懸浮劑、10%高效氯氟氰菊酯·噻蟲胺懸浮劑和45%莎稗磷乳油的RQ值均>1，風(fēng)險(xiǎn)不可接受；其余8種制劑的RQ值均<1，風(fēng)險(xiǎn)可接受(表2)。

表2 16種制劑對蜜蜂的急性經(jīng)口毒性和風(fēng)險(xiǎn)商值(RQ)Table 2 Acute oral toxicity and risk quotient (RQ) of 16 formulations to Apis mellifera

2.2 急性接觸毒性和初級風(fēng)險(xiǎn)評估

8種殺蟲劑中，10%高效氯氟氰菊酯·噻蟲胺懸浮劑的48 h-LD50為0.000234 μg a.i.·蜂-1，對蜜蜂的急性接觸毒性為劇毒；50%丁醚脲可濕性粉劑的48 h-LD50為2.11 μg a.i.·蜂-1，急性接觸毒性為中毒；其余6種制劑的急性接觸毒性均為高毒(表3)。45%莎稗磷乳油的48 h-LD50為5.42 μg a.i.·蜂-1，急性接觸毒性為中毒。30%草甘膦水劑、30%草銨膦水劑、30%氰氟草酯乳油、480 g·L-1滅草松可溶液劑、50%吡唑醚菌酯水分散粒劑、20%氰霜唑懸浮劑和50%氟啶胺懸浮劑的48 h-LD50均≥100 μg a.i.·蜂-1(表3)，這7種制劑的急性接觸毒性均為低毒。蜜蜂中毒后表現(xiàn)為行動(dòng)遲緩，失去平衡等癥狀，死亡后蜂喙伸出，翅膀展開。30%蟲螨腈懸浮劑、50%丁醚脲可濕性粉劑、10%高效氯氰菊酯水乳劑、10%高效氯氟氰菊酯懸浮劑、30%噻蟲胺懸浮劑、21%噻蟲嗪懸浮劑、15%高效氯氟氰菊酯·噻蟲嗪懸浮劑、10%高效氯氟氰菊酯·噻蟲胺懸浮劑和45%莎稗磷乳油的RQ值均>1，風(fēng)險(xiǎn)不可接受；其余7種制劑的RQ值均<1，風(fēng)險(xiǎn)可接受(表3)。

表3 16種制劑對蜜蜂的急性接觸毒性和風(fēng)險(xiǎn)商值Table 3 Acute contact toxicity and risk quotient of 16 formulations to Apis mellifera

2.3 樂果參比試驗(yàn)

樂果作為參比物質(zhì)，對蜜蜂急性經(jīng)口試驗(yàn)48 h-LD50為0.262 μg a.i.·蜂-1，在0.10～0.35 μg a.i.·蜂-1范圍內(nèi)；對蜜蜂急性接觸試驗(yàn)48 h-LD50為0.216 μg a.i.·蜂-1，在0.10～0.30 μg a.i.·蜂-1范圍內(nèi)；均符合試驗(yàn)要求[12]，說明試驗(yàn)體系和試驗(yàn)方法可靠。

3 討論(Discussion)

本研究選取的農(nóng)藥品種涵蓋了殺蟲劑、除草劑和殺菌劑三大類，它們對蜜蜂的急性毒性和風(fēng)險(xiǎn)差異很大，10%高效氯氟氰菊酯·噻蟲胺懸浮劑急性接觸毒性和風(fēng)險(xiǎn)最高，48 h-LD50和RQ值分別為0.000234 μg a.i.·蜂-1和1 538.46，與目前關(guān)注的新煙堿類和菊酯類殺蟲劑對蜜蜂的影響結(jié)果一致[14-19]；低毒制劑的48 h-LD50≥100 μg a.i.·蜂-1，最小的RQ值為0.02。總體來看，殺蟲劑對蜜蜂的急性毒性較高且風(fēng)險(xiǎn)高，除草劑和殺菌劑對蜜蜂的急性毒性較低且風(fēng)險(xiǎn)低，這可能與致毒機(jī)理和作用方式不同有關(guān)[20-22]。上述絕大部分制劑對蜜蜂的風(fēng)險(xiǎn)表現(xiàn)為低毒低風(fēng)險(xiǎn)和高毒高風(fēng)險(xiǎn)的趨勢，說明急性毒性是風(fēng)險(xiǎn)性的內(nèi)在決定因素。另一方面，在急性毒性數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，引入田間施用量的因素，更能準(zhǔn)確直觀地體現(xiàn)農(nóng)藥對蜜蜂的風(fēng)險(xiǎn)，由此可見，嚴(yán)格控制田間施用量，合理使用農(nóng)藥是降低農(nóng)藥風(fēng)險(xiǎn)的重要手段。

10%高效氯氟氰菊酯懸浮劑對蜜蜂的急性毒性為高毒(48 h-LD50分別為0.445 μg a.i.·蜂-1和0.530 μg a.i.·蜂-1)，21%噻蟲嗪懸浮劑對蜜蜂的急性毒性為高毒(48 h-LD50分別為0.314 μg a.i.·蜂-1和0.110 μg a.i.·蜂-1)，30%噻蟲胺懸浮劑對蜜蜂的急性毒性為高毒(48 h-LD50分別為0.00589 μg a.i.·蜂-1和0.0106 μg a.i.·蜂-1)；高效氯氟氰菊酯和噻蟲嗪2種有效成分復(fù)配后，15%高效氯氟氰菊酯·噻蟲嗪懸浮劑的急性毒性和風(fēng)險(xiǎn)性明顯升高(48 h-LD50分別為0.00882 μg a.i.·蜂-1和0.0299 μg a.i.·蜂-1)；高效氯氟氰菊酯和噻蟲胺2種有效成分復(fù)配后，10%高效氯氟氰菊酯·噻蟲胺懸浮劑的接觸急性毒性等級升高為劇毒(48 h-LD50為0.000234 μg a.i.·蜂-1)。這可能與2種有效成分不同的致毒機(jī)制疊加有關(guān)，不同的復(fù)配比例、助劑或劑型也可能影響到急性毒性結(jié)果。由此可見，復(fù)配制劑對環(huán)境生物的毒性風(fēng)險(xiǎn)存在差異[23-24]，其不同組分釋放到環(huán)境中可能會對環(huán)境生物產(chǎn)生加和作用、協(xié)同作用和拮抗作用等不同的聯(lián)合毒性效應(yīng)，導(dǎo)致風(fēng)險(xiǎn)評估的不確定性大大增加[25]。

對蜜蜂的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評估可以明確對蜜蜂存在風(fēng)險(xiǎn)的農(nóng)藥品種，據(jù)此實(shí)施相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)規(guī)避措施降低對蜜蜂的危害。美國環(huán)境保護(hù)局(US EPA)于2014年頒布了農(nóng)藥對蜜蜂的風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)指南，在農(nóng)藥標(biāo)簽規(guī)范中強(qiáng)調(diào)禁止在蜜蜂活動(dòng)區(qū)域使用新煙堿類農(nóng)藥，以保護(hù)蜜蜂及其他授粉昆蟲。歐洲食品安全局(EFSA)于2013年發(fā)布了新煙堿類殺蟲劑對蜜蜂的風(fēng)險(xiǎn)評估報(bào)告，認(rèn)為該類產(chǎn)品不僅對蜜蜂可產(chǎn)生急性毒害，而且可能對蜜蜂種群帶來嚴(yán)重影響，同時(shí)限制噻蟲嗪、吡蟲啉和噻蟲胺3種新煙堿類殺蟲劑在夏季糧谷類作物和蜜源作物上使用[26]。針對本文中高風(fēng)險(xiǎn)殺蟲劑，建議采取如下措施減少對蜜蜂的暴露量：錯(cuò)開作物花期施用甚至考慮晚間施用或施用前及時(shí)清除周圍蜜源/粉源植物；根據(jù)實(shí)際需求減少田間施用劑量或減少施藥次數(shù)；改用低毒化的農(nóng)藥劑型或風(fēng)險(xiǎn)較低的替代農(nóng)藥；保護(hù)或臨時(shí)封閉蜂箱；僅限溫室等封閉場所使用。

農(nóng)藥在真實(shí)條件下的環(huán)境歸趨和影響各不相同，施藥時(shí)間與作物花期之間的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，花粉花蜜中的實(shí)際殘留量很難獲得，因而使得評估結(jié)果相對保守，對環(huán)境生物的風(fēng)險(xiǎn)可能被高估。梁秀美等[27]研究了茶園花期用藥后蜂花粉中吡蟲啉及其代謝物的殘留量，并評估了對蜜蜂的初級風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果表明，吡蟲啉在茶樹上的使用對蜜蜂具有不可接受的急性接觸風(fēng)險(xiǎn)。對蜜蜂高風(fēng)險(xiǎn)的農(nóng)藥品種還需要通過半田間或田間試驗(yàn)，觀察農(nóng)藥對蜜蜂的慢性毒性效應(yīng)、累積毒性效應(yīng)以及種群生存和生長發(fā)育的毒性效應(yīng)，進(jìn)行高級風(fēng)險(xiǎn)評估。有些農(nóng)藥母體可能是低毒低風(fēng)險(xiǎn)，但其在環(huán)境中的降解產(chǎn)物可能與母體性質(zhì)迥異，這些降解產(chǎn)物在未來的風(fēng)險(xiǎn)評估中也需要加以關(guān)注。本研究一方面為農(nóng)藥的合理使用和管理提供了參考，另一方面提示我們只有通過深入全面的風(fēng)險(xiǎn)評估程序，合理規(guī)范的農(nóng)藥使用，才能減少農(nóng)藥對蜜蜂的危害。