蔡安妮 何海霞 羅蘭

摘 ?????要：建立了石淋通片的質(zhì)量控制方法。采用UV法測(cè)定石淋通片的總黃酮含量，HPLC法測(cè)定石淋通片中夏佛塔苷、異夏佛塔苷和異牡荊素的含量。色譜柱為Eclipse XDB-C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），用甲醇-2.5 mmol/L醋酸銨溶液作為流動(dòng)相，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為340 nm;流速為1 mL/min。經(jīng)驗(yàn)證，石淋通片的總黃酮含量在6.989～7.261 mg/g;夏佛塔苷、異夏佛塔苷和異牡荊素的線性關(guān)系良好，易于操作，儀器的精密度、樣品的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好，平均加樣回收率均在95%～105%之間。石淋通片中夏佛塔苷的最低含量為1.95 mg/g，異夏佛塔苷最低含量為0.80 mg/g，異牡荊素的最低含量為0.21 mg/g。該方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可用于石淋通片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

關(guān) ?鍵 ?詞：石淋通片;總黃酮;夏佛塔苷;異夏佛塔苷;異牡荊素;含量測(cè)定

中圖分類號(hào)：R284.1???????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：R???????文章編號(hào)： 1671-0460（2020）03-0745-04

Content Determination of Three Flavonoids in Shilintong Tablets

CAI An-ni， HE Hai-xia， LUO Lan^*

（Xinhua College of Sun Yat-sen University， Guangdong Guangzhou 510520， China）

Abstract： The quality control method of Shilintong tablet was established. UV method was used to determine the total flavonoids content of Shilintong tablet. The contents of schaftoside， isophtalin and isovitexin in Shilintong tablet were ????????????????????simultaneously determined by HPLC with the Eclipse XDB-C18 column （250 mm×4.6 mm， 5μm）using methanol-2.5 mmol/L ammonium acetate as mobile phase at the rate of 1 mL/min under the detection wavelength of 340 nm. After methodological verification， the?total flavonoids content of Shilintong tablet was 25.78～26.56 mg/g，the calibration curves were linear for schaftoside， isophtalin and isovitexin.The precision of the instrument， the?stability and reproducibility of the sample were good. The?average recovery was 95%～105%.The minimum contents of schaftoside， isophtalin and isovitexin in Shilitong tablet were 1.95 mg/g， 0.80 mg/g and 0.21 mg/g，respectively. The method is accurate and has good repeatability. It can be used to research the quality standard of Shilintong tablet.

Key words： ?Shilintong tablet; ?total flavonoids;schaftoside; ?isophtalin;??isovitexin; ?content determination

石淋通片為廣金錢草提取物的單方制劑，具有清熱利尿、抗氧化、抗炎、堿化尿通淋排石之功效，常用于濕熱所致的熱淋、石淋，出現(xiàn)尿頻、尿痛、尿路結(jié)石、腎盂腎炎癥狀的患者^[1，2]?，F(xiàn)代研究表明，廣金錢草中的主要活性成分是黃酮類化合物，其中含量較高并且具有明顯藥理作用的是夏佛塔苷、異夏佛塔苷和異牡荊素3種黃酮類成分^[3，4]。2015版中國藥典對(duì)廣金錢草中的夏佛塔苷成分做出了含量測(cè)定的規(guī)定，但卻未對(duì)石淋通片中的指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定，而且這種單一的質(zhì)量控制模式存在較大的缺陷。依據(jù)本研究的前期工作基礎(chǔ)，采用高效液相色譜方法研究建立了同時(shí)測(cè)定廣金錢草中3種黃酮類成分夏佛塔苷、異夏佛塔苷和異牡荊素的方法^[5-7]，可為石淋通片的質(zhì)量控制提供一定實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。

1 ?實(shí)驗(yàn)部分

1.1 ?儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1100 系列，美國安捷倫科技公司，含有四元梯度泵、二級(jí)管陣列檢測(cè)器、紫外檢測(cè)器、Chemstation 工作站），電子天平FA2004N（上海精密儀器有限公司），電熱恒溫水浴鍋（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），UV-1102型紫外分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）、超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 ?試藥

蘆丁對(duì)照品（純度≥98%，酷爾生物，批號(hào)：B154199）、夏佛塔苷對(duì)照品（純度>98%，成都瑞芬恩生物科技有限公司）、異夏佛塔苷對(duì)照品（純度>98%，成都瑞芬恩生物科技有限公司）、異牡荊素對(duì)照品（純度>98%，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司），石淋通片（廣東萬年青制藥有限公司）。甲醇為色譜純，亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純。

2 ?實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 ?石淋通片總黃酮的含量測(cè)定

2.1.1 ?對(duì)照品溶液的制備

精密稱取在120 ℃下干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品12 mg，置于50 mL量瓶中，加入60%乙醇適量，置水浴上微熱溶解，放冷，以60%乙醇稀釋至刻度，搖勻。

2.1.2 ?供試品溶液的制備

取本品10片（糖衣片為20片，除去包衣），研細(xì)，混勻，取供試品約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇 25 mL，稱定重量，超聲處理（功率100 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻?yàn)V過，濾液蒸干，殘?jiān)?0%甲醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 ?測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

精密量取對(duì)照品溶液3 mL，置25 mL量瓶中，加30%乙醇6.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min。加氫氧化鈉試液10 mL，再加30%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，按紫外分光光度法進(jìn)行掃描，顯示在511 nm處有最大吸收，確定檢測(cè)波長(zhǎng)為511 nm。

2.1.4 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確量取對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分置于25 mL量瓶中，各加30%乙醇6.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min。加氫氧化鈉試液10 mL，再加30%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，在511 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以濃度（C）為縱坐標(biāo)，吸光度（A）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：

A=15.841C-0.007 1，R²=0.999 9

2.1.5 ?精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液3 mL，按2.1.4方法顯色，連續(xù)測(cè)定6次吸光度，計(jì)算 RSD為0.22%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.1.6 ?穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液（150931）3 mL，按2.1.4方法顯色，于室溫放置0、10、20、30、40 min測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算含量，其含量的RSD為1.74%，結(jié)果表明，供試品在40 min內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。

2.1.7 ?重復(fù)性試驗(yàn)

取本品同一批樣品（150931）6份，按2.1.2方法平行制備供試品溶液，分別取3 mL，按2.4項(xiàng)下方法顯色， 測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算含量，其含量的RSD為1.35%。結(jié)果表明，此法重復(fù)性良好。

2.1.8 ?加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的石淋通片（S3）6份， 各2.0 g， 精密稱定。分別精密加入14.26 mg蘆丁對(duì)照品，加甲醇補(bǔ)足25 mL，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取3 mL，按2.4方法顯色測(cè)定，計(jì)算回收率為100.26%，RSD值為0.74%，見表1。

2.1.9 ?樣品含量測(cè)定

取3批廣金錢草樣品，按2.2項(xiàng)中所述的方法制備供試品溶液，精密吸取3 mL，按2.4方法顯色，測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算含量，測(cè)定結(jié)果見表2。

結(jié)果表明，3批石淋通片的總黃酮的含量在6.989～7.261 mg/g之間，RSD為1.91%

2.2 ?HPLC同時(shí)測(cè)定夏佛塔苷、異夏佛塔苷、異牡荊素的含量

2.2.1 ?色譜條件

色譜柱為Eclipse XDB-C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5μm），以甲醇-2.5 mmol/L醋酸銨溶液作為流動(dòng)相，梯度洗脫：0～20 min，甲醇占比為30%→40%; 20～35?min，甲醇占比為40%→55%;35～45 min，甲醇占比為55%→70%;檢測(cè)波長(zhǎng)為340 nm;流速為1 mL/min。

2.2.2 ?對(duì)照品溶液的制備

精密稱取對(duì)照品夏佛塔苷、異夏佛塔苷和異牡荊素適量，用甲醇分別溶解，均制成濃度為20 mg/mL的對(duì)照品溶液。分別精密量取各對(duì)照品溶液0.4、0.8、1 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成含0.8 mg/mL的夏佛塔苷，1.6 mg/mL的異夏佛塔苷，2 mg/mL異牡荊素的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 ?供試品溶液的制備

取本品10片（糖衣片為20片，除去包衣），研細(xì)，混勻，取供試品約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，稱重，超聲處理30 min，取出，放冷，濾過，取續(xù)濾液，濾液再經(jīng)微孔濾膜（0.45μm）濾過，即作為供試品溶液^[8]。

2.2.4 ?線性關(guān)系考察

精密量取按“2.2”方法配制的對(duì)照品貯備液0.05、0.1、0.5、1、1.5、2.0 mL置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。按2.1色譜條件分別進(jìn)樣，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制圖標(biāo)并計(jì)算回歸方程，結(jié)果見表3。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：夏佛塔苷在0.10～4.00 μg（R²= 0.999 8 ）內(nèi)線性關(guān)系良好，異夏佛塔苷在0.08～3.20?μg （R²=0.999 7 ）內(nèi)線性關(guān)系良好，異牡荊素在0.04～1.60 μg （R²=0.999 9 ）內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5??精密度試驗(yàn)

精密吸取10 μL同一混合對(duì)照品溶液，平行進(jìn)樣6次，按上述色譜條件進(jìn)行檢測(cè)?？傻媒Y(jié)果，3種黃酮類成分夏佛塔苷的峰面積RSD值為0.27%、異夏佛塔苷的峰面積RSD值為0.29%和異牡荊素的峰面積RSD值為0.34%，故可得儀器精密度良好。

2.2.6 ?穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液（150521）于0、2、4、8、12、16 h 連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣量為10 μL，按2.1項(xiàng)中的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄峰面積。結(jié)果得到3種黃酮類成分夏佛塔苷峰面積RSD值為1.39%、異夏佛塔苷峰面積RSD值為1.16%和異牡荊素的峰面積RSD值為2.72%，從以上結(jié)果可得樣品穩(wěn)定性良好。

2.2.7 ?重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批石淋通片樣品（150521）6份，每份10片（糖衣片為20片，除去包衣），研細(xì)，混勻，取約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶，精密加入60%甲醇25 mL，稱重，超聲處理30 min，取出，放冷，濾過，取續(xù)濾液，濾液再經(jīng)微孔濾膜（0. 45μm）濾過，按此法平行制備供試品溶液6份，按2.1項(xiàng)中的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定夏佛塔苷、異夏佛塔苷和異牡荊素成分的含量，可得RSD值分別為4.22%、4.09%和2.26%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 ?加樣回收率試驗(yàn)

取6份，已知成分含有量的同一批石淋通片樣品（150521），精密稱定，每份0.25 g，并分別加入0.505 mg/mL的夏佛塔苷對(duì)照品溶液1 mL、0.202 mg/mL的異夏佛塔苷對(duì)照品溶液1 mL和0.052 mg/mL的異牡荊素對(duì)照品溶液1 mL，置25 mL量瓶用，甲醇稀釋至刻度，按2.3項(xiàng)中同樣的方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)中的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算平均回收率。見表4。

結(jié)果夏佛塔苷的平均回收率為100.43%，異夏佛塔苷的平均回收率為100.57%，異牡荊素的平均回收率為96.76%。

2.2.9 ?樣品含量測(cè)定

取3批石淋通片樣品（批號(hào)150931、150521、150312），每批3份，每份約0.5?g，按2.3項(xiàng)中相同方法制備供試品溶液，按上述相同色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄本品中三個(gè)黃酮類成分（夏佛塔苷、異夏佛塔苷、異牡荊素）的峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算，測(cè)定結(jié)果見表5。

由以上結(jié)果可知，夏佛塔苷的最低含量為1.95 mg/g，異夏佛塔苷最低含量為0.80 mg/g，異牡荊素的最低含量為0.21 mg/g。

3 ?討 論

3.1 ?對(duì)照品的選擇

據(jù)報(bào)道，廣金錢草含有的黃酮類成分很多（夏佛塔苷、異夏佛塔苷、異牡荊苷等），不宜用其中一種成分的對(duì)照品直接進(jìn)行總黃酮的含量測(cè)定。因蘆丁是比較常用的總黃酮類標(biāo)樣，因此采用蘆丁對(duì)照品作為總黃酮的紫外分光光度法測(cè)定含量的標(biāo)樣。

3.2 ?樣品的處理

本試驗(yàn)參考有關(guān)資料[2，3]， 樣品用60%甲醇超聲提取， 并考察了超聲提取時(shí)間對(duì)樣品中夏佛塔苷提取的影響， 結(jié)果用60%甲醇超聲處理20、30 、45 min 測(cè)定結(jié)果相近。為確保提取完全， 故選擇超聲處理30 min。在蘆丁對(duì)照品和石淋通片的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)掃描中。在390 nm處有一較大的吸收峰，對(duì)390 nm吸收峰的機(jī)理仍不明確，需進(jìn)一步研究。

3.3 ?實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

在《中國藥典》2015年版一部中，石淋通片無含量測(cè)定項(xiàng)目。本文在廣金錢草3種成分含量測(cè)定的基礎(chǔ)上，對(duì)石淋通片的夏佛塔苷、異夏佛塔苷和異牡荊素3種黃酮類成分也作了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)同一藥廠生產(chǎn)的不同批次的樣品，夏佛塔苷的最低含量為1.95 mg/g，異夏佛塔苷最低含量為0.80 mg/g，異牡荊素的最低含量為0.21 mg/g，各指標(biāo)成分的含量差別不大，質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。

本試驗(yàn)建立的采用UV測(cè)定石淋通片總黃酮的含量及HPLC同時(shí)測(cè)定石淋通片中3種黃酮類成分含量的方法，方法準(zhǔn)確可靠，精密度良好。此方法能夠快速地檢測(cè)石淋通片中3種黃酮類成分含量，可為石淋通片的質(zhì)量控制提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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