上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院檢驗科，臨床微生物室，上海 200092

肺炎克雷伯菌是引起院內感染常見的條件致病菌，常引起血流、肺及泌尿系統(tǒng)等感染[1]。我國Mohnarin耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)[2]顯示，引起血流感染的革蘭陰性病原菌中，肺炎克雷伯菌檢出率僅次于大腸埃希菌，位居第二。肺炎克雷伯菌引起的血流感染若得不到及時治療，易導致感染性休克與彌散性血管內凝血等嚴重并發(fā)癥，患者病情兇險，死亡率高。

19世紀80年代中國臺灣首次報道引起肝膿腫的高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulentKlebsiella pneumoniae，hvKP），隨后日本、韓國、澳大利亞等地區(qū)相繼出現(xiàn)有關hvKP感染的病例報道[3]。肺炎克雷伯菌的毒力主要與莢膜多糖、脂多糖、鐵載體及菌毛等毒力因子密切相關，但各種毒力因子在hvKP的致病機制中發(fā)揮的作用仍不明確。不同于經(jīng)典肺炎克雷伯菌（classicKlebsiella pneumoniae，cKP），hvKP常常具有高黏液表型，又稱高黏液性肺炎克雷伯菌（hypermucoviscousKlebsiella pneumoniae，HMKP）；而cKP毒力雖較弱，較少引起肝膿腫、眼內炎等轉移性感染病灶，但cKP對臨床常用抗菌藥物的耐藥性高，給臨床抗感染治療帶來困難。有研究[4]表明，與黏液絲試驗相比，檢測肺炎克雷伯菌的血清型（如K1型、K2型）及毒力基因（如rmpA、aerobactin基因）更適用于hvKP的篩選。本研究收集上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院2016年10月—2018年3月分離自血培養(yǎng)的肺炎克雷伯菌，檢測菌株黏液表型、莢膜血清型及毒力基因，通過多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）對菌株進行分子流行病學研究，收集并分析患者的臨床資料，了解分離自血培養(yǎng)肺炎克雷伯菌的毒力基因攜帶情況、莢膜血清分型、分子流行病學特點及患者臨床特征。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院2016年10月—2018年3月分離自血培養(yǎng)的非重復肺炎克雷伯菌80株，使用VITEK-2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)對菌株進行鑒定。菌株于甘油肉湯中-80 ℃保存。質控菌株大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853及肺炎克雷伯菌ATCC700603由上海市臨床檢驗中心提供。

1.1.2 主要試劑和儀器 BACTECTM-FX血培養(yǎng)系統(tǒng)及血培養(yǎng)瓶購自美國BD公司，BACT/ALERT 3D全自動血培養(yǎng)儀及血培養(yǎng)瓶、VITEK-2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)、巧克力平板、革蘭陰性細菌鑒定卡（GNI）購自法國Bio Mérieux公司，Micro flexTMMALDI-TOF MS全自動微生物分析系統(tǒng)購自德國Bruker Daltonik公司，血平板、麥康凱平板購自上海伊華生物技術有限公司，電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海一恒科學儀器有限公司，干式恒溫器購自海門其林貝爾儀器制造有限公司，臺式高速離心機、PCR儀購自德國Eppendorf公司，PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，水平電泳儀、紫外凝膠成像儀均購自上海天能科技有限公司。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 黏液絲試驗 將凍存的菌株轉種至血平板，35 ℃孵育過夜，用無菌接種環(huán)挑取血平板上的單個菌落，重復3次。若黏液絲長度大于或等于5 mm，判為黏液絲試驗陽性，即為HMKP；若不能挑起黏液絲或黏液絲長度小于5 mm，判為黏液絲試驗陰性。

1.2.2 莢膜血清型及毒力基因檢測 使用煮沸法提取細菌DNA模板。通過擴增wzi基因的方法檢測莢膜多糖（K抗原）血清型，擴增產(chǎn)物送至上海生工生物工程公司測序，測序結果提交巴斯德研究所網(wǎng)站（https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html），獲得菌株的wzi分型及莢膜血清分型，引物序列、反應體系及擴增條件參照文獻[5]。采用PCR擴增和基因測序方法檢測肺炎克雷伯菌常見的毒力基因，包括莢膜多糖相關毒力基因rmpA、rmpA2、magA和wcaG，鐵載體相關毒力基因aerobactin、iucA、iroN、entB、iutA、ybtS、ycf和kfu，菌毛編碼相關毒力基因mrkA、mrkD、fimA和fimH，毒力質粒pLVPK相關基因pLVPK、silS和terW，脂多糖表達相關基因uge，尿囊素代謝相關基因allS、ureA。引物序列、反應體系及擴增條件參照相關文獻（表1）。陽性擴增產(chǎn)物送至上海生工生物工程公司測序，測序結果提交美國國立生物技術信息中心（NCBI）網(wǎng)站進行Blast比對。

表1 血清型及毒力基因引物序列Tab 1 Primer sequences of serotypes and virulence genes

Continued Tab

1.2.3 hvKP的判定 目前尚無hvKP的統(tǒng)一判斷標準。參考相關文獻[3]，本研究將同時攜帶rmpA和aerobactin基因的菌株，判為hvKP。

1.2.4 MLST 根據(jù)肺炎克雷伯菌官網(wǎng)（http://bigsdb.web.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html）推薦的7個管家基因（gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB），進行 PCR擴增并測序，測序結果提交MLST網(wǎng)站進行比對分析，獲得菌株對應的ST型。

1.2.5 臨床資料收集 通過臨床醫(yī)師電子病歷系統(tǒng)，收集住院患者相關臨床資料，包括感染類型、性別、年齡、科室、基礎疾病及并發(fā)癥等。感染類型[16]分為：①社區(qū)獲得性血流感染，即入院48 h內血培養(yǎng)結果為陽性。②醫(yī)院獲得性血流感染，即入院時不存在血流感染，入院48 h后血培養(yǎng)結果為陽性；或由其他醫(yī)療機構轉入，入院后48 h內血培養(yǎng)陽性。

1.3 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。定量資料以±s表示，組間比較采用秩和檢驗；定性資料以頻數(shù)和百分率表示，采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗進行組間比較。P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 黏液絲試驗

2016年10月—2018年3月共收集80株分離自血培養(yǎng)的肺炎克雷伯菌，黏液絲試驗（圖1）篩選出9株HMKP，陽性率為11.25%。

圖1 高黏液表型的肺炎克雷伯菌（黏液絲試驗）Fig 1 HMKP in string test

2.2 莢膜血清型及毒力基因檢測結果

分離自血培養(yǎng)的80株肺炎克雷伯菌中，44株檢測出莢膜血清分型，以K14.K64型（24株）為主，以下依次為K1型（6株）、K2型（4株）、K16型（3株）、K25型（2株 ），K14、K80、K56、K31和 K15.K17.K50.K51.K52型各1株。莢膜血清分型未確定的肺炎克雷伯菌有36株，以wzi209為主（19株），以下依次為wzi173（5株）和wzi197（2 株 ），wzi73、wzi262、wzi278、wzi331、wzi337、wzi381、wzi535各1株，另有3株菌株未比對出wzi分型。

毒力基因檢測結果顯示，所有菌株均攜帶entB、mrkA和ureA基因，ycf、mrkD和fimH基因檢出率均為98.75%，uge基因檢出率為96.25%，ybtS基因為85.0%，fimA基因為73.75%，pLVPK基因為50.00%，silS基因為38.75%，iutA基因為21.25%，iucA、terW基因均為20.00%，rmpA、rmpA2和iroN基因均為18.75%，kfu、aerobactin、wcaG、magA、allS基因檢出率分別為16.25%、12.50%、10.00%、7.50%、5.00%。毒力基因在44株不同血清型肺炎克雷伯菌中的分布見表2。

表2 毒力基因在44株不同血清型肺炎克雷伯菌的分布（n）Tab 2 Distribution of virulence genes in 44 Klebsiella pneumoniae isolates with different serotypes (n)

同時攜帶rmpA和aerobactin基因的hvKP有10株，包括6株K1型、3株K2型和1株K16型。10株hvKP中有8株為HMKP，以HMKP篩選hvKP的陽性符合率為96.25%。hvKP在HMKP與非HMKP菌株中的檢出率分別為88.89%（8/9）和2.82%（2/71），差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=46.519，P=0.000）。

cKP血清型以K14.K64型（24株）為主，其次為K16型、K25型 各 2株，K2、K14、K80、K56、K31和K15.K17.K50.K51.K52型各1株，其余36株cKP的莢膜血清分型未確定。

2.3 hvKP與cKP血清型及毒力基因檢出情況比較

hvKP與cKP血清型及毒力基因檢出情況比較發(fā)現(xiàn)，K14.K64型主要檢出于cKP，K1型和K2型2種高毒力血清型主要分布于hvKP。magA、allS基因僅分布于K1型hvKP；毒力基因rmpA2、iutA、terW、silS、iucA、iroN、kfu、wcaG和pLVPK在hvKP中檢出率明顯高于cKP菌株，且差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。其他毒力基因分布無明顯差異（表3）。

表3 hvKP與cKP血清型及毒力基因檢出率比較[n（%）]Tab 3 Comparasion of serotypes and virulence gene detection rates between hvKP and cKP [n（%）]

2.4 MLST結果

分離自血培養(yǎng)的80株肺炎克雷伯菌中，76株有MLST分型結果，共檢出23種ST型別，包括ST11型43株，ST23、ST14及 ST307型各3株，ST17、ST36、ST147、ST380及ST792型各2株，ST37、ST45、ST111、ST218、ST261、ST323、ST585、ST660、ST661、ST700、ST881、ST950、ST1883及ST2159型各1株。有4株未檢出ST分型。

對菌株MLST分型及莢膜血清型分析發(fā)現(xiàn)，24株K14.K64型菌株包括23株ST11型和1株ST147型。6株K1型菌株包括3株ST23型、1株ST218型、1株ST2159型、1株ST700型。4株K2型菌株包括2株ST380型、1株ST881型、1株ST14型。

10株hvKP的MLST分型以ST23型（3株）和ST380型（2株）為主，其他為ST660、ST700、ST881、ST218和ST2159型各1株，70株cKP主要為ST11型（43株）。

2.5 hvKP與cKP來源患者的臨床特征比較

80例血培養(yǎng)檢出肺炎克雷伯菌的患者臨床資料顯示，hvKP引起的社區(qū)獲得性血流感染占50.0%，顯著高于cKP組（17.1%），差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.049）。hvKP組與cKP組患者均以男性為多，年齡分別為（51.00±20.24）歲和（36.96±37.61）歲，2組間性別與年齡分布差異無統(tǒng)計學意義。hvKP組科室分布以急診重癥監(jiān)護室為主（30.0%），cKP組以兒童重癥監(jiān)護室為主（31.4%），差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.001）。hvKP組有40.0%患者患有糖尿病，明顯高于cKP組患者（10.0%），差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.037）。80例患者中有4例合并肝膿腫患者，均檢出于hvKP組（表4）。

表4 hvKP與cKP引起血流感染患者的臨床特征比較Tab 4 Comparasion of clinical characteristics between the patients with bloodstream infection caused by hvKP and cKP

3 討論

具有高黏液表型的肺炎克雷伯菌能更有效地抵抗吞噬細胞及血清補體的溶菌活性，易隨血流播散至其他部位，引起多發(fā)性膿腫和多器官功能衰竭[3]。本研究黏液絲試驗陽性率為11.25%，與其他報道相似[17]；以HMKP篩選hvKP的陽性符合率為96.25%，hvKP在HMKP與非HMKP中分布差異具有統(tǒng)計學意義，提示高黏液表型在一定程度上能夠反映肺炎克雷伯菌的毒力，可將黏液絲試驗作為初步篩選hvKP的指標。

本院分離自血培養(yǎng)的肺炎克雷伯菌的莢膜血清型主要是K14.K64型，莢膜血清分型未確定的菌株以wzi209為主。研究[5]顯示，約95.0%的肺炎克雷伯菌可通過檢測莢膜基因座保守區(qū)wzi基因，得到莢膜血清分型。本研究有3株菌攜帶wzi基因，但在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中未獲得其對應的莢膜血清分型。目前肺炎克雷伯菌的莢膜血清分型至少有77個[18]，K1、K2、K5、K54及K57型是常見的高毒力血清型，以K1和K2型菌株毒力最強，已成為引起肝膿腫的主要病原菌。本研究hvKP血清型以K1型和K2型為主，未檢出K5、K54及K57型等高毒力血清型菌株。文獻[19]報道，rmpA和magA基因的編碼產(chǎn)物能夠促進莢膜多糖表達，使菌株呈現(xiàn)高黏液表型，但具有高黏液表型菌株不一定同時攜帶rmpA和magA基因。本研究中攜帶rmpA和magA基因的菌株均為高黏液表型菌株，而高黏液表型菌株中攜帶rmpA和magA基因的菌株占66.67%（6/9），與前述報道相符。

氣桿菌素（aerobactin）是肺炎克雷伯菌毒力增強的主要毒力因子，也是最重要的鐵載體，能夠使肺炎克雷伯菌毒力增強100倍[20]。本研究編碼氣桿菌素及其受體的iucA、iutA基因，以及編碼沙門菌素及其受體的iroN基因在hvKP中的檢出率顯著高于cKP，推測氣桿菌素可能與沙門菌素共同參與肺炎克雷伯菌鐵攝取能力的調控，從而增強菌株毒力。

rmpA2基因常與rmpA、iutA、terW和silS基因同時存在于大小為180 000～220 000 bp的毒力質粒pLVPK上。獲得該毒力質粒的肺炎克雷伯菌，毒力明顯增強[21]。研究[22]發(fā)現(xiàn)，前述5種毒力基因不一定同時存在，可能與毒力質粒pLVPK易變區(qū)發(fā)生同源重組有關，但包含rmpA2、rmpA、iutA、terW和silS基因越多的菌株，存在類似pLVPK毒力質粒的可能性越大。本研究檢出rmpA2基因的6株hvKP，均同時檢出rmpA、iutA、terW和silS基因及pLVPK，因此推測這6株hvKP的毒力增強，可能與獲得毒力質粒pLVPK有關。wcaG基因（編碼巖藻糖，保護細菌逃避巨噬細胞的吞噬作用）、allS基因（編碼產(chǎn)物參與尿囊素代謝，為細菌生長提供氮源）、kfu基因（編碼產(chǎn)物可促進鐵離子的吸收）主要檢出于K1型hvKP，提示這些毒力基因可能在K1型肺炎克雷伯菌毒力增強過程中發(fā)揮了重要作用。

菌毛能夠介導肺炎克雷伯菌定植于組織器官表面，與生物膜形成密切相關。研究[23]表明，能夠形成生物膜的hvKP，其侵襲能力明顯增強。本研究發(fā)現(xiàn)編碼Ⅰ型和Ⅲ型菌毛的fimA、fimH基因和mrkA、mrkD基因，在cKP與hvKP間分布無明顯差異，提示菌毛普遍存在于肺炎克雷伯菌；該結果與既往報道[24]相符。

本研究分離自血培養(yǎng)的肺炎克雷伯菌共檢出ST11型、ST14型及ST23型等23種型別。有研究[25]顯示，hvKP與ST分型密切相關，ST23型K1菌株是hvKP主要的流行株。本研究K1型菌株以ST23型為主（50.0%），并檢出ST218型、ST700型和ST2159型。ST218型與ST23型相比，僅infB基因存在差異，兩者有高度的遺傳相關性。不同于hvKP的MLST分型結果，ST11型是cKP主要流行株（61.43%），與有關報道[26]相符。本研究有4株菌可能由于tonB基因發(fā)生突變，無法獲得其MLST分型結果[27]。

hvKP引起的血流感染以社區(qū)獲得性為主，主要檢出于急診ICU病區(qū)，患者住院時間短、預后較好，可能與hvKP對臨床常用抗菌藥物保持較高的敏感性有關。本研究4例肝膿腫患者血培養(yǎng)均檢出具有高黏液表型的hvKP，4株hvKP的血清型是引起肺炎克雷伯菌性肝膿腫常見的K1型（3株）和K2型（1株），因此推測這4例患者的肝膿腫也是由hvKP引起。糖尿病是肺炎克雷伯菌引起肝膿腫的獨立危險因素，糖尿病患者合并肝膿腫較非糖尿病患者的風險性增加3.6倍，并且更易發(fā)生眼內炎、腦膜炎等轉移性感染[28]。本研究hvKP引起的血流感染患者中，糖尿病患者占40.0%，4例并發(fā)肝膿腫患者中有3例合并2型糖尿病，可能與糖尿病患者免疫功能下降以及高血糖環(huán)境有利于hvKP生長繁殖有關[29]。

此次分離的hvKP比例較低（16.67%），可能與菌株分離自血培養(yǎng)有關。隨著侵入性操作的增多，患者醫(yī)院獲得性血流感染發(fā)病率升高，并且多由耐碳青霉烯類的cKP引起，而hvKP引起的血流感染易并發(fā)肝膿腫等侵襲性感染，因此臨床醫(yī)師應對血培養(yǎng)分離出肺炎克雷伯菌的患者予以重視。