吳娜，董依慧，吉曉燕，皇甫長(zhǎng)安，陸小華

（1 南京工業(yè)大學(xué)材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210009； 2呂勒奧工業(yè)大學(xué)能源工程系，瑞典呂勒奧97187）

引 言

蛋白分子與載體材料表面之間的相互作用具有高度的復(fù)雜性，涉及到工程學(xué)、材料學(xué)、生物學(xué)等跨學(xué)科研究領(lǐng)域[1]，推動(dòng)著如人造器官的抗污染特性[2]，液相色譜柱分離蛋白[3]，以及電化學(xué)生物傳感和藥物運(yùn)輸中酶的固定化[4]等領(lǐng)域的發(fā)展。一系列不同應(yīng)用和現(xiàn)象背后的本質(zhì)在于蛋白分子與載體材料表面之間的相互作用的大小不同，因此，調(diào)控兩者之間的相互作用對(duì)于控制生物分子的作用行為至關(guān)重要[1,5]。

當(dāng)生物材料進(jìn)入到生理體系中，材料的表面結(jié)構(gòu)性質(zhì)對(duì)蛋白分子在表面的相互作用有著重要的影響。材料結(jié)構(gòu)性質(zhì)，主要包括形狀、孔結(jié)構(gòu)和表面粗糙度。例如Tang 等[6]通過(guò)調(diào)整硅前驅(qū)體和表面活性劑的摩爾比，進(jìn)而控制二氧化硅顆粒形貌，從球形、棒狀到蠕蟲(chóng)狀結(jié)構(gòu)，不同形狀顆粒比表面積不同，藥物運(yùn)輸?shù)哪芰σ膊煌ayne 等[7]分析孔材料孔隙直徑和酶負(fù)荷值之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)當(dāng)孔徑小于10 nm，由于酶在進(jìn)入孔時(shí)受到物理限制，載量較小，當(dāng)孔徑大于100 nm，由于可用表面積減少，酶載量也會(huì)下降，在10～100 nm 的孔徑范圍內(nèi)，隨著孔徑的增大，酶載量水平會(huì)降低。Huang等[8]通過(guò)對(duì)鈦片表面噴砂處理，再采用強(qiáng)酸腐蝕，得到具有納米粗糙度的結(jié)構(gòu)，并在界面上培養(yǎng)細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)具有納米粗糙結(jié)構(gòu)的表面具有很強(qiáng)的抗細(xì)菌功能。這些不同結(jié)構(gòu)的本質(zhì)主要是固體材料與蛋白分子的有效接觸面積的不同，接觸面積不同進(jìn)而產(chǎn)生不同的相互作用及性能。因此，調(diào)節(jié)材料表面結(jié)構(gòu)可以實(shí)現(xiàn)蛋白分子與固體表面相互作用的調(diào)控。

在一系列載體材料中，TiO2納米管(TiO2nanotube arrays,TNAs)在具有TiO2材料的優(yōu)點(diǎn)，如優(yōu)異的生物相容性、機(jī)械穩(wěn)定性好的同時(shí)[9-12]，還具有納米形貌可調(diào)、形貌高度規(guī)整有序等特點(diǎn)，成功運(yùn)用到如光電催化[13-14]、電化學(xué)生物傳感[15-16]、抗菌涂層[17]、醫(yī)學(xué)植入材料[18]等領(lǐng)域。目前制備TNAs 的方法有多種[19-21]，其中陽(yáng)極氧化法由于方法簡(jiǎn)單，過(guò)程簡(jiǎn)練，而受到廣泛關(guān)注。當(dāng)氧化電壓越大時(shí)，制備得到的TNAs 管徑越大[22]。然而，隨著電壓的增加，TNAs的粗糙度也大大增加，粗糙度主要來(lái)源于制備過(guò)程形成的大范圍裂紋以及管徑的高低不均勻性，導(dǎo)致高電壓下制備得到的納米管性能降低[23]。因此如何合理有效地調(diào)控納米管表面的粗糙度，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)其表面結(jié)構(gòu)性能的有效提高尤為重要。文獻(xiàn)[24]報(bào)道陽(yáng)極氧化法利用電解液腐蝕生成TNAs，電解液組分包括氟化銨、乙二醇和水，其中氟離子作為主要腐蝕劑，能有效定向調(diào)節(jié)TNAs 的表面結(jié)構(gòu)，包括孔徑、壁厚，有望作為調(diào)控納米管表面粗糙度的一種手段。

通常情況下，判斷生物蛋白在載體表面的吸附強(qiáng)弱主要通過(guò)宏觀吸附量的大小[25-27]，然而宏觀吸附量只是一種簡(jiǎn)單的定性分析相互作用強(qiáng)弱的手段，需要借助其他一些高效實(shí)驗(yàn)手段來(lái)表征生物蛋白與載體表面的相互作用。表征蛋白與固體表面相互作用的手段有多種，如液相色譜[28]、電化學(xué)傳感[29]、表面拉曼增強(qiáng)[30]等，而原子力顯微鏡(atomic force microscopy,AFM)作為表征材料表面三維結(jié)構(gòu)以及表面力學(xué)性質(zhì)的有效儀器[31]，可以通過(guò)自組裝將蛋白分子固定在AFM 探針上直接用來(lái)表征蛋白分子與復(fù)雜固體表面相互作用力的大小[32-33]。本課題組前期采用AFM 定量研究了介孔TiO2與不同蛋白相互作用，并獲得了單個(gè)蛋白分子與介孔TiO2表面在復(fù)雜條件下的作用力[22,34-36]，奠定了利用AFM定量研究蛋白與固體表面相互作用的基礎(chǔ)?；诖耍疚牡墓ぷ髦饕ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)電解液中氟離子的濃度來(lái)制備不同粗糙度的TNAs，進(jìn)一步采用AFM 表征其形貌及粗糙度，并基于AFM 的力學(xué)表征特性，研究納米管表面力學(xué)性能。同時(shí)，將蛋白自組裝修飾到探針針尖，形成蛋白團(tuán)簇，測(cè)試該團(tuán)簇與材料表面黏附力，研究粗糙度對(duì)生物分子與TNAs 表面相互作用影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

金屬鈦片(0.25 mm)，99.7%，Sigma-Aldrich；砂紙，50 μm；氟化銨(NH4F)，ACS，98%；乙二醇(C2H6O2)，分析純，上海試四赫維化學(xué)有限公司；無(wú)水乙醇(C2H6O)，分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；商業(yè)可用純凈水；細(xì)胞色素C(Cytochrome C，Cyt C，尺寸：2.6 nm×3.2 nm×3.3 nm，分子量：12400)，北京拜爾迪生物有限公司；巰基十六烷基酸(HS(CH2)15COOH, 90%)，上海Sigma-Aldrich Trading Co.Ltd.公司；二甲基甲酰胺(DMF，無(wú)水)，三乙胺(C6H15N，99%),三氟乙酸酐(C4F6O3，98%)均購(gòu)于上海J&K Scientific 公司；二氯甲烷(CH2Cl)，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 TNAs的制備

TNAs 的制備方法采用Grimes[20]提出的恒電位陽(yáng)極氧化法，具體過(guò)程如下：金屬鈦片作為基底，將鈦片裁剪成1 cm×3 cm 的長(zhǎng)方形，用砂紙打磨掉表面的TiO2層，在純凈水和無(wú)水乙醇中分別超聲清洗15 min，重復(fù)交替3 次后，常溫下用氮?dú)獯蹈擅芊獗４?，作為?yáng)極基底備用。電解液采用乙二醇作溶劑，0.4%(質(zhì)量)氟化銨作腐蝕劑，并含有1%(質(zhì)量)的純凈水。電解池中盛放75 ml 上述電解液，預(yù)處理后的鈦片做陽(yáng)極，鉑片做陰極。采用兩步陽(yáng)極氧化法，先在8 V 電壓下反應(yīng)12 h，后分別在15、25、35、45 V 下反應(yīng)12 h，將制得物在乙二醇中超聲清洗45 min，再用無(wú)水乙醇沖洗兩次，于60℃烘箱中烘干，再采用高溫退火處理，馬弗爐于初始溫度20℃下以2℃·min-1速度升高到500℃，焙燒2 h 后自然冷卻，密封干燥保存。

本文通過(guò)改變電解液中氟離子的濃度來(lái)調(diào)節(jié)TNAs 表面的粗糙度，因此，同時(shí)制備了不同氟離子濃度下的TNAs，制備方法同上，僅將氟化銨的濃度分別變?yōu)?.3%、0.2%(質(zhì)量)。因此，基于不同氟離子濃度下制備得到的樣品命名為：0.4-TNA-15V、0.4-TNA-25V、0.4-TNA-35V、0.4-TNA-45V、0.3-TNA-15V、0.3-TNA-25V、0.3-TNA-35V、0.3-TNA-45V、0.2-TNA-15V、0.2-TNA-25V、0.2-TNA-35V、0.2-TNA-45V。

1.3 材料表征

X 射線粉末衍射(XRD，Bruker D8 Adavance)用于表征材料晶體結(jié)構(gòu)，工作電流、電壓分別為40 mA和40 kV，掃描速度為0.02(°)·min-1，范圍為10°～60°；掃 描 電 子 顯 微 鏡(FESEM，Hitachi S-4800，Japan)用于表征材料的表面結(jié)構(gòu)形貌，放大倍數(shù)1000～200000，加速電壓5 kV；原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM，Bruker ICON)用于表征材料表面三維形貌(輕敲模式)及力學(xué)測(cè)試(接觸模式)；激光拉曼光譜(Raman，Horiba Labram HR800)用于表征材料表面組成信息，采用He-Cd 激光，激光波長(zhǎng)為514 nm，激光功率為10 mW，掃描范圍100～800 cm-1。

1.4 Cyt C修飾AFM探針

AFM 探針選為表面覆蓋Au 的氮化硅探針(NPG-10,彈性系數(shù)在0.05～0.5 N·m-1，針尖曲率半徑約為20 nm)，將探針浸泡在溶劑為50%(體積)的無(wú)水乙醇溶液的1 mmol·L-1巰基十六烷基酸溶液中，于37℃的烘箱中避光放置12 h。隨后取出探針，用無(wú)水乙醇清洗表面3～4 次，自然風(fēng)干。隨后將探針?lè)胖迷?.28 ml 三乙胺、0.14 ml 三氟酸酐和9.58 ml二甲基甲酰胺的混合溶液中，室溫下浸泡20 min[37]。然后取出探針，用二氯甲烷清洗3次，自然風(fēng)干。最后，配制pH 為7.2 的磷酸緩沖鹽(phosphate buffer saline,PBS)溶液體系下的2 mg·ml-1的Cyt C溶液，將探針浸泡到上述PBS 緩沖體系下的蛋白溶液中12 h,隨后用緩沖溶液清洗，自然風(fēng)干，即可得到修飾Cyt C的探針。

1.5 AFM黏附力測(cè)試

在室溫、大氣狀態(tài)下，使用接觸模式進(jìn)行AFM黏附力的測(cè)試，主要包括采用AFM 探針(SNL-10，彈性系數(shù)在0.06～0.35 N·m-1)直接測(cè)試材料表面黏附力，以及采用Cyt C 修飾后AFM 探針測(cè)試Cyt C 與材料表面黏附力。測(cè)試步驟分兩步，第一步矯正探針彈性系數(shù)，首先選擇藍(lán)寶石為基底，在掃描速率為1.0 Hz 下掃完一張圖，獲得偏轉(zhuǎn)靈敏度(deflection sensitivity)，接著進(jìn)行熱調(diào)(thermal tune)，獲得矯正后的探針的彈性系數(shù)，最后可將電壓信號(hào)(V)轉(zhuǎn)換為力的單位(N)。第二步將藍(lán)寶石換為待測(cè)樣品，在掃描速率為1.0 Hz，掃描范圍為2 μm×2 μm 下掃完一張圖，黏附力的測(cè)得主要根據(jù)力曲線獲得[37]。在掃描圖中選取100 個(gè)點(diǎn)做100 個(gè)力曲線用于獲得平均黏附力。

2 結(jié)果與討論

2.1 TNAs的組成分析

采用XRD 表征三種不同氟離子濃度下制備得到的四種外加電壓下(15、25、35、45 V)的TNAs 的晶相。圖1(a)～(c)分別是0.4%、0.3%、0.2%(質(zhì)量)氟離子濃度下TNAs 的XRD 譜圖，其中在25.3°、37.7°和48.0°均出現(xiàn)了明顯的衍射峰，分別對(duì)應(yīng)的是TiO2的101、004 和200 晶面，為典型銳鈦礦相。同時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)銳鈦礦相峰的強(qiáng)度隨著外加電壓的升高逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明樣品中銳鈦礦相的含量逐漸增加，無(wú)定形的含量逐漸減少。另外，由于TNAs 的制備基底為T(mén)i基底，因此，在TNAs的XRD譜圖上還會(huì)存在少許Ti的峰，隨著電壓的增加，制備的管越長(zhǎng)，XRD 譜圖上Ti的峰越來(lái)越弱，這是由于XRD在Ti上的衍射穿透深度越來(lái)越弱所導(dǎo)致[22]。

圖1 不同氟離子濃度和電壓下制備TNAs的XRD譜圖Fig.1 XRD patterns of TNAs prepared at different F-concentrations and voltages

圖2(a)～(c)分別是0.4%、0.3%、0.2%(質(zhì)量)氟離子濃度下TNAs 的Raman 譜圖。由圖中可以發(fā)現(xiàn)，峰出現(xiàn)的 位 置分別在145.2、398.1、519.6、641.7 cm-1，進(jìn)一步說(shuō)明制備得到的TNAs 均是穩(wěn)定的銳鈦礦晶型，同時(shí)發(fā)現(xiàn)銳鈦礦相峰的強(qiáng)度隨著外加電壓的增大逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明樣品中銳鈦礦相的含量逐漸增加，與XRD譜圖中的結(jié)果一致。

采用AFM 對(duì)TNAs 表面形貌及粗糙度進(jìn)行表征。圖3 是0.4%(質(zhì)量)氟離子濃度下的四個(gè)外加電壓(15、25、35、45 V)下的TNAs 的2D 以及表面高度圖。從2D 圖可以發(fā)現(xiàn)，隨著陽(yáng)極氧化電壓的增加，TNAs 的管徑增加。另外，隨著氧化電壓的增加，TNAs 的粗糙度增加，通過(guò)均方根(root-mean-square,RMS)處理得到15、25、35、45 V 電壓下制備得到的TNAs 粗糙度分別約為23.2、47.5、61.4、85.2 nm(表1)。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)表面高度圖的起伏程度也隨著電壓的增大而增大，波谷深度從約90 nm到350 nm，即裂紋導(dǎo)致的起伏越來(lái)越明顯，這也是粗糙度逐漸增加的原因。

圖4 是0.3%(質(zhì)量)氟離子濃度下的四個(gè)外加電壓下的TNAs 的2 D 以及表面高度圖?？梢园l(fā)現(xiàn)，TNAs的管徑隨著陽(yáng)極氧化電壓的增加而增大，粗糙度也增加，處理得到四個(gè)電壓下的TNAs 粗糙度分別約為21.4、44.9、55.1、65.3 nm(表1)。同時(shí)，表面高度圖的起伏程度同樣隨著電壓的增大而增大，波谷深度從約50 nm 到200 nm。另外，和圖3 比較，在同一電壓下，0.3%(質(zhì)量)氟離子濃度下的TNAs 表面粗糙度值降低，同時(shí)高度圖的起伏程度比0.4%(質(zhì)量)氟離子濃度下的小，說(shuō)明通過(guò)降低氟離子濃度可以減小納米管表面粗糙度以及高低起伏程度。這是因?yàn)門(mén)NAs 的生成分為三個(gè)階段：TiO2氧化膜的形成，多孔氧化膜的形成，納米管的形成，氟離子主要作用在多孔氧化膜的形成階段，能刻蝕鈦基底表面和溶解生成的TiO2阻擋層，將表面由點(diǎn)蝕坑形貌逐漸變?yōu)榉涓C狀結(jié)構(gòu)[38]，因此氟離子濃度減小，表面腐蝕程度降低，從而影響TNAs表面的粗糙結(jié)構(gòu)。

圖2 不同氟離子濃度和電壓下制備TNAs的Raman譜圖Fig.2 Raman spectra of TNAs prepared at different F-concentrations and voltages

圖5 是0.2%(質(zhì)量)氟離子濃度下的四個(gè)外加電壓下的TNAs 的2 D 以及表面高度圖。同樣發(fā)現(xiàn)，TNAs的管徑隨著陽(yáng)極氧化電壓的增加而增大，粗糙度同樣增加，處理得到四個(gè)電壓下的TNAs 粗糙度分別約為14.4、36.7、37.0、63.8 nm(表1)，粗糙度值相比0.3%(質(zhì)量)氟離子濃度下的TNAs 明顯降低。同時(shí)，表面高度圖的起伏程度雖隨著電壓的增大而增大，但在同一電壓下，0.2%(質(zhì)量)氟離子濃度下的TNAs 表面高度圖的起伏程度最小，波谷深度從約20 nm 到150 nm 左右，明顯發(fā)現(xiàn)納米管的高低起伏的不均勻性得到改善，進(jìn)一步驗(yàn)證了采用氟離子濃度的調(diào)控可以實(shí)現(xiàn)納米管表面粗糙度以及高低起伏平整度的調(diào)控。

將不同氟離子濃度下制備得到的TNAs 粗糙度值匯總在表1 中，可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)氟離子濃度一定時(shí)，隨著氧化電壓增大，制備得到的TNAs 粗糙度增大；同時(shí)，在外加電壓一定的情況下，降低氟離子濃度，TNAs表面粗糙度有所降低。進(jìn)一步分析，在氧化電壓較低的情況下(如15 V 和25 V)，氟離子濃度的改變對(duì)粗糙度的影響不及高電壓下(如35 V 和45V)的明顯，尤其在35 V時(shí)，氟離子濃度從0.4%(質(zhì)量)降到0.2%(質(zhì)量)，TNAs 粗糙度降低了將近一半。由此可見(jiàn)，通過(guò)調(diào)控電解液中氟離子的濃度，可以實(shí)現(xiàn)TNAs的表面粗糙度的有效調(diào)控。

采用FESEM 對(duì)TNAs 進(jìn)行形貌表征。圖6 是0.4%(質(zhì)量)氟離子濃度下的TNAs 的FESEM 圖(500 nm 和5 μm 掃描范圍)。通過(guò)FESEM 圖(500 nm 掃描范圍)可以發(fā)現(xiàn)，隨著氧化電壓增加，制備得到的TNAs 的管徑增加，15、25、35、45 V 電壓制備得到的TNAs 的管徑分別約為24.7、51.1、65.7、91.6 nm(表2)。同時(shí)，通過(guò)FESEM 圖(5 μm 掃描范圍)可以發(fā)現(xiàn)，隨著外加電壓增大，TNAs表面平整度變差，這和AFM表征的粗糙度結(jié)果一致。

圖7 是0.3%(質(zhì)量)氟離子濃度下的TNAs 的FESEM 圖(500 nm 和5 μm 掃描范圍)。通過(guò)FESEM圖(500 nm 掃描范圍)發(fā)現(xiàn)，隨著氧化電壓增加，制備得到的TNAs 的管徑增加，15、25、35、45 V 電壓下制備得到的TNAs 的管徑分別約為23.1、49.9、65.0、87.2 nm(表2)。同時(shí)，通過(guò)比較FESEM 圖(5 μm 掃描范圍)，外加電壓增大，TNAs 表面平整度變差。另外，和圖6相比較，在同一電壓下，0.3%(質(zhì)量)氟離子濃度下的TNAs 的管徑與0.4%(質(zhì)量)氟離子濃度下的相比變化不大，但是表面平整度變好，與AFM 表征的粗糙度結(jié)果一致。

圖3 0.4%(質(zhì)量)氟離子濃度下不同電壓制備TNAs的AFM 2D以及高度圖Fig.3 AFM topographical and corresponding height images of TNAs prepared with different voltages at 0.4%(mass)F-concentration

圖4 0.3%(質(zhì)量)氟離子濃度下不同電壓制備TNAs的AFM 2D以及高度圖Fig.4 AFM topographical and corresponding height images of TNAs prepared with different voltages at 0.3%(mass)F-concentration

表1 不同外加電壓以及氟離子濃度下TNAs粗糙度Table 1 Roughness of TNAs under different applied voltages and F-concentrations

圖5 0.2%(質(zhì)量)氟離子濃度下不同電壓制備TNAs的AFM 2D以及高度圖Fig.5 AFM topographical and corresponding height images of TNAs prepared with different voltages at 0.2%(mass)F-concentration

圖8 是0.2%(質(zhì)量)氟離子濃度下的TNAs 的FESEM 圖(500 nm 和5 μm 掃描范圍)。通過(guò)FESEM圖(500 nm 掃描范圍)發(fā)現(xiàn)，隨著氧化電壓增加，制備得到的TNAs 的管徑增加，15、25、35、45 V 電壓下制備得到的TNAs 的管徑分別約為21.5、48.7、62.3、78.8 nm(表2)。同時(shí)，通過(guò)比較FESEM 圖(5 μm 掃描范圍)，外加電壓增大，TNAs 表面平整度也變差。另外，和圖7相比較，在同一電壓下，0.2%(質(zhì)量)氟離子濃度下的TNAs 的管徑在電壓較小的情況下變化不大，但表面平整度得到改善，裂紋明顯減少，和前面AFM表征的粗糙度結(jié)果一致。

將不同氟離子濃度以及電壓下的TNAs 的壁厚、管徑列于表2中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)氟離子濃度相同時(shí)，TNAs 的管壁隨外加電壓的增大而變??；當(dāng)制備電壓一定時(shí)，隨著氟離子濃度的降低，TNAs 的壁厚增加。說(shuō)明氟離子濃度的降低在減小表面粗糙度的同時(shí)，增加了壁厚。當(dāng)電壓固定時(shí)，隨著氟離子濃度的降低，管徑減小，但是變化較小，其主要由于壁厚的增加導(dǎo)致管徑有所減小。

TNAs 的管長(zhǎng)對(duì)其性能也有一定影響，因此，同時(shí)采用FESEM 對(duì)TNAs 管長(zhǎng)進(jìn)行表征，測(cè)得不同外加電壓以及氟離子濃度下TNAs 管長(zhǎng)，結(jié)果匯總于表3?？梢园l(fā)現(xiàn)，同一氟離子濃度下，管長(zhǎng)隨著電壓增大而增大；而同一電壓下，不同氟離子濃度下制備的TNAs 管長(zhǎng)幾乎相等，說(shuō)明改變氟離子濃度對(duì)管長(zhǎng)的影響可忽略。

2.2 AFM測(cè)試探針與TNAs黏附力

黏附力測(cè)試在AFM接觸模式下進(jìn)行，AFM測(cè)得的黏附力的大小與針尖和樣品之間的接觸面積相關(guān)，接觸面積越大，探針脫離表面所需要克服的力就增加，因此獲得的黏附力也增加。為了獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，探針與每個(gè)樣品之間的黏附力測(cè)試了100個(gè)位置的力曲線，獲得100個(gè)黏附力，并做成統(tǒng)計(jì)分布圖。

將探針在不同氟離子濃度和外加電壓下制備得到的TNAs表面(2 μm×2 μm)黏附力分布圖通過(guò)高斯方程擬合，以35 V 的數(shù)據(jù)處理為例，如圖9 所示。使用擬合得到的峰位置和半峰寬分別作為平均黏附力和誤差值，將結(jié)果列于表4 中。表4 同時(shí)列出了處理得到的壁面積比率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一氟離子濃度下，35 V 下TNAs 表面黏附力皆最大，這是由于此時(shí)壁面積比率最大，探針與TNAs 有效接觸面積達(dá)到最大；而外加電壓一定時(shí)，隨著氟離子濃度降低，納米管表面粗糙度減小，壁面積比率值增加，探針與TNAs 有效接觸面積增大，因而黏附力也增大。

表2 不同外加電壓以及氟離子濃度條件下TNAs壁厚及管徑Table 2 Wall thickness and diameter of TNAs under different applied voltages and F-concentrations

圖6 0.4%(質(zhì)量)氟離子濃度下不同電壓制備得到TNAs的FESEM 圖像Fig.6 FESEM images of TNAs prepared with different voltages at 0.4%(mass)F-concentration

圖7 0.3%(質(zhì)量)氟離子濃度下不同電壓制備TNAs的FESEM圖像Fig.7 FESEM images of TNAs prepared with different voltages at 0.3%(mass)F-concentration

表3 不同外加電壓以及氟離子濃度下TNAs管長(zhǎng)Table 3 Tube length of TNAs under different applied voltages and F-concentrations

圖8 0.2%(質(zhì)量)氟離子濃度下不同電壓下制備TNAs的FESEM圖像Fig.8 FESEM images of TNAs prepared with different voltages at 0.2%(mass)F-concentration

2.3 AFM測(cè)試Cyt C與TNAs黏附力

Cyt C 是一種在生物氧化過(guò)程中具有電子傳遞能力的蛋白，進(jìn)而在生物傳感以及表面拉曼增強(qiáng)等領(lǐng)域被廣泛用作模型研究蛋白[22,39]。將Cyt C 自組裝修飾到探針針尖，形成蛋白團(tuán)簇，測(cè)試該團(tuán)簇與材料表面黏附力。和AFM 測(cè)試探針與材料表面黏附力相同，組裝蛋白的針尖脫離樣品表面的力為蛋白與其表面黏附力。同樣地，為了獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Cyt C 與每個(gè)樣品之間的黏附力測(cè)試了100 個(gè)位置的力曲線，獲得100 個(gè)黏附力，并做成統(tǒng)計(jì)分布圖。

圖9 不同氟離子濃度35 V下制備TNAs的表面黏附力分布Fig.9 Histogram of adhesion forces measured for TNAs prepared with 35 V at different F-concentrations

表4 不同外加電壓以及氟離子濃度條件下TNAs壁面積比率以及表面黏附力Table 4 Wall area ratio and adhesion force of TNAs under different applied voltages and F-concentrations

將Cyt C 在不同氟離子濃度和外加電壓下制備得到的TNAs表面(2 μm×2 μm)黏附力分布圖通過(guò)高斯方程擬合，以35 V的數(shù)據(jù)處理為例，如圖10所示。使用擬合得到的峰位置和半峰寬分別作為平均黏附力和誤差值，將結(jié)果列于表5中?？梢园l(fā)現(xiàn)探針-TNAs 表面黏附力隨電壓和氟離子濃度的變化趨勢(shì)相同，即同一氟離子濃度下，35 V 下黏附力皆最大；而當(dāng)外加電壓一定，隨著氟離子濃度降低，納米管表面粗糙度減小，黏附力增大。結(jié)果說(shuō)明通過(guò)調(diào)控電解液中氟離子濃度能夠有效控制TNAs 表面粗糙度，進(jìn)一步改變蛋白與其表面相互作用大小。

表5 不同外加電壓以及氟離子濃度條件下Cyt C-TNAs表面黏附力Table 5 Adhesion force of Cyt C-TNAs under different applied voltages and F-concentrations

圖10 Cyt C與不同氟離子濃度35 V下制備TNAs的表面黏附力分布Fig.10 Histogram of adhesion forces measured for Cyt C with TNAs prepared with 35 V at different F-concentrations

圖11 黏附力與粗糙度的關(guān)聯(lián)Fig.11 Association between adhesion and roughness

圖11 為黏附力與粗糙度的關(guān)聯(lián)，可以發(fā)現(xiàn)，同一氟離子濃度下，Cyt C 與不同電壓制備下的TNAs之間的黏附力先增加后減小，在35V 下制備得到的TNAs 與蛋白之間的黏附力均最大，主要原因在于TNAs 壁面積比率最大，蛋白團(tuán)簇與TNAs 表面有效接觸面積最大；而同一電壓下，氟離子濃度降低，黏附力增大，也是由于TNAs 平整度變好，壁面積比率變大，蛋白團(tuán)簇與TNAs 有效接觸面積增大。電解液中氟離子濃度以及外加電壓對(duì)粗糙度的影響，本質(zhì)上是對(duì)Cyt C 與TNAs 有效接觸面積的改變，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)兩者之間的黏附力的調(diào)控。

3 結(jié) 論

采用電化學(xué)陽(yáng)極氧化法，電解液以乙二醇為溶劑，分別以0.4%、0.3%、0.2%(質(zhì)量)氟化銨為腐蝕劑，不同電壓下制備得到一系列不同粗糙度和孔徑大小的TNAs，以AFM 表征其形貌粗糙度以及進(jìn)行力學(xué)測(cè)試，并將蛋白修飾到針尖，進(jìn)一步研究粗糙度對(duì)生物分子與TNAs 表面相互作用影響。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)固定外加電壓，氟化銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.4%(質(zhì)量)降到0.2%(質(zhì)量)，制備得到的TNAs 表面粗糙度降低，壁厚增加，TNAs管徑變化較小，導(dǎo)致壁面積比率增加，蛋白分子與TNAs 有效接觸面積增大，進(jìn)一步導(dǎo)致黏附力增加。綜上所述，通過(guò)調(diào)節(jié)電解液里氟化銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可改變TNAs 表面粗糙度，從而增大蛋白分子與其表面接觸面積，進(jìn)一步增加其表面黏附力，這對(duì)TNAs 在生物電極固定化領(lǐng)域具有一定的指導(dǎo)意義。