周賢達(dá) 周桂林 范家萌 睢祥坤 林茂 王浩波

摘 要：為了更深入地了解不同薄皮甜瓜材料間的相互關(guān)系，采用多樣性指數(shù)、變異系數(shù)及分子標(biāo)記等方法，對(duì)69份薄皮甜瓜材料的18個(gè)田間性狀及SSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，描述型性狀多樣性指數(shù)范圍為0.076～1.332，平均值為0.847，其中最高的是種子顏色，為1.332，最低的是果皮斑點(diǎn)，為0.076;數(shù)字型性狀變異系數(shù)范圍從最低的果實(shí)橫徑10.56%到最高的單果質(zhì)量34.11%，平均值為23.88%;多樣性指數(shù)范圍為6.03～6.10，平均值為6.07，最高的是果實(shí)橫徑。所有數(shù)字型性狀多樣性指數(shù)均高于描述型性狀。綜合分析可知，供試材料由于收集和選育原因多為果肉較厚的長(zhǎng)果形材料;田間性狀及分子標(biāo)記分別聚類(lèi)分析后發(fā)現(xiàn)2種方法分別從不同角度對(duì)材料進(jìn)行描述，只有充分結(jié)合2者的結(jié)果，才能最大可能地選擇出強(qiáng)優(yōu)組合。

關(guān)鍵詞：薄皮甜瓜;多樣性指數(shù);變異系數(shù);聚類(lèi)分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S652 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2020）01-007-06

Abstract： In order to better understand the interrelationship between different oriental melon materials ， we used 18 diversity traits， coefficient of variation and molecular markers to make 18 field traits of 69 oriental melon from Fengle Seeds Company. The results showed that the description index of the traits diversity range 0.076-1.332， the average value was 0.847， the highest was the seed color 1.332， the lowest was the peel spot 0.076， the numerical trait variation coefficient ranged from the lowest fruit transverse diameter 10.56% to the highest single fruit weight 34.11%， with an average of 23.88%， the diversity index 6.03-6.10， the average value of 6.07， the highest is the fruit transverse diameter， and all the digital trait diversity indices are higher than the descriptive traits. The results showed that the test material was due to the large length of the long fruit profile， the field traits and molecular markers were clustered and analyzed， and the two methods were used to describe the materials from different aspects. Application of both methods can most likely choose the strongest combination.

Key words： Cucumis melo sp. conomon; Diversity index; Coefficient of variation; Cluster analysis

薄皮甜瓜是我國(guó)人民喜愛(ài)的一種傳統(tǒng)水果，傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)中薄皮甜瓜的次生起源中心是東亞地區(qū)[1]。林德佩在綜合前人分類(lèi)建議下，將甜瓜Cucumis melo種下劃分成短毛甜瓜亞種（ssp. agrestis Jeffrey）和長(zhǎng)毛甜瓜亞種（ssp. melo Jeffrey）2個(gè)亞種，也就是傳統(tǒng)意義上的薄皮甜瓜和厚皮甜瓜[2-6]。以往已有很多學(xué)者進(jìn)行過(guò)薄皮甜瓜的聚類(lèi)分析，他們的研究主要集中在利用分子標(biāo)記進(jìn)行資源分類(lèi)分析，但對(duì)于田間性狀的研究卻相對(duì)匱乏[7-10]。雖然層出不窮的新分子標(biāo)記實(shí)踐確實(shí)對(duì)于從基因組層面認(rèn)識(shí)作物起到了積極作用，但因薄皮甜瓜作為一種栽培作物，最終栽培時(shí)的氣象、土壤條件會(huì)對(duì)果實(shí)發(fā)育有直接的影響，在其他作物已有將兩者相結(jié)合研究的前提下，對(duì)薄皮甜瓜的田間性狀與分子標(biāo)記進(jìn)行對(duì)比分析[7-15]，為田間育種工作提供參考，將具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

筆者希望通過(guò)田間性狀與分子標(biāo)記的結(jié)合[16]，分析兩者之間的區(qū)別與聯(lián)系，理清兩者之間的關(guān)系，最終為加快薄皮甜瓜新品種選育和保護(hù)薄皮甜瓜品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

來(lái)源于合肥豐樂(lè)種業(yè)的薄皮甜瓜材料69份，具體材料見(jiàn)表1。

1.2 田間性狀分析

參照《甜瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》，調(diào)查記載18個(gè)農(nóng)藝學(xué)性狀，具體包括描述型性狀（田間相對(duì)長(zhǎng)勢(shì)、田間相對(duì)抗性、果皮顏色、果皮溝紋、果皮斑點(diǎn)、果皮被毛、果肉顏色、果肉纖維、果肉質(zhì)地、果實(shí)香味、種子大小、種子顏色）和數(shù)字型性狀（縱徑/橫徑、果實(shí)橫徑、果實(shí)縱徑、果肉厚度、單果質(zhì)量、中心可溶性固形物含量）[17-18]。

描述型性狀依據(jù)《甜瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》中對(duì)農(nóng)藝性狀考察的標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合多年田間試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)確定，數(shù)字型性狀通過(guò)田間調(diào)查得出。對(duì)甜瓜果實(shí)描述型性狀按表2進(jìn)行賦值，使用Min-Max方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換，將所有性狀值分布在0～1區(qū)間內(nèi)，抹除不同性狀值間偏差[19-20]。對(duì)描述型性狀進(jìn)行頻率分布及Shannon-weiner index考察（多樣性指數(shù)）。對(duì)數(shù)字型性狀進(jìn)行極值、變異系數(shù)及多樣性指數(shù)考察。

1.3 聚類(lèi)分析

采用CTAB法提取甜瓜種子總DNA，使用SSR分子標(biāo)記擴(kuò)增，擴(kuò)增引物及反應(yīng)程序參考高鵬及盛云燕[21-22]提供的20 ?L反應(yīng)體系及反應(yīng)程序，使用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，記錄帶型數(shù)據(jù)。SSR分子標(biāo)記顯帶的記錄方法為：針對(duì)重復(fù)性好、擴(kuò)增效果明顯的條帶，有帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”，兩者結(jié)合生成特定引物的品種原始矩陣。

20對(duì)SSR引物序列來(lái)自公開(kāi)發(fā)表的文獻(xiàn)及國(guó)際葫蘆科合作計(jì)劃中公布的甜瓜引物對(duì)，結(jié)合引物在染色體群上的分布特點(diǎn)及薄皮甜瓜上的多態(tài)性表現(xiàn)選取（表3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間性狀分析

對(duì)12個(gè)描述型性狀進(jìn)行頻率分布及多樣性指數(shù)分析（表4）發(fā)現(xiàn)，田間相對(duì)長(zhǎng)勢(shì)和田間相對(duì)抗性均以“強(qiáng)”為主，分別占比52%和55%。果皮顏色以“綠”為主，占54%。果肉顏色以“白”為主，占57%;果皮以“有”溝為主，占52%。果皮“無(wú)”斑、“無(wú)”毛各占96%、99%。對(duì)影響果實(shí)口感的果肉纖維、果肉質(zhì)地、香味3個(gè)性狀，“少”纖維占72%、“脆”肉占68%、“無(wú)”香味占42%，種子涉及的性狀中“乳白”色占43%、“小”籽占54%。

供試材料多樣性指數(shù)范圍（0.076～1.332），平均0.847。其中，種子顏色（1.332）和果皮顏色（1.311）分列多樣性指數(shù)前兩位;果皮被毛（0.179）和果皮斑點(diǎn)（0.076）分列最后兩位。

結(jié)合頻率分布及多樣性指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，本次供試材料表現(xiàn)出明顯的人工選擇痕跡，這在12個(gè)描述型性狀上均有體現(xiàn)，具體表現(xiàn)為：材料選擇中著重選擇“強(qiáng)”長(zhǎng)勢(shì)、“強(qiáng)”抗性、表皮光滑、肉質(zhì)“脆”、口感“細(xì)膩”。這種材料選擇傾向與大眾對(duì)薄皮甜瓜的喜好是完全一致的。

表5結(jié)果表明，6個(gè)數(shù)字型性狀變異系數(shù)，最小的為果實(shí)橫徑（10.56%），最大的為單果質(zhì)量（34.11%），平均值為23.88%;多樣性指數(shù)范圍為（6.03～6.10），平均值為6.07。所有數(shù)字型性狀的多樣性指數(shù)范圍（6.03～6.10）均高于描述型性狀，說(shuō)明數(shù)字型性狀的多樣性更豐富。

供試材料的縱徑/橫徑平均值為1.21、標(biāo)準(zhǔn)差為0.40，說(shuō)明供試材料主要呈“長(zhǎng)”果形，變異系數(shù)32.96%，說(shuō)明其最小值和最大值間差異較大;果實(shí)橫徑變異系數(shù)10.56%，說(shuō)明其變異程度較低;對(duì)比果實(shí)縱徑變異系數(shù)27.30%，說(shuō)明供試材料縱徑/橫徑的變異主要來(lái)源于果實(shí)縱徑;果肉厚度和中心可溶性固形物含量的變異系數(shù)及多樣性指數(shù)均處于6個(gè)數(shù)字型性狀的中游水平;單果質(zhì)量具有18個(gè)農(nóng)藝學(xué)性狀中最高的變異系數(shù)34.11%，說(shuō)明單果質(zhì)量是所有性狀中變異程度最大的。

2.2 聚類(lèi)分析

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，使用Mega軟件，運(yùn)用UPGMA算法，對(duì)田間性狀進(jìn)行聚類(lèi)分析（圖1）。

聚類(lèi)分析將供試材料劃分成2個(gè)群，分析田間性狀發(fā)現(xiàn)，2個(gè)群的主要區(qū)別在種子大小和種子顏色，僅有個(gè)別材料例外。田間性狀間遺傳距離范圍為0.083～0.667，其中遺傳距離最近的5對(duì)材料是‘T03-412和‘T07-7711、‘T03-412和‘T09-514、‘33-422和‘T28-42、‘芙蓉蜜-2和‘黑玫1號(hào)-14311、‘T16-3321和‘T51-11，他們兩兩之間遺傳距離均為0.083，田間性狀觀察也顯示每對(duì)材料性狀相近（表6）。

使用20對(duì)引物合計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)生131條擴(kuò)增帶，均具有多態(tài)性，平均每對(duì)引物產(chǎn)生6.55條帶。對(duì)材料的電泳數(shù)據(jù)直接用NTSYS軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為遺傳距離，使用Mega軟件利用UPGMA算法進(jìn)行聚類(lèi)分析（圖2）。

經(jīng)分析，69份材料的遺傳距離范圍為0.000 0～0.984 7，平均值為0.325，其中遺傳距離最小的6對(duì)分別是：‘10引薄F1-14111和‘M056-21、‘T02-5111和‘T21-323、‘T08-214和‘T40-521、‘32-314和‘十道溝-11111、 ‘6171-51和‘香蜜5號(hào)、‘T31-8221和‘T55-11，遺傳距離均為0.000。除‘T11-312‘T15-111‘T51-11和‘T53-111外，其余材料均聚為一大類(lèi)。

2.3 田間性狀數(shù)據(jù)與分子標(biāo)記聚類(lèi)結(jié)果綜合分析

通過(guò)詳細(xì)對(duì)比兩種聚類(lèi)結(jié)果（圖1～2）發(fā)現(xiàn)，兩者之間聚類(lèi)結(jié)果有明顯不同，如分子標(biāo)記聚類(lèi)中遺傳距離最小的6對(duì)材料在田間性狀聚類(lèi)中就分列在2個(gè)群中，每群6個(gè)材料。以上情況表明，僅靠田間表型性狀差異選擇親本雜交，可能會(huì)發(fā)生由于分子遺傳基礎(chǔ)相近導(dǎo)致雜交優(yōu)勢(shì)不明顯的現(xiàn)象，具體遺傳距離的區(qū)別見(jiàn)表7。

人工選擇對(duì)薄皮甜瓜的性狀有明顯影響，一方面有利于選擇出更適合市場(chǎng)的薄皮甜瓜材料，另一方面也易于造成選擇過(guò)程僅局限在少量?jī)?yōu)勢(shì)親本的后代，進(jìn)而導(dǎo)致遺傳來(lái)源過(guò)于狹窄。薄皮甜瓜在不同生態(tài)條件下的種質(zhì)利用還有很大空間[25]，在雜種優(yōu)勢(shì)利用過(guò)程中，如果可以選擇田間遺傳距離相近的而分子遺傳距離較遠(yuǎn)的材料相配，可能會(huì)配出更有優(yōu)勢(shì)的組合，如‘T16-3321和‘T51-11;而田間遺傳距離較遠(yuǎn)但分子遺傳距離較近的材料如‘T31-8221和‘T55-11配出強(qiáng)優(yōu)組合的可能性就較小。兩者結(jié)合選擇親本，才有最大可能通過(guò)雜交而選育出強(qiáng)優(yōu)組合。

3 討 論

前人研究的對(duì)薄皮甜瓜的種群劃分依據(jù)單果質(zhì)量、果皮顏色的結(jié)果[9，25-27]在本次試驗(yàn)中沒(méi)有表現(xiàn)，分析可能的原因是公司一段時(shí)間內(nèi)有相對(duì)集中的選育目標(biāo)，故參試材料重點(diǎn)集中在與目標(biāo)有關(guān)的果實(shí)性狀，這種關(guān)注點(diǎn)的不同導(dǎo)致聚類(lèi)材料劃分標(biāo)準(zhǔn)的不同。

田間性狀與分子標(biāo)記聚類(lèi)結(jié)果不一致，這與前人的研究結(jié)果相同[27-28]。植物通過(guò)改變自身描述型性狀來(lái)適應(yīng)田間環(huán)境的變化，這種變化很難在基因?qū)用嬗斜憩F(xiàn)，數(shù)字型性狀的變化多是受多基因位點(diǎn)調(diào)控，分子標(biāo)記對(duì)基因組的覆蓋度也會(huì)直接影響檢出效果。

傳統(tǒng)薄皮甜瓜主要是通過(guò)對(duì)田間性狀的考察完成材料及品種選育工作，僅僅依靠田間性狀的考察并不能完整揭示材料特性，特別是對(duì)雜交優(yōu)勢(shì)的利用存在極大局限性。筆者研究發(fā)現(xiàn)，具有相似田間性狀的材料從分子層面考察時(shí)可能兩者相距甚遠(yuǎn)，如‘美濃-11和‘T-51-11、‘特大早甜208-1和‘T-26-511，而分子層面相近的材料卻在田間性狀上具有巨大差異，如‘T11-312和‘T-15-111、‘T-51-11和‘T-53-11。筆者希望利用田間性狀及分子標(biāo)記分別進(jìn)行聚類(lèi)分析，為更全面認(rèn)識(shí)薄皮甜瓜材料提供參考，如果在品種選育過(guò)程中，選用具有相似田間性狀但遺傳距離更遠(yuǎn)的材料進(jìn)行配組，更利于選擇出優(yōu)良品種，也能避免遺傳基礎(chǔ)過(guò)于狹窄。

后期研究中希望通過(guò)更多的選用SSR引物，及在田間數(shù)字型性狀的記錄過(guò)程中引入標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照樣將數(shù)據(jù)記錄結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，從而完成更加精細(xì)的薄皮甜瓜種內(nèi)差異分析，最終實(shí)現(xiàn)兩種角度共同對(duì)材料進(jìn)行描述，使薄皮甜瓜育種工作可以更加精準(zhǔn)。

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