韓濤 姜立娜 郭衛(wèi)麗 周俊國 陳學進

摘 要：南瓜屬（Cucurbita）作物包括中國南瓜（C. moschata D.）、印度南瓜（C. maxima D.）和美洲南瓜（C. pepo L.）等許多重要蔬菜，在世界范圍內(nèi)廣泛栽培，具有重要的經(jīng)濟價值。目前，南瓜屬作物遺傳轉(zhuǎn)化技術普遍存在轉(zhuǎn)化效率低、重復性差、假陽性和嵌合體干擾等諸多問題。隨著分子生物學的迅猛發(fā)展，南瓜屬作物遺傳改良和基因功能驗證亟需建立高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系。前人在南瓜離體再生、花粉管通道和農(nóng)桿菌介導等轉(zhuǎn)化方法上做過不少探索，普遍認為以農(nóng)桿菌介導的子葉節(jié)離體再生是最具潛力的轉(zhuǎn)化體系。筆者對現(xiàn)有的研究基礎進行綜述， 為促進其在南瓜屬作物遺傳改良上的應用提供參考。

關鍵詞：南瓜屬;花粉管通道法;農(nóng)桿菌;轉(zhuǎn)基因;離體再生

中圖分類號：S642.1? ?文獻標志碼：A? ?文章編號：1673-2871（2020）01-001-06

Abstract： Cucurbita crop includes many important vegetables， such as C. moschata D.， C. maxima D. and C. pepo L.， which are widely cultivated worldwide and have important economic values. At present， there are many problems of genetic transformation in Cucurbita， such as low efficiency， poor repeatbility， and interference of false-positive and chimeric. As the rapid development of molecular biology， it is urgent to establish an efficient and stable genetic transformation system for genetic improvement and gene function verification. Many researches have been conducted on the methods of pumpkin regeneration in vitro， pollen tube pathway and Agrobacterium-mediated transformation. It is generally believed that Agrobacterium-mediated cotyledon node regeneration is the most potential transformation system. Here we summarize the research progress in this field， providing references to promote its application in the genetic improvement of Cucurbita crops.

Key words： Cucurbita; Pollen tube mediated gene transfer; Agrobacterium; Transgenesis; Regeneration in vitro

南瓜是葫蘆科（Cucurbitaceae）南瓜屬（Cucurbita）的重要蔬菜，包括5個主要栽培種，分別為：中國南瓜（C. moschata D.），印度南瓜（C. maxima D.），美洲南瓜（C. pepo L.），黑籽南瓜（C. ficifolia B.）和灰籽南瓜（C. mixta P.）[1]。南瓜起源于中南美洲，栽培歷史悠久，世界各地均有種植，具有重要的經(jīng)濟價值。南瓜果實營養(yǎng)豐富，富含多種維生素、氨基酸和礦物質(zhì)，種子含有多種保健活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、提高肌體免疫力等功效[2]。由于南瓜植株抗逆性較強，常作為其他瓜類蔬菜的砧木，用于提高嫁接苗的抗逆性、產(chǎn)量及果實品質(zhì)[3-4]。

植物遺傳轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)基因技術）是指將外源基因（目的基因）經(jīng)過體外重組，通過種質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化或組織培養(yǎng)將目的基因整合于基因組，使植物獲得新的性狀并能穩(wěn)定遺傳的一系列技術[5]。遺傳轉(zhuǎn)化是植物性狀改良的重要手段，相對于傳統(tǒng)雜交方法具有不可比擬的優(yōu)勢，如能有效克服物種間的界限、改良性狀方向精準、育種進程短等。植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法主要有花粉管通道法、農(nóng)桿菌介導法和基因槍法等。

南瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系的探索起步比較晚，普遍存在轉(zhuǎn)化效率低、可重復性差等問題。隨著南瓜屬作物基因組序列的公布[6]，南瓜基因功能研究將進入后基因組時代，遺傳改良也將邁上新臺階，然而低效的遺傳轉(zhuǎn)化成為南瓜性狀改良和基因功能研究的主要瓶頸，因而建立高效穩(wěn)定的南瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系非常迫切。關于南瓜遺傳轉(zhuǎn)化詳盡的文獻綜述還未見報道，筆者根據(jù)現(xiàn)有的研究基礎，對不同的遺傳轉(zhuǎn)化方法進行綜述，總結(jié)技術難點，分析潛在的突破口，為建立高效穩(wěn)定的南瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系提供有力支持。

1 花粉管通道法

花粉管通道法（Pollen Tube Mediated Gene Transfer，簡稱PTT）是由我國學者周光宇等創(chuàng)立[7-8]，后經(jīng)不斷改進而建立的一種轉(zhuǎn)化技術?；驹硎抢檬芫寻l(fā)育初期易接受外源DNA分子的特點，以花粉萌發(fā)形成的花粉管為通道，將外源基因或含有外源基因的質(zhì)?；蜣r(nóng)桿菌通過柱頭涂抹、子房注入等方法使目的基因整合到受體細胞基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而獲得轉(zhuǎn)化植株。也有學者將該方法經(jīng)過改進后稱之為子房注射法[9]。花粉管通道法借助植物自身受精卵發(fā)育形成轉(zhuǎn)化植株，因此不依賴組織培養(yǎng)，技術簡單，成本低，已得到分子生物學驗證。該法在玉米（Zea mays）、小麥（Triticum aestivuml）、番茄（Solanum lycopersicum）、甜瓜（Cucumis melo）、西瓜（Citrullus lanatus）等多種作物上獲得成功[10]。利用花粉管通道法進行南瓜遺傳轉(zhuǎn)化的探索非常有限。張言朝等[11]采用子房注射法嘗試了南瓜轉(zhuǎn)化遺傳，南瓜授粉后24 h，向子房注射含目的基因的質(zhì)粒，收獲115個果實，選取56個果實的種子，幼苗經(jīng)過PCR鑒定得到7個陽性植株，T1代經(jīng)過鑒定并未得到純合的轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率僅為0.25%。轉(zhuǎn)化效率低，隨機性大，該方法能否再次獲得成功未見后續(xù)報道。2017年，中國農(nóng)業(yè)科學院研發(fā)了一項新的基于花粉管通道的遺傳轉(zhuǎn)化技術，以磁性納米顆粒Fe3O4作為基因載體，在外加磁場作用下將載體顆粒輸送至花粉內(nèi)部，用該花粉進行人工授粉直接獲得轉(zhuǎn)化種子，再經(jīng)過篩選獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因后代。該法在兩種棉花（Gossypium hirsutum）基因型中獲得了0.18%～1.00%的轉(zhuǎn)化率，在辣椒、百合、中國南瓜和美洲南瓜中嘗試，成功獲得了辣椒和中國南瓜的轉(zhuǎn)基因后代，但研究人員未說明轉(zhuǎn)化率[12]。該技術作為一種新的嘗試，可能具有廣泛的應用前景。

利用植物自然受精過程進行遺傳轉(zhuǎn)化的方法還有蘸花法（Floral-dip Method），該法配合使用農(nóng)桿菌，操作非常簡單，但轉(zhuǎn)化效率低，適合種子較多的植物，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）和其他部分植物中得到廣泛應用[13-15]，該法并不適合大多數(shù)植物，尤其是株型大、種子少的植物，后期篩選轉(zhuǎn)基因陽性植株將費時費力。南瓜株型大，雌花子房大且壁厚，通過蘸花使農(nóng)桿菌滲透到受精卵的可能性極小，因此筆者推測該法并不適合南瓜。

盡管花粉管通道法簡便，但并未成為南瓜遺傳轉(zhuǎn)化的主流方法，筆者認為可能的原因是其轉(zhuǎn)化機制尚不清楚，可重復性差，易受田間環(huán)境因素和花期影響，轉(zhuǎn)化效率低等。

2 農(nóng)桿菌介導法

植物遺傳轉(zhuǎn)化中農(nóng)桿菌介導法（Agrobacterium-mediated Gene Transfer）應用最為廣泛，幾乎所有的雙子葉植物和部分單子葉植物都適用。作為天然的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，該法具有單拷貝整合、轉(zhuǎn)化基因片段大、轉(zhuǎn)化效率高、遺傳穩(wěn)定（符合孟德爾遺傳）、較少發(fā)生基因沉默、可重復性較好等優(yōu)勢。農(nóng)桿菌介導法已經(jīng)在葡萄（Vitis vinifera）、矮牽牛（Petunia hybrida）、水稻（Oryza sativa）、小麥（Triticum aestivuml）、番茄（Solanum lycopersicum）、黃瓜（Cucumis sativus）等諸多植物中獲得成功[16-20]，成為植物遺傳轉(zhuǎn)化的主流方法。在南瓜遺傳轉(zhuǎn)化方面，前人的探索幾乎均采用農(nóng)桿菌介導法。南瓜的離體再生、南瓜基因型和外植體的選擇、農(nóng)桿菌菌株的選擇、篩選劑的選擇、侵染方法、脫菌方法和生長調(diào)節(jié)劑的使用等都會影響轉(zhuǎn)化效率，筆者就從這幾個方面進行論述。

2.1 南瓜的離體再生

高效穩(wěn)定的離體再生體系是農(nóng)桿菌介導法遺傳轉(zhuǎn)化的前提。和大多數(shù)植物一樣，南瓜有體細胞胚發(fā)生（Somatic embyogenesis）和器官發(fā)生（Organogenesis）兩種再生途徑。關于體細胞胚發(fā)生途徑前人做過很多研究，且多以美洲南瓜為試材。早在1995年，Carol Gonsalves等[21]就以子葉為外植體，經(jīng)過誘導培養(yǎng)11～17周后，6種美洲南瓜（又稱西葫蘆）基因型均誘導出體細胞胚并獲得再生苗。謝冰等[22]培養(yǎng)美洲南瓜未受精的胚珠，獲得了雌核發(fā)育的再生植株。但體細胞胚誘導效率并不高，因此前人探索了不同的處理方法，如熱激處理，改變培養(yǎng)基的pH及滲透壓，改變生長調(diào)節(jié)類物質(zhì)種類和濃度等[23-25]。相對于體細胞胚發(fā)生途徑，器官發(fā)生途徑頻率高、周期短。一般植物器官發(fā)生途徑既可以先誘導愈傷組織，也可直接誘導不定芽，然后生根培養(yǎng)。南瓜屬作物通過愈傷組織誘導不定芽非常困難，目前還未見文獻報道。因此，南瓜屬作物器官發(fā)生途徑均采用外植體直接誘導不定芽的方法。前人從外植體來源[26-27]、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類和濃度[28-29]等方面做過不少探索，南瓜的胚軸、胚根和葉片很難誘導出不定芽[28，30]，子葉節(jié)（帶基部的子葉）因再生率較高而成為廣泛使用的外植體。趙建萍等[28]認為子葉基部臨近下胚軸的切口處才能誘導出不定芽。Kathiravan等[31]以子葉節(jié)為外植體，對15個美洲南瓜種質(zhì)資源進行不定芽誘導，均獲得了再生，再生率為56%～94%，只有1個種質(zhì)為22%。Cheng等[32]也是利用子葉節(jié)誘導不定芽，成功獲得美洲南瓜雙單倍體再生植株。一些印度南瓜基因型也通過子葉節(jié)誘導不定芽獲得了再生植株，再生率較高[33-36]。Gisbert[37]對幾種南瓜屬作物種質(zhì)進行離體再生，通過子葉節(jié)誘導再生芽，3種美洲南瓜、2種黑籽南瓜、1種印度南瓜和2種中國南瓜均獲得了再生植株。日本學者通過誘導子葉節(jié)在14份包括美洲南瓜、印度南瓜、黑籽南瓜和中國南瓜種質(zhì)中均獲得了再生苗，再生率為38%～76%[38]。不定芽誘導過程中使用最多的是細胞分裂素，前人探索過不同激素的配比和濃度[36，39]，篩選出很多最優(yōu)組合。不定芽誘導成功后還要經(jīng)過芽伸長、誘導生根和馴化移栽等過程。當芽不易自然伸長時，多添加赤霉素GA3誘導[39]。多數(shù)基因型在不含激素的1/2 MS培養(yǎng)基上可正常生根[38]，添加生長素類激素可促進生根?？傮w來說，不定芽生根和組培苗馴化移栽比較容易。

綜合分析，高效穩(wěn)定的南瓜離體再生仍然存在一定困難，主要體現(xiàn)在體細胞胚再生困難且周期長，愈傷組織幾乎不會再分化[36]，子房或胚珠培養(yǎng)再生率低。目前，以子葉節(jié)為外植體進行離體再生是最成熟的方法，許多南瓜屬作物的不同基因型均獲得了較高的再生率，說明以子葉節(jié)為外植體的器官直接再生途徑對南瓜屬作物具有普適性，該法成為南瓜遺傳轉(zhuǎn)化的基礎。

2.2 南瓜基因型和外植體對轉(zhuǎn)化的影響

不同南瓜基因型對農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化有較大影響，可能是它們對農(nóng)桿菌的敏感性不同。根據(jù)Nanasato[38]的研究結(jié)果，使用同一種農(nóng)桿菌菌株EHA105，不同基因型南瓜的轉(zhuǎn)化效率最低為0%，最高可達到9.2%。在外植體選擇方面，子葉節(jié)最為常用。前人在子葉節(jié)取材時間、子葉節(jié)的狀態(tài)等方面做了不少探索。白婧等[39]認為印度南瓜‘金輝一號2片子葉直立、呈綠色時取材最佳，過早過晚均會降低轉(zhuǎn)化率。黑籽南瓜培養(yǎng)4 d的種子取子葉節(jié)最好[40]。張玉園[35]認為印度南瓜‘北觀在子葉微展、呈黃綠色時為最佳的取材時間。日本學者Nanasato[41]對中國南瓜子葉節(jié)的取材時間為種子在28 ℃下萌發(fā)1 d、胚根剛長出時。由此可見，子葉節(jié)的狀態(tài)對轉(zhuǎn)化成功與否至關重要。筆者分析可能的原因：一方面是子葉節(jié)近軸端芽的再生能力與其狀態(tài)密切相關;另一方面是取子葉節(jié)時切割的傷口是農(nóng)桿菌侵染的入口，如果傷口距離有再生能力的細胞較遠，則農(nóng)桿菌難以到達。子葉生長時間不同，具有再生能力細胞的位置也有所變化，所以子葉的狀態(tài)很重要。除了子葉節(jié)，有文獻報道南瓜莖尖轉(zhuǎn)化成功的例子，Shah等[42]以莖尖為外植體進行美洲南瓜遺傳轉(zhuǎn)化，成功獲得了轉(zhuǎn)nptII和cbf1基因的陽性植株，轉(zhuǎn)化效率0.7%，這說明莖尖也存在再生和被轉(zhuǎn)化的潛力。

2.3 農(nóng)桿菌對轉(zhuǎn)化的影響

農(nóng)桿菌是生長在土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，包括兩種主要類型：根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）和發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes），分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒。在農(nóng)桿菌侵染植物的過程中，質(zhì)粒上的T-DNA區(qū)可整合于植物基因組而完成轉(zhuǎn)化[43]。很早以前，研究人員就證實了農(nóng)桿菌對南瓜的可侵染性和轉(zhuǎn)化的可能性，Katavi[c][']等[44]使用野生型8196和15834兩種發(fā)根農(nóng)桿菌菌株嘗試轉(zhuǎn)化美洲南瓜，菌株8196可以使子葉誘導發(fā)根，經(jīng)過比較，誘導的根系和正常的南瓜根系在生理上存在很大不同。Toppi等[45]證明發(fā)根農(nóng)桿菌菌株、植株年齡和侵染時間均會影響美洲南瓜的轉(zhuǎn)化。在嘗試印度南瓜轉(zhuǎn)化時，F(xiàn)rancisco等[46]的研究結(jié)果表明，根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌對瞬時轉(zhuǎn)化效率的影響不大。目前，得到廣泛應用的農(nóng)桿菌工程菌株大多為根癌農(nóng)桿菌（如EHA101、EHA105、LBA4404、GV3301等）。前人研究發(fā)現(xiàn)，不同菌株的侵染能力有所不同[47]，對離體再生也有影響[5]，因此選擇合適的菌株對南瓜遺傳轉(zhuǎn)化可能是個關鍵因素。

農(nóng)桿菌的生長狀態(tài)和活力對侵染效率有較大影響。一般-80 ℃保存的農(nóng)桿菌要進行1～2次活化，達到對數(shù)生長期的活力最佳。不同于大腸桿菌（Escherichia coli），質(zhì)粒在農(nóng)桿菌中的拷貝數(shù)不多，因此先挑取單菌落，再進行擴大培養(yǎng)以保證質(zhì)粒的拷貝數(shù)。理論上菌液濃度越高、侵染時間越長越有利于侵染，但濃度過高、時間過長會引起外植體受害過度而死亡。因此，要選擇合適的菌液濃度和侵染時間。在可參考的資料中，南瓜遺傳轉(zhuǎn)化菌液濃度OD600在0.1～0.8之間[35，39，41]，侵染時間5～40 min不等[35-36，41，48]。

Ti質(zhì)粒上的vir基因?qū)z傳轉(zhuǎn)化至關重要，其表達產(chǎn)物調(diào)控T-DNA的剪切、包裝、轉(zhuǎn)移和整合。因此，提高vir基因的表達有利于提高轉(zhuǎn)化效率。研究表明，溫度、pH值、糖類、酚類化合物都會影響vir基因表達[49-50]。一般農(nóng)桿菌的培養(yǎng)溫度為28 ℃，培養(yǎng)基中添加蔗糖，pH為5.2，這個條件同樣適用于南瓜[41]。

農(nóng)桿菌具有趨化性，植物傷口處分泌的酚類物質(zhì)會引誘農(nóng)桿菌向傷口移動。因此，添加酚類物質(zhì)有利于侵染，其中乙酰丁香酮因效果好而最為常用，其濃度一般為200～500 μmol·L-1[35，41]，另外菌液中添加MES緩沖液可以使農(nóng)桿菌處在適宜的pH環(huán)境下。也有學者在侵染液中添加表面活性劑，如吐溫20、Silwet L-77等[14]，表面活性劑有利于農(nóng)桿菌在外植體表面附著，可能有利于轉(zhuǎn)化。

2.4 轉(zhuǎn)化方法的影響

轉(zhuǎn)化方法是遺傳轉(zhuǎn)化的核心，以提高農(nóng)桿菌與外植體侵染互作和高效的離體再生為原則。以南瓜子葉節(jié)為受體時，子葉節(jié)的切割方法不同，轉(zhuǎn)化效率也不同。子葉節(jié)的切割應盡量使具有再生能力的細胞露于表面，以利于接觸農(nóng)桿菌。Nanasato[41]制備中國南瓜子葉節(jié)時經(jīng)過橫切和縱切，以保留子葉和下胚軸連接處的1/4子葉為外植體。張玉園[35]認為，印度南瓜子葉節(jié)橫向和縱向均一切為二，轉(zhuǎn)化效率最高。侵染前的預培養(yǎng)有利于轉(zhuǎn)化，一般認為，預培養(yǎng)過程中添加的細胞分裂素可促進細胞分裂，代謝活躍，更有利于細胞接收外源基因。預培養(yǎng)的時間不宜過長，印度南瓜子葉節(jié)預培養(yǎng)的最佳時間是36 h[39]，Nanasato[41]認為中國南瓜子葉節(jié)經(jīng)過24 h預培養(yǎng)最好。侵染過程一般采用菌液浸泡法，考慮到農(nóng)桿菌侵染傷口的特點，不少學者通過造傷來增強侵染效果，造傷的方法包括超聲波處理[51]、玻璃微珠處理[52]、刀片切割[53]和硼酸鋁晶須處理[54-55]。另外，利用真空滲透處理可以減小農(nóng)桿菌進入植物細胞的阻力[38]。大多數(shù)文獻報道造傷提高了轉(zhuǎn)化率，但造傷可能會影響外植體再生或降低外植體存活率。農(nóng)桿菌從侵染開始到T-DNA整合完成需要大約2～3 d，這也是外植體和農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)時間，24～25 ℃黑暗環(huán)境是常用的培養(yǎng)條件。共培養(yǎng)時，Nanasato等[41]采用浸濕液體培養(yǎng)基的3層濾紙代替?zhèn)鹘y(tǒng)的固體瓊脂培養(yǎng)基，在不影響轉(zhuǎn)化效率的同時降低了農(nóng)桿菌對外植體的傷害。T-DNA與基因組整合后，農(nóng)桿菌的脫除也很重要，一旦長出肉眼可見的菌落將難以控制和脫除。一般先用脫菌劑浸泡，無菌水沖洗幾遍后涂抹干燥，在培養(yǎng)基中也需要添加脫菌劑，脫菌劑有頭孢霉素、羧芐青霉素以及新型抗生素美羅培南[41]。脫菌劑及其濃度的確定以抑菌效果好、對植物影響最小為原則。農(nóng)桿菌侵染和造傷處理都會傷害外植體，所以在某些植物的遺傳轉(zhuǎn)化中，有學者在篩選前先進行恢復培養(yǎng)。筆者認為恢復培養(yǎng)可能也適用于南瓜，但恢復培養(yǎng)會增加假陽性植株，增加后期篩選的工作量。陽性植株的篩選方法取決于載體的抗性基因（如抗潮霉素、卡那霉素和除草劑基因）或報告基因（如GFP或GUS），前人采用適宜濃度的潮霉素篩選轉(zhuǎn)基因黑籽南瓜[40]，利用GFP的熒光信號篩選中國南瓜陽性植株等[41]。

3 基因槍法

基因槍法（Biolistic Bombardment）轉(zhuǎn)化植物的基本原理是高速發(fā)射包裹有重組DNA的金屬顆粒，使目的基因進入受體細胞，進而完成基因的整合和表達，獲得轉(zhuǎn)化植株?；驑尫o宿主限制，受體可以是胚、愈傷組織和細胞懸浮液等，可控度高、操作簡單。但該法獲得的轉(zhuǎn)基因后代容易出現(xiàn)突變、拷貝數(shù)多、容易發(fā)生基因沉默，還存在轉(zhuǎn)化機制不清楚、儀器昂貴等問題。基因槍法應用面不及農(nóng)桿菌介導法，在南瓜遺傳轉(zhuǎn)化上的應用也鮮有報道，李貞霞等[30]嘗試基因槍法轉(zhuǎn)化南瓜，以愈傷組織為受體，優(yōu)化了試驗條件，獲得了表達GUS基因的愈傷組織，但并未獲得轉(zhuǎn)化植株。利用基因槍法進行南瓜遺傳轉(zhuǎn)化可能需要更深入的探索。

植物遺傳轉(zhuǎn)化方法還包括真空滲入法、PEG法和電穿孔法等，這些方法在南瓜上的應用未見文獻報道。

4 存在問題與展望

高效穩(wěn)定的南瓜遺傳轉(zhuǎn)化技術依然是個世界性難題，只有保證較高的轉(zhuǎn)化效率、保證較好的重現(xiàn)性才具有實際應用價值。目前，廣泛使用的農(nóng)桿菌介導法仍存在不少困難，主要表現(xiàn)在兩個方面：（1）缺乏穩(wěn)定高效的適宜轉(zhuǎn)化的再生體系。南瓜體細胞再生效率低，器官間接再生途徑愈傷組織誘導芽困難。目前，只有以子葉節(jié)為外植體的器官直接再生途徑可用，但這種途徑獲得的再生植株存在假陽性、嵌合體、篩選困難等問題，這些都是今后需要解決的關鍵問題。筆者推測，選擇種子萌發(fā)早期（具有再生能力的細胞尚未分化）的子葉節(jié)可能有助于減少嵌合體和假陽性。（2）遺傳轉(zhuǎn)化效率低。轉(zhuǎn)化過程受多種因素影響，如南瓜基因型、外植體狀態(tài)、農(nóng)桿菌菌株及其狀態(tài)、轉(zhuǎn)化方法等，其中的關鍵因素難以尋找，破解關鍵因素是提高轉(zhuǎn)化效率的根本。外植體前處理、預培養(yǎng)、侵染方法等與遺傳轉(zhuǎn)化密切相關，也是今后應重點解決的關鍵問題。

近年來，生物技術發(fā)展迅猛，很多園藝植物通過基因工程獲得了優(yōu)異的農(nóng)藝性狀。南瓜作為葫蘆科重要蔬菜作物，深受世界人民喜愛，但遺憾的是南瓜屬作物受重視程度不高，分子生物學研究進展緩慢，遺傳轉(zhuǎn)化技術不夠成熟。遺傳轉(zhuǎn)化不僅可應用于遺傳改良，而且還是基因功能鑒定的有效途徑。在南瓜遺傳轉(zhuǎn)化技術難以突破的情況下，有學者采用瞬時轉(zhuǎn)化驗證基因功能。瞬時轉(zhuǎn)化不依賴組織培養(yǎng)，簡單快捷，如Francisco等[46]開發(fā)了一種簡便的印度南瓜瞬時轉(zhuǎn)化的方法。遺傳轉(zhuǎn)化技術在南瓜上的應用將極大地促進南瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，從1995年至今，僅有兩篇文獻報道通過遺傳轉(zhuǎn)化成功獲得了轉(zhuǎn)基因抗病毒美洲南瓜[56-57]。南瓜遺傳轉(zhuǎn)化的應用任重道遠，這需要更多的資金投入，更需要堅持不懈的努力。

參考文獻

[1]? 張?zhí)烀鳎?，王長林，等.南瓜屬4個栽培種親緣關系的AFLP分析[J].中國蔬菜，2006（1）：11-14.

[2]? YADAV M，JAIN S.Medicinal and biological potential of pumpkin：An updated review[J].Nutrition Research Reviews，2010，23（2）：184-190.

[3]? 馮春梅，莫云彬，陳海平.不同砧木嫁接對黃瓜抗病性及主要經(jīng)濟性狀的影響[J].中國農(nóng)學通報，2006，22（6）：283-284.

[4]? 樊勇，劉愛群，梁守連，等.不同砧木嫁接黃瓜產(chǎn)量與農(nóng)藝性狀的相關性分析[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學，2015（2）：33-35.

[5]? 張婧，包愛科，柴薇薇，等.農(nóng)桿菌介導的紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系研究進展[J/OL].分子植物育種，2019[2019-03-20].

[6]? SUN H，WU S，ZHANG G，et al.Karyotype stability and unbiased fractionation in the paleo-allotetraploid， Cucurbita， genomes[J].Molecular Plant，2017，10（10）：1293-1306.

[7]? ZHOU G Y，WENG J，ZENG Y S，et al. Introduction of exogenous DNA into cotton embryos[J].Methods Enzymol，1983，101（6）：433-481.

[8]? 劉寶龍，張懷剛.小麥花粉管通道法轉(zhuǎn)基因研究進展[J].分子植物育種，2004，2（4）：535-540.

[9]? 丁群星，謝友菊，戴景瑞，等.用子房注射法將Bt毒蛋白基因?qū)胗衩椎难芯縖J].中國科學（B輯 化學 生命科學 地學），1993，23（7）：707-713.

[10] ALI A，BANG S W，CHUNG S M，et al.Plant transformation via pollen tube-mediated gene transfer[J].Plant Molecular Biology Reporter，2015，33（3）：742-747.

[11] 張言朝，葛宇，于楊，等.南瓜子房注射法遺傳轉(zhuǎn)化的研究[J].中國蔬菜，2012（16）：27-31.

[12] ZHAO X，MENG Z，WANG Y，et al.Pollen magnetofection for genetic modification with magnetic nanoparticles as gene carriers[J].Nature Plants，2017，3（12）：956.

[13] VERMA S S，CHINNUSAMY V，BAMSA K C.A simplified floral dip method for transformation of Brassica napus and B. carinata[J].Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology，2008，17（2）：197-200.

[14] CLOUGH S J，BENT A F.Floral dip： a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana[J].Plant Journal，1998，16（6）：735-743.

[15] MARTINS P K，NAKAYAMA T J，RIBEIRO A P，et al.Floral-dip：a simple and rapid Agrobacterium-mediated transformation method[J].Biotechnology Reports，2015，6（6）：61-63.

[16] LI Z T，DHEKNEY S A，DUTT M，et al.An improved protocol for Agrobacterium-mediated transformation of grapevine （Vitis vinifera L.）[J].Plant Cell Tissue & Organ Culture，2008，93（3）：311-321.

[17] THIRUKKUMARAN G，NTUI V O，KHAN R S，et al.Thidiazuron： an efficient plant growth regulator for enhancing Agrobacterium-mediated transformation in Petunia hybrida[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture，2009，99（1）：109-115.

[18] 姚冉，石美麗，潘沈元，等.農(nóng)桿菌介導的植物遺傳轉(zhuǎn)化研究進展[J].生物技術進展，2011，1（4）：260-265.

[19] KOUL B，SRIVASTAVA S，AMLA D V，et al.Establishment and optimization of Agrobacterium-mediated transformation and regeneration of tomato （Solanum lycopersicum L.）[J].International Journal of Biosciences，2014，20（5）：30-39.

[20] 楊麗.建立黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化和基因編輯技術體系以創(chuàng)制黃瓜全雌系種質(zhì)材料[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2018.

[21] GONSALVES C，XUE B，GONSALVES D.Somatic embryogenesis and regeneration from cotyledon explants of six squash cultivars[J].HortScience，1995，30（6）：1295-1297.

[22] 謝冰，王秀峰，樊治成.西葫蘆未受精胚珠離體培養(yǎng)條件的優(yōu)化及胚囊植株的產(chǎn)生[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2006，39（1）：132-138.

[23] KKINTZIOS S，SERETI E，BLUCHOS P，et al.Growth regulator pretreatment improves somatic embryogenesis from leaves of squash （Cucurbita pepo L.） and melon （Cucumis melo L.）[J].Plant Cell Reports，2002，21（1）：1-8.

[24] URBANEK A，ZECHMANN B.Plant regeneration via somatic embryogenesis in styrian pumpkin： cytological and biochemical investigations[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture，2004，79（3）：329-340.

[25] DUNJA L L，MIHAELA M，VERONIKA T，et al.Hormonal and epigenetic regulation during embryogenic tissue habituation in Cucurbita pepo L.[J].Plant Cell Reports，2016，35（1）：77-89.

[26] 陳學軍，邢國明，陳竹君.西葫蘆未授粉胚珠離體培養(yǎng)和植株再生[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2000，12（3）：165-167.

[27] ANANTHAKRISHNAN G，XIA X，ELMAN C，et al.Shoot production in squash （Cucurbita pepo） by in vitro organogenesis[J].Plant Cell Reports.2003，21（8）：739-746.

[28] 趙建萍，柏新付，蔣小滿，等.培養(yǎng)因子對艾西絲南瓜芽增殖及不定根形成的影響[J].植物學通報，2000，17（1）：84-86.

[29] 鄒建，宋明，湯青林，等.觀賞南瓜子葉離體培養(yǎng)的初步研究[J].西南農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），2003，25（4）：297-299.

[30] 李貞霞，李新崢，林紫玉，等.基因槍法介導的南瓜的遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建[J].西北農(nóng)業(yè)學報，2005，14（4）：97-99.

[31] KATHIRAVAN K，VENGEDESAN G，SINGER S，et al.Adventitious regenerationin vitrooccurs across a wide spectrum of squash （Cucurbita pepo） genotypes[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture，2006，85（3）：285-295.

[32] CHENG Y，ZHANG E，ZHAO X，et al.In vitro regeneration of first-generation inbred progenies of Cucurbita pepo L. double haploids[J].Agricultural Biotechnology，2015，4（4）：10-15.

[33] LEE Y K，CHUNG W I.Plant regeneration via organogenesis in the Korean and Japanese winter squash （Cucurbita maxima Duch.）[J].Acta Horticulturae，2002（588）：299-302.

[34] LEE Y K，CHUNG W I，EZURA H.Efficient plant regeneration via organogenesis in winter squash （Cucurbita maxima Duch.）[J].Plant Science，2003，164（3）：413-418.

[35] 張玉園.南瓜子葉節(jié)離體再生體系的構(gòu)建與耐鹽StNHX1基因的轉(zhuǎn)化[D].河南新鄉(xiāng)：河南科技學院，2015.

[36] 魯曉曉.印度南瓜離體再生與遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化[D].河南新鄉(xiāng)：河南科技學院，2017.

[37] GISBERT C，PICO B，NUEZ F.Regeneration in selected Cucurbita spp. germplasm cucurbit genetics[J].Cooperative Report，2010：53-54.

[38] NANASATO Y，OKUZAKI A，TABEI Y.Improving the transformation efficiency of Cucurbita species： factors and strategy for practical application[J].Plant Biotechnology，2013，30（3）：287-294.

[39] 白婧.農(nóng)桿菌介導β-1，3-葡聚糖酶（BG2）基因轉(zhuǎn)化南瓜的研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學，2008.

[40] 李長生，趙傳志，李愛芹，等.黑籽南瓜離體再生體系與轉(zhuǎn)基因技術研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學，2009（7）：8-11.

[41] NANASATO Y，TABEI Y.Cucumber （Cucumis sativus L.） and Kabocha squash （Cucurbita moschata D.），Agrobacterium Protocols： Methods in Molecular Biology[M].New York：Springer Science Business Media，2015.

[42] SHAH P，SINGH N K，KHARE N，et al.Agrobacterium-mediated genetic transformation of summer squash （Cucurbita pepo L. cv. Australian green） with cbf-1 using a two vector system[J].Plant Cell Tissue & Organ Culture，2008，95（3）：363-371.

[43] GELVIN S B.Agrobacterium-mediated plant transformation： the biology behind the "gene-jockeying" tool[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews，2003，67（1）：16-37.

[44] KATAVI[C] V，JELASKA S，BAKRAN T，et al.Host-tissue differences in transformation of pumpkin （Cucurbita pepo L.） by Agrobacterium rhizogenes[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture，1991，24（1）：35-42.

[45] TOPPI L S，Pecchioni N，Durante M.Cucurbita pepo L. can be transformed by Agrobacterium rhizogenes[J].Plant Cell， Tissue and Organ Culture，1997，51（2）：89-93.

[46] FRANCISCO A R，BEATRIZ X，ROBERTO T，et al.A simple method for transient transformation of pumpkin （Cucurbita maxima） seedlings[J].Plant Omics，2015，8（1）：37-46.

[47] 楊柳，于翠梅，劉銘，等.農(nóng)桿菌介導大豆遺傳轉(zhuǎn)化影響因素研究進展[J].大豆科學，2018，37（5）：803-808.

[48] 付洪冰，崔崇士，趙曦，等.農(nóng)桿菌介導南瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J].植物學報，2010，45（4）：472-478.

[49] 鄒智.農(nóng)桿菌vir基因誘導因子研究進展[J].中國生物工程雜志，2011，31（7）：126-132.

[50] GELVIN S B.Traversing the cell： Agrobacterium T-DNAs journey to the host genome[J].Frontiers in Plant Science，2012（3）：52.

[51] ZARAGOZA C，MUNOZ J，ARRILLAGA I.Regeneration of herbicide-tolerant black locust transgenic plants by SAAT[J].Plant Cell Reports，2004，22（11）：832-838.

[52] LUCAS O，GALL V L，KALLERHOFF J，et al.Pectolytic enzyme treatment of sunflower explants prior to wounding and cocultivation with Agrobacterium tumefaciens，enhances efficiency of transient β-glucuronidase expression[J].Physiol Plant，1999，106（2）：232-237.

[53] AHSAN N，LEE S H，LEE D G，et al.The effects of wounding type，preculture， infection method and cocultivation temperature on the Agrobacterium-mediated gene transfer in tomatoes[J].Annals of Applied Biology，2007，151（3）：363-372.

[54] MIZUNO K，TAKAHASHI W，OHYAMA T，et al.Improvement of the aluminum borate whisker-mediated method of DNA delivery into rice callus[J].Plant Production Science，2004，7（1）：45-49.

[55] PETOLINO J F，HOPKINS N L，KOSEGI B D，et al.Whisker-mediated transformation of embryogenic callus of maize[J].Plant Cell Rep，2000，19：781-786.

[56] PANG S Z，JAN F J，TRICOLI D M，et al.Resistance to squash mosaic comovirus in transgenic squash plants expressing its coat protein genes[J].Molecular Breeding，2000，6（1）：87-93.

[57] TRICOLL D M，CARNEY K J，RUSSELL P F，et al.Field evaluation of transgenic squash containing single or multiple virus coat protein gene constructs for resistance to cucumber mosaic virus， watermelon mosaic virus 2， and zucchini yellow mosaic virus[J].Nature Biotechnology，1995，13（12）：1458-1465.