王菲菲，高山，牟德華, *

1. 河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院（石家莊 050000）；2. 河北省食品質(zhì)量與安全檢測技術(shù)創(chuàng)新中心（石家莊 051130）

山楂是一種傳統(tǒng)的藥食兩用的植物果實，主要含有碳水化合物、有機(jī)酸、果膠及豐富的活性物質(zhì)等[1-2]，其中抗壞血酸含量6%～8%[3]，是橙子的3倍，檸檬酸作為山楂中含量最多的有機(jī)酸，含量2%～3%[4]、山楂酸含量2.01%～2.67%[5]、總黃酮含量2.40%～8.96%[6-8]、多酚含量3.75%～4.23%[9-10]、果膠含量3%～4%[11]，居水果之首；有研究報道證實山楂的果實、葉子和花的提取物對心血管系統(tǒng)具有治療作用，包括心血管保護(hù)，降血壓活性，降膽固醇血癥和降血脂作用[12-14]。張明等[15]提取山楂黃酮，研究其降血脂功效，試驗結(jié)果表明山楂黃酮提取物能降低大鼠血脂中的TC、LDL含量，對TG、HDL有調(diào)節(jié)作用。陳希苗等[16]體外模擬胃腸消化中山楂多酚及抗氧化活性的變化，發(fā)現(xiàn)樣品抗氧化能力與多酚含量呈正比，并發(fā)現(xiàn)山楂游離酚是其抗氧化能力的主要貢獻(xiàn)者。

山楂中含有相當(dāng)一部分糖，李環(huán)等[17]用DNS法測得山楂片中還原糖含量約3.7%，宋迪燊等[18]用2, 4-二硝基酚分光光度法測得山楂片還原糖含量為3.66%，郭強(qiáng)[19]用間接原子吸收法測得山楂中還原糖的量約7.68%。高含量的糖限制山楂類制品在糖尿病和“三高”人群中的推廣，使得山楂制品容易受溫度、濕度、空氣、細(xì)菌等的影響而降低產(chǎn)品的貨架期，成為多種山楂食品開發(fā)瓶頸[20]。

為制備一款低糖或無糖型山楂制品，通過比較脫糖前后糖含量變化，綜合考慮山楂中特征指標(biāo)性成分[21]，如綠原酸、花青素、原花青素、表兒茶素、槲皮素等含量變化情況，擬尋找一種在盡可能保留其中特征性成分前提下效果最好的脫糖方法。

1 材料與方法

1.1 材料

干山楂片（神威藥業(yè)（石家莊）中藥飲片有限公司）。

D001、D002、D006、002CR、732樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；KDLY 16釀酒酵母、KDLY 6釀酒酵母（實驗室自篩）；諾盟、SC（法國進(jìn)口釀酒干酵母）；安琪釀酒酵母（安琪酵母（伊犁）有限公司）。

1.2 試劑

氫氧化鈉、硫酸銅、次甲基藍(lán)、甲酸試劑（均為分析純）；檸檬酸鈉（試劑級）；鹽酸（試劑級）；乙腈（色譜純）；95%乙醇（食用級）；葡萄糖氧化酶（酶活231 U/mg，上海源葉生物科技有限公司）。

1.3 儀器

LC-20 AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；光電二極管陣列紫外可見光檢測器（島津制作所）；THZ-82 A水浴恒溫振蕩器（常州榮華儀器制造有限公司）；Adventurer分析電子天平（美國奧豪斯儀器有限公司）；DEL7A320 pH計（上海展儀儀器設(shè)備有限公司）。

1.4 樣品的制備

取干山楂片，按照料液比1︰10 g/mL的比例向其中加入去離子水，在60 ℃水浴鍋中加熱煮2 h，2層濾紙過濾，得到山楂原液。

1.4.1 葡萄糖氧化酶法

參考許培振等[22]的方法，取50 mL山楂原液，用20%檸檬酸鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)體系pH 5.5，以28 U/L的量向其中加入葡萄糖氧化酶，在39 ℃水浴條件下酶解2 h，100 ℃煮沸10 min，得到葡萄糖氧化酶處理組溶液，冷卻后用去離子水定容至100 mL。

1.4.2 樹脂吸附法

活化樹脂，分別取D001，D002，D006，002CR，732型樹脂各5 g于5個錐形瓶中，用去離子水洗凈，洗至出水清澈無渾濁，無雜質(zhì)為止。用95%乙醇浸泡4 h，用去離子水洗凈，用5% NaOH溶液浸泡2 h，用去離子水洗至pH 6。用5% HCl溶液浸泡2 h，用去離子水洗至pH 6，得到活化后的樹脂。

向活化后的樹脂中分別加入50 mL山楂原液，封上保鮮膜，在室溫條件下靜態(tài)吸附12 h，混勻后過濾得到待測樣品。

參考張維科等[23]樹脂再生方法中的靜態(tài)再生法，再生液用5%的HCl溶液，按照料液比1︰5 g/mL的比例多次浸泡樹脂，每次浸泡4 h，浸泡3次以上，用去離子水沖洗至中性。

1.4.3 乙醇沉淀法

參考孫文娟等[24]的方法，準(zhǔn)確量取30 mL山楂原液，分別向其中加入乙醇體積分?jǐn)?shù)為0，40%，50%，60%，70%和80%的90 mL，在40 ℃條件下醇沉5 h，抽濾得到待測樣品。

1.4.4 發(fā)酵法

取15 g山楂3份，分別放入3個三角瓶中，向其中各加入150 mL沸水，在室溫下冷卻，冷卻至40 ℃左右，向其中加入20 U果膠酶，接入酵母菌5×106CFU/mL，在25 ℃條件下發(fā)酵6 d。

1.5 脫糖率和特征成分保留率的計算方法

采用不同方法進(jìn)行脫糖處理，檢測處理后山楂原液中的總糖、還原糖、綠原酸、花青素、原花青素、表兒茶素及槲皮素等指標(biāo)?？偺呛瓦€原糖用直接滴定法進(jìn)行測定，其他指標(biāo)用高效液相色譜法測定[25]。脫糖率和特征成分保留率按照式（1）～（3）進(jìn)行計算。

式中：s0為脫糖前山楂原液中糖含量，g/L；s1為脫糖后山楂原液中糖含量，g/L；At0為脫糖前特征成分峰面積總和；At1為脫糖后特征成分峰面積總和；A0為脫糖前特征成分單體峰面積；A1為脫糖后特征成分單體峰面積。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗所得數(shù)據(jù)由Excel 2017軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同脫糖方法總糖和還原糖的變化

圖1為不同脫糖方法對總糖和還原糖的脫除效果。葡萄糖氧化酶法的總糖和還原糖脫除率在20%～25%（圖1A）。徐雅琴[26]用葡萄糖氧化酶法脫除蛋粉中葡萄糖，其脫糖率可高達(dá)95%以上。其主要原因是蛋粉中糖的種類單一，且含糖量低，葡萄糖氧化酶作用充分[27-32]，而山楂作為水果，含有較多葡萄糖和果糖，葡萄糖氧化酶反應(yīng)時間短，對其作用效果不明顯。因此，葡萄糖氧化酶法更適用于還原糖種類單一且含量較低食品的脫糖方法。

樹脂吸附法中，總糖和還原糖脫除效果較好的樹脂是D001陽離子交換樹脂，其總糖和還原糖脫除率分別為32.63%和33.02%，所有樹脂的總糖和還原糖脫除率在15%～34%（圖1B）。樹脂吸附法對總糖的脫除效果較好，對還原糖的脫除效果差，其原因是多糖本身的大分子骨架進(jìn)入陽離子交換樹脂表面的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中難以洗脫所致[33]，而還原糖的分子結(jié)構(gòu)較小，其中含有的羥基和醛基在水溶液中不容易電離，所以不容易和陽離子交換樹脂中的H+進(jìn)行交換，導(dǎo)致還原糖的脫糖效果較差。樹脂吸附作為一種分離純化的方法，其效果受樹脂本身和被吸附物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、被吸附溶液的濃度、pH[34]、溫度等多種因素的影響，試驗中，該方法的脫糖率偏低，說明這5種樹脂均不適用于工業(yè)脫糖。

乙醇沉淀法處理后，還原糖的脫除效果始終高于總糖，其還原糖脫糖率在20%～30%，總糖脫除率在15%～20%（圖1C），80%的乙醇沉淀效果最好，其總糖和還原糖脫除率分別為21.15%和30.51%。多糖作為一種多羥基的醛或酮，溶于水形成大量的氫鍵，加入乙醇會破壞溶液中的氫鍵，降低多糖在水中的溶解度，使多糖以沉淀的方式析出。程瑩等[35]用乙醇沉淀法提取桑葉多糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)60%乙醇沉淀所得桑葉多糖產(chǎn)率最高，而40%乙醇沉淀所得桑葉多糖純度最高；殷茹等[36]采用乙醇沉淀法脫除大豆粉末磷脂中的糖，得到最佳乙醇脫糖濃度為59%，說明多糖在乙醇溶液中分級沉淀現(xiàn)象。

圖1 不同脫糖方法的脫糖效果

發(fā)酵法處理后，5種酵母菌的脫糖效果相差不大，其還原糖和總糖的脫糖率分別能達(dá)80%和90%以上（圖1D）。其中，KDLY 16的還原糖和總糖的脫糖率分別達(dá)86.66%和96.82%，為五種酵母菌中脫糖率最高。釀酒酵母在無氧條件下可消耗山楂及其提取液中的糖，發(fā)酵產(chǎn)生二氧化碳和酒精。崔淑芬等[37]用釀酒發(fā)酵法脫除木糖母液中的葡萄糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后葡萄糖脫除率達(dá)90.75%；郭小宇等[38]利用釀酒酵母L610發(fā)酵菊糖生產(chǎn)乙醇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該酵母對菊芋總糖的利用率最高可達(dá)86%，這與試驗結(jié)果類似，說明發(fā)酵法有良好脫糖效果。

2.2 主要特征性成分的總保留率

從表1中可以看出，葡萄糖氧化酶處理過后特征性成分總保留率達(dá)120.86%，其次是發(fā)酵法，其總體特征性成分的保留率能達(dá)103.95%。葡萄糖氧化酶法作用前后特征性成分在原來的基礎(chǔ)上增加20.86%，由圖2a可以看出，葡萄糖氧化酶作用后5種特征性成分中槲皮素和花青素含量增高很明顯。根據(jù)葡萄糖氧化酶的作用機(jī)理，葡萄糖氧化酶在氧化葡萄糖的過程分為2步：葡萄糖氧化酶催化葡萄糖生成葡萄糖酸內(nèi)酯，葡萄糖酸內(nèi)酯再自發(fā)降解為葡萄糖酸。降解生成的葡萄糖酸結(jié)構(gòu)中含有羰基和大量的羥基，這與所測的特征成分中槲皮素和花青素等成分的結(jié)構(gòu)相似，導(dǎo)致特征性成分的測出量偏高[29]。KDLY 16酵母菌在發(fā)酵后特征性成分在原來基礎(chǔ)上增加3.95%，山楂提取液在發(fā)酵的過程中，其中的葡萄糖、果糖等會被酵母菌利用，代謝生成一部分特征性成分[39-40]。樹脂吸附法的特征性成分保留率最高達(dá)37.49%，其原因是這些特征成分在水溶液中發(fā)生電離，與陽離子交換樹脂中的H+交換，導(dǎo)致大部分的特征成分吸附到樹脂上[41-42]。乙醇沉淀法中，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高，特征性成分保留率也在逐漸增大，在乙醇體積分?jǐn)?shù)80%時也只能達(dá)20.25%，遠(yuǎn)低于發(fā)酵法。有研究報道表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)會在一定程度上影響黃酮類成分的保留率，在乙醇沉淀的過程中，部分特征成分會隨著多糖及溶液中的雜質(zhì)一并沉淀，造成一定損失[43-44]。

表1 不同的脫糖方法處理后特征性成分的總保留率

2.3 不同脫糖方法處理后特征性成分單體的保留率

圖2 不同的脫糖方法處理后特征性成分單體的保留率

從圖2中可以看出，除了葡萄糖氧化酶法（圖2A）和發(fā)酵法以外，其他脫糖方法都會使綠原酸和花青素等特征性成分含量有所降低。樹脂吸附法處理后，5種特征性成分含量明顯降低（圖2B）。其中，D002對特征性成分中的原花青素保留率最高，達(dá)44.84%，732型陽離子交換樹脂對各種成分的保留率最低，原因可能在于不同的陽離子交換樹脂的極性不同，再加上不同特征成分本身在溶液中的電離程度不同，導(dǎo)致不同樹脂對不同特征成分的保留率有所差別。相對而言，732型陽離子交換樹脂是一種磺酸化苯乙烯系凝膠型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，它在不同溶液中都能表現(xiàn)出強(qiáng)大的離子交換功能，所以試驗中該樹脂處理過的溶液特征成分保留率偏低[45]。乙醇沉淀法中，80%乙醇處理組的槲皮素、綠原酸、花青素含量最高（圖2C），原花青素含量與60%乙醇處理組保留率無明顯區(qū)別，70%乙醇處理組的表兒茶素含量顯著高于其他濃度的乙醇處理組，達(dá)41.85%。

發(fā)酵法的特征性成分保留率較高（圖2D），KDLY 16、SC、安琪3種酵母菌發(fā)酵處理后，5種特征性成分中除槲皮素外，其他4種特征成分的保留率均在50%以上；從圖2D中可以看出，KDLY 16酵母發(fā)酵后，綠原酸、原花青素和表兒茶素的含量在原來基礎(chǔ)上有所提高；安琪酵母發(fā)酵后，綠原酸和花青素在原來基礎(chǔ)上有所提高。在發(fā)酵的過程中，酵母菌會釋放出一部分的次級代謝產(chǎn)物如乙醛、丙酮酸等，這些物質(zhì)會和黃酮類物質(zhì)反應(yīng)，生成大分子衍生物，因此導(dǎo)致部分黃酮類特征成分的含量降低[46-47]。另外，用不同菌種發(fā)酵可以得到特定產(chǎn)物，Xiao等[48]以植物乳桿菌B1-6為發(fā)酵劑發(fā)酵大豆乳清，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該發(fā)酵過程能使其中的酚酸和異黃酮苷含量在原來基礎(chǔ)上有所提高。

4種脫糖方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，如表2所示，相比較而言，發(fā)酵法最適合用于工業(yè)脫糖，其脫糖效果在80%以上，遠(yuǎn)高于其他3種方法，并且特征性成分保留率高。

表2 不同脫糖方法的優(yōu)缺點(diǎn)

3 結(jié)論

探討的4種脫糖方法還原糖和總糖的脫糖率最高，分別達(dá)86.66%和96.82%，最低為18.64%和14.42%，4種脫糖方法之間有顯著差別。與其他2種方法相比較而言，葡萄糖氧化酶法、樹脂吸附法和乙醇沉淀法的脫糖率偏低，樹脂吸附法和乙醇沉淀法會使特征性成分損失較多，不利于在工業(yè)生產(chǎn)中大規(guī)模應(yīng)用。盡管葡萄糖氧化酶法對特征性成分的含量不會造成太大的影響，但由于其脫糖效果不明顯，也不利于在工業(yè)上使用。發(fā)酵法由于其脫糖率較高，特征性成分的保留率高等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)脫糖的應(yīng)用上具有很大優(yōu)勢。

山楂中的黃酮和多酚類化合物具有改善心血管系統(tǒng)、降低血壓、降低血脂、促進(jìn)消化、養(yǎng)胃保肝、防止氧化，并對細(xì)菌、病毒和腫瘤都有一定抑制作用[6,49-50]，這些作用的發(fā)揮離不開山楂中一些特征性成分。通過對比不同脫糖方法，找到一種脫糖效果好，同時特征性成分保留率高的方法。使用該方法可有效脫除山楂制品中的糖類物質(zhì)，拓寬山楂制品的可食用人群，實現(xiàn)山楂制品的多種加工方式，為山楂制品的開發(fā)提供理論依據(jù)。