KANG BO KYOUNG 陳維明 周廣東 曹德君

外傷、腫瘤、炎癥等造成的軟骨病變和缺損臨床較為常見，且軟骨無血管神經(jīng)，損傷后極難自我修復[1]，嚴重影響患者的身心健康。目前，軟骨缺損可通過軟骨組織移植、軟骨細胞或間充質(zhì)干細胞移植、生物材料填充等方法進行修復重建[2]，但這些方法均存在一定的局限性，如自體軟骨來源有限，異體軟骨排斥反應，人工材料外露等。因此，軟骨缺損修復和功能重建仍是外科治療的難題[2]。近年來，快速發(fā)展的組織工程技術(shù)為解決上述難題提供了新的方向。組織工程技術(shù)主要包括種子細胞、支架材料、細胞因子等要素。自體軟骨細胞是目前軟骨再生的重要種子細胞來源，但由于自體軟骨細胞來源有限，取材創(chuàng)傷大，體外擴增后易老化和去分化，喪失軟骨再生能力，很難在臨床上推廣應用。

因此，增殖能力強又具有多向分化潛能的干細胞成為研究熱點。BMSC具有取材方便、創(chuàng)傷相對小、可重復取材、增殖能力旺盛、軟骨再生能力強等優(yōu)勢，使其成為軟骨再生的理想種子細胞[3-4]。但BMSC體外構(gòu)建的軟骨在皮下環(huán)境易發(fā)生骨化，最終導致軟骨再生失敗[5]。我們的前期研究證實，軟骨細胞體外構(gòu)建的軟骨植入皮下后可形成穩(wěn)定的軟骨，很少骨化，主要是因為軟骨細胞本身可以分泌血管抑制因子[6]。但是，利用BMSC體外構(gòu)建的軟骨植入皮下后，很容易發(fā)生血管侵入和基質(zhì)鈣鹽沉積，不能形成穩(wěn)定的軟骨組織。因此，BMSC再生軟骨皮下異位骨化很可能與抗血管化因子不足以抵抗皮下環(huán)境中的促血管化因子有關(guān)。因此，尋找對抗促血管化因素的方法，可能是克服BMSC體外構(gòu)建軟骨異位骨化的關(guān)鍵[7-9]。

姜黃素具有抗腫瘤血管生成的作用[10]，主要是通過作用于血管內(nèi)皮生長因子及其受體而抑制血管的生成。研究表明，姜黃素可明顯抑制艾氏腹水癌細胞在荷瘤小鼠體內(nèi)形成的實體腫瘤的血管形成，說明姜黃素是一種特異性血管生成抑制劑[10-16]。因此，本研究擬探討負載姜黃素的支架材料能否通過抑制血管化而調(diào)控軟骨再生，希望為BMSC構(gòu)建軟骨組織的臨床應用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新西蘭大白兔5只(甲干生物有限公司)，雌雄不限，體質(zhì)量4～5 Kg；BALB/c裸鼠(中科院動物所)30只，雌雄不限。上海白山羊 1只(甲干生物有限公司)。

1.2 實驗材料

姜黃素(百靈威科技有限公司)，人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells，hUVEC)(上海歌凡生物科技有限公司)，低糖 DMEM 培養(yǎng)基、高糖 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、0.05%胰蛋白酶-EDTA消化液(Hyclone，美國)，青霉素、鏈霉素混合液(Gibco，美國)，Ⅱ型膠原酶(Gibco，美國)，明膠 (阿拉丁試劑有限公司)。

1.3 細胞來源與擴增

1.3.1hUVEC

鏡下觀察hUVEC生長情況，當細胞融匯至80%左右，置于37 ℃培養(yǎng)箱預溫3 h后，0.05%胰酶-EDTA消化傳代。1 000 r/min離心5 min，重懸細胞。更換新的細胞培養(yǎng)瓶，加入含15% FBS的低糖DMEM，按1∶3分裝至3個培養(yǎng)皿中， 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞生長至培養(yǎng)皿底面80%～85%時使用。

1.3.2羊BMSC

無菌抽取羊的髂骨骨髓，加入骨髓體積1∶1～2∶1的無血清培養(yǎng)基。1 800 r/min離心8 min，棄去1/2的培養(yǎng)液，再加入無血清低糖DMEM培養(yǎng)基15～30 mL。1 800 r/min 離心8 min，棄去2/3的培養(yǎng)基。移入新的離心管，加入含15%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基。調(diào)節(jié)細胞濃度至1×108cells/L，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。原代培養(yǎng)72 h后首次半量換液，以后每3天換液1次。當細胞生長至培養(yǎng)皿底面80%～85%時，0.05%胰蛋白酶-EDTA消化傳代。1 500 r/min離心8 min，再加入含15% FBS的低糖DMEM，按1∶3分裝至3個培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。本實驗所用細胞均為第2代BMSC。

1.3.3兔耳軟骨細胞的分離與培養(yǎng)

無菌剪取單側(cè)兔耳上1/3，去除周圍的軟組織，將耳軟骨切成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入5倍體積的0.25% Ⅱ型膠原酶，搖床消化過夜；75 μm孔徑濾網(wǎng)過濾，1 500 r/min離心5 min，PBS漂洗2遍，以含10%FBS的高糖DMEM配制成細胞懸液，按2×106個/皿(直徑10 cm培養(yǎng)皿)接種細胞，置入5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞達90%融合時進行傳代。本實驗所用細胞均為第2代軟骨細胞[1]。

1.4 姜黃素儲備液的配制

標準品配制：姜黃素分子量為368.38 g/mol。將姜黃素溶解于完全避光的DMSO中，配制成濃度10 mmol/L的姜黃素儲備液，此液體可在4 ℃下保存2周。進行測試時，需要配置不同濃度的應用液,以姜黃素儲備液進行稀釋, 現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.5 不同濃度的姜黃素溶液與細胞劃痕實驗

按照姜黃素分子量配制3個不同濃度的姜黃素溶液：30 μmol/L、40 μmol/L、50 μmol/L；6孔板上接種hUVEC，細胞濃度均為2×105cells/mL(n=3)；另一6孔板接種BMSC，細胞濃度均為2×105cells/mL(n=3)；37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，細胞必須長滿(100%)；待細胞長滿后，用槍頭比著直尺(高壓滅菌的鋼尺)，垂至于背后的橫線劃痕，劃1道(槍頭必須要垂直，不能傾斜)；用PBS洗1～2次，去除劃下的細胞；對照組孔里加無血清培養(yǎng)基，實驗組孔里加不同濃度的姜黃素溶液；0 h、6 h、12 h、24 h和48 h后取樣本拍照，并統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.6 負載姜黃素支架材料的制備

將1.5 g明膠置入含有100 mL去離子水中，60 ℃水浴加熱，不斷攪拌至明膠溶解；將溶解的明膠溶液倒入48孔板中，放入-20 ℃冰箱冷凍24 h，再放入真空冷凍干燥箱中48 h，將樣品完全干燥；將0.5 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和0.3 g N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶解于95%乙醇中，配置EDC/NHS化學交聯(lián)液；將支架放入上述交聯(lián)液中交聯(lián)12 h；然后用去離子水多次沖洗，去除交聯(lián)劑，得到明膠支架，設(shè)為對照組；配置姜黃素溶液：將2 mg姜黃素溶于無水乙醇中(含5%冰醋酸)，將明膠支架置于姜黃素溶液中2 h，去離子水沖洗，得到負載姜黃素支架，設(shè)為實驗組。將兩組支架再次放入-20 ℃的冰箱中冷凍24 h、真空冷凍干燥箱中干燥48 h至樣品完全干燥。將支架材料切成直徑9 mm、厚度約 2 mm的圓片備用。

1.7 掃描電鏡觀察

將明膠支架(對照組)和負載姜黃素支架(實驗組)用剪刀剪切成小片(半圓形，直徑5 mm)，導電膠固定，噴金，黏托，掃描電鏡觀察兩組材料的微觀結(jié)構(gòu)[2]。每個試樣取3個平行樣品。

1.8 細胞-材料復合物的制備

將直徑9 mm、厚度約2 mm的圓片(對照組為明膠支架，實驗組為負載姜黃素支架)在真空冷凍干燥機進行過夜冷凍干燥滅菌處理，再紫外線照射15 min(波長240 nm，能量30 W)；將第 2代軟骨細胞用高糖DMEM培養(yǎng)液制備成5×107cells/mL濃度的細胞懸液；兩組材料各加入130 μL細胞懸液，然后將構(gòu)建的細胞-材料復合物放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，然后慢慢加入含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液覆蓋復合物，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。體外培養(yǎng)1周后，將復合物植入裸鼠皮下。

1.9 組織學檢測

1.9.1單純材料支架

將負載姜黃素支架材料與明膠支架分別植入裸鼠皮下，3、6周后取材，行組織學檢測(HE、番紅O-固綠染色)。

1.9.2細胞-材料復合物

兩組細胞-材料復合物體外培養(yǎng)1周后，分別植入BALB/c裸鼠背部皮下左右兩側(cè)。3、6周后取出，行HE、番紅O-固綠、Ⅱ型膠原免疫組化檢測。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)

2.1.1hUVEC

細胞貼壁第1天，達到80%～85%融合，hUVEC均呈典型的漩渦狀生長，細胞呈多角形、短粗的梭形，細胞增殖力和活力佳(圖1)。

圖1 人臍靜脈內(nèi)皮細胞(標尺：50 μm)

2.1.2BMSC

原代BMSC貼壁后第5天，慢慢開始出現(xiàn)克隆性增長表現(xiàn)。在顯微鏡下觀察到透亮的貼壁和未貼壁的細胞，傳代后，高倍鏡下可見BMSC大多呈梭形或者多角形(圖2)。

圖2 第1代羊BMSC(標尺：50 μm)

2.2 細胞劃痕實驗

hUVEC細胞劃痕實驗結(jié)果顯示：姜黃素濃度為30 μmol/L，12 h開始出現(xiàn)hUVEC細胞凋亡現(xiàn)象。BMSC細胞劃痕實驗結(jié)果顯示：姜黃素濃度在40 μmol/L以下時，未觀察到BMSC出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。說明姜黃素濃度在40 μmol/L以下不會影響B(tài)MSC的生長。

因此，姜黃素的最佳濃度范圍為30～40 μmol/L，既可抑制hUVEC生長又不影響B(tài)MSC增殖(圖3、4)。

圖4 BMSC細胞劃痕實驗(標尺：100 μm)

2.3 支架材料大體觀察、掃描電鏡觀察

大體觀察顯示，對照組呈白色，實驗組呈黃色，此外兩組并無明顯不同。掃描電鏡觀察顯示，兩組支架材料均分布均勻，具有一定孔隙率，無顆粒狀物質(zhì)附著(圖5)。

2.5 支架材料皮下植入后大體觀察

對照組和實驗組支架材料皮下植入3、6周后，大體觀察顯示，對照組有明顯的血管化現(xiàn)象，而實驗組周圍血管化受到明顯抑制，提示姜黃素具有明顯的血管抑制作用(圖6)。

圖6 支架材料皮下植入后大體觀察

2.6 支架材料皮下植入后組織學觀察

體內(nèi)培養(yǎng)3周后取材，HE、番紅-固綠染色顯示，兩組樣本均有部分被吸收，對照組可觀察到明顯的血管分布，實驗組未觀察到明顯的血管分布。體內(nèi)培養(yǎng)6周后取材，對照組被吸收的程度比實驗組更明顯，實驗組未觀察到明顯血管分布(圖7、8)。

圖7 支架材料皮下植入3周后組織學觀察(標尺：500 μm)

圖8 支架材料皮下植入6周后組織學觀察(標尺：500 μm)

2.7 細胞-材料復合物體內(nèi)構(gòu)建的大體觀察

大體觀察顯示對照組有大部分區(qū)域呈現(xiàn)明顯的紅色外觀，實驗組呈瓷白色的軟骨樣外觀，未見明顯紅色樣改變。實驗組和對照組外觀均一，未見明顯的大小變化(圖9)。

2.8 細胞-材料復合物體內(nèi)構(gòu)建的組織學觀察

組織學觀察顯示，細胞-材料復合物體內(nèi)構(gòu)建3、6周，兩組細胞-材料復合物均有軟骨陷窩形成。體內(nèi)培養(yǎng)3周，實驗組軟骨陷窩形成較對照組更為明顯(圖10)；體內(nèi)培養(yǎng)6周，兩組均有成熟的軟骨陷窩形成，兩組未見明顯差異，提示負載姜黃素未對皮下環(huán)境的軟骨再生產(chǎn)生明顯的不良影響(圖11)。

圖10 細胞-材料復合物皮下植入3周后組織學觀察(標尺：500 μm)

圖11 細胞-材料復合物皮下植入6周后組織學觀察(標尺：200 μm)

3 討論

目前BMSC體外構(gòu)建軟骨在皮下環(huán)境中異位骨化是公認的難題，一般認為異位骨化主要與血管化有關(guān)，因此解決該難題的關(guān)鍵就是抑制血管化。姜黃素具有抗腫瘤血管生成作用，可通過抑制血管內(nèi)皮生長因子及其受體而抑制荷瘤小鼠艾氏腹水癌細胞形成的實體腫瘤的血管形成，說明姜黃素是一種特異性血管生成抑制劑[10-16]。

使用軟骨細胞體外構(gòu)建的軟骨樣組織植入皮下后可以形成穩(wěn)定的軟骨，很少發(fā)生骨化，但是利用BMSC體外構(gòu)建的軟骨植入皮下后卻很容易發(fā)生血管侵入和基質(zhì)鈣鹽沉積，不能形成穩(wěn)定的軟骨組織。皮下環(huán)境不利于BMSC誘導的軟骨生長，而且單純BMSC誘導的軟骨植入皮下后產(chǎn)生的抗血管化因子不足以抵抗皮下環(huán)境中的促血管化因子，造成失衡。

本研究設(shè)置不同濃度的姜黃素溶液，細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，姜黃素濃度為30 μmol/L時，12 h即出現(xiàn)hUVEC細胞凋亡，而姜黃素濃度在40 μmol/L以下時未觀察到BMSC細胞凋亡，說明姜黃素合適的濃度范圍為30～40 μmol/L，是既可抑制hUVEC生長又不影響B(tài)MSC增殖的最佳濃度范圍。

對照組和實驗組材料分別植入裸鼠皮下后，結(jié)果顯示，兩組支架材料分布比較均勻，具有一定孔隙率，無顆粒狀物質(zhì)附著。這說明姜黃素能夠很好地溶解于明膠材料中，并未存留不溶物，且不影響明膠材料的微觀結(jié)構(gòu)。組織學觀察顯示實驗組呈現(xiàn)了明顯的血管抑制現(xiàn)象。這對于后期進一步研究姜黃素通過抑制血管化來調(diào)控干細胞的異位骨化至關(guān)重要。

另外，組織學觀察顯示，體內(nèi)植入3周、6周后，兩組細胞-材料復合物均有軟骨陷窩形成，未見明顯差異，提示負載姜黃素后未對皮下環(huán)境的軟骨再生產(chǎn)生明顯的不良影響。

本研究表明，抗血管化藥物姜黃素對軟骨細胞生長無害，不引起炎癥反應，對軟骨細胞無明顯破壞。本研究結(jié)果對于今后應用姜黃素參與以BMSC為種子細胞構(gòu)建組織工程軟骨提供了依據(jù)。