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(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古包頭 014109;2.內(nèi)蒙古賽學(xué)教育信息咨詢有限公司,內(nèi)蒙古呼和浩特 010010)

番茄晚疫病原菌是由致病疫霉(Phytophthorainfestans)所引起的主要番茄病害之一[1]。這種植物病害對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)存在嚴重威脅[2],報道指出由該病引起的番茄減產(chǎn),每年能夠達到20%～30%,嚴重時達到50%～80%,甚至絕收[3-4]。目前主要采用農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)藥物來控制病害發(fā)生,但是為了提高番茄產(chǎn)量,從發(fā)病初期就開始使用各種化學(xué)藥物[5],這些化學(xué)藥劑的不科學(xué)使用,對人體健康有一定的不利影響,甚至出現(xiàn)致癌、致畸和致突變等情況[6]。目前也有研究顯示,使用轉(zhuǎn)基因抗病機制可防治番茄晚疫病發(fā)生[7],但轉(zhuǎn)基因危害不確定性使其在我國推廣存在一定難度[8]。綠色農(nóng)業(yè)需求的不斷擴張,使包括植物源殺菌在內(nèi)的生物農(nóng)藥以其易降解、環(huán)境污染小、不易產(chǎn)生抗性、來源廣泛、對人畜安全性高等優(yōu)點逐漸成為研究熱點[9-11]。

耿昕穎等[12]研究發(fā)現(xiàn)五倍子含有鞣質(zhì)、黃酮、蒽醌、沒食子酸等有效成分,具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎、抑菌、抗機體氧化等多種生物學(xué)功能。五倍子鞣質(zhì)對白假絲酵母有很強的抑菌作用,通過改變其細胞形態(tài)結(jié)構(gòu),促使細胞死亡,對口腔、胃腸道的感染具有一定的預(yù)防作用[13-14]。李敏[15]發(fā)現(xiàn)五倍子提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等7種常見的菌都有抑菌效果,尤其對革蘭氏陽性菌的抑菌效果明顯,但是未確定起主要抑菌效果的成分。我國五倍子資源豐富,為了充分利用五倍子資源及開發(fā)無污染的植物抗菌劑,本文研究了以市售的五倍子干燥果實為研究對象,對五倍子水提物的活性物質(zhì)提取分離及鑒定,再對番茄晚疫病病原菌進行了抑菌機理初步分析,為探索新型植物源農(nóng)藥提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

五倍子 呼和浩特市京遠大藥房,干燥成熟的果實;番茄晚疫病原菌 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品微生物實驗室提供;PDA培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)公司;戊二醛 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

LDZX-40型立式電蒸汽壓力滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;RE-52AAA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海嘉鵬科技有限公司;TGL-16G-A型離心機 上海暗亭儀器廠;FD-3型真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)實驗儀器有限公司;500兆超導(dǎo)核磁波譜儀 德國BRUKER公司;LEO1430VP型掃描電鏡 日本電子有限公司;JEM100CX型透射電鏡 日本電子有限公司;DDS-11A型數(shù)顯電導(dǎo)率儀 上海雷磁新徑儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 五倍子活性物質(zhì)提取、分離與結(jié)構(gòu)鑒定

1.2.1.1 五倍子粗提液 采用宋琳琳等[16]的最佳提取條件,取一定量的五倍子用中藥粉碎機粉碎,過60目篩。稱取200 g五倍子粉末,以水為溶劑,固液比為1∶25 W/V,在90 ℃下浸提3 h,浸提3次,合并濾液,經(jīng)3000 r/min離心15 min,取上清液在50 ℃下真空濃縮,用水定容到100 mL,放于4 ℃冰箱備用。

1.2.1.2 醇沉實驗 取1.2.1.1得到的五倍子粗提液100 mL于三角瓶中,再加入等體積的無水乙醇,使乙醇濃度為50%,用磁力攪拌器攪拌1 h,繼續(xù)加入無水乙醇調(diào)至乙醇濃度為65%,用磁力攪拌器攪拌1 h,繼續(xù)添加無水乙醇至濃度為80%,用磁力攪拌器攪拌1 h。避光靜止14 h后離心(3000 r/min、15 min),分離沉淀與上清液,在溫度為-80 ℃、壓強為30 kPa的條件下冷凍干燥3 d后得到醇沉物和醇溶物的凍干粉。然后分別取1 g凍干粉,溶于5 mL蒸餾水中,采用濾紙片法[17]做抑菌試驗。

1.2.1.3 萃取實驗 將1.2.1.2中抑菌效果好的凍干粉100 g溶解于200 mL蒸餾水中,再參照宋琳琳等[16]法進行五倍子抑菌活性物質(zhì)的萃取分離,得到石油醚萃取相、三氯甲烷萃取相、乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相及水相,再用濾紙片法測定各萃取相的抑菌圈大小并進行比較,得出具有最佳抑菌萃取相。

1.2.1.4 抑菌活性物質(zhì)分離 參照鄭署明等[18]的方法,稍作改動。將1.2.1.3中的最佳抑菌萃取相真空冷凍干燥成粉末,取5 g干燥物進行硅膠(100～200目)柱層層析,首先以氯仿洗脫直至出現(xiàn)液體,再按氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇體積比為100∶1∶1、80∶1∶1、60∶1∶1、40∶1∶1、20∶1∶1、10∶1∶1、1∶1∶1、1∶10∶2、1∶10∶4、1∶10∶6、1∶10∶8、1∶10∶10梯度洗脫,每組洗脫劑用量為200 mL,流速為1 mL/min,最后用200 mL甲醇洗脫,用自動收集儀每1 min收集一管流分,根據(jù)顏色變化共收集到27個流分,進行薄層層析,將Rf值相近的流分進行合并,得到六個流分,分別編號1～6號流分,把各流分進行真空濃縮(條件為65 ℃,濃縮至10 mL),再溫度為-80 ℃、壓強為30 kPa的條件下冷凍干燥3 d后得到粉末。然后用水溶解各個流分,濃度為0.2 g/mL,用濾紙片法比較各流分的抑菌圈直徑,篩選出最佳抑菌流分并進行二次柱層析分離純化,流動相采用氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇,體積比為10∶1∶1、9∶1∶1、8∶1∶1、7∶1∶1、6∶1∶1、5∶1∶1、4∶1∶1、3∶1∶1、2∶1∶1、1∶2∶1、1∶3∶1、1∶3∶1、1∶3∶2、1∶3∶3、1∶3∶4、1∶3∶5、1∶3∶6、1∶3∶7、1∶3∶8、1∶3∶9、1∶3∶10梯度洗脫,每組洗脫劑用量為200 mL,流速為1 mL/min,用自動收集儀每1 min收集一管流分,最終以甲醇洗脫。根據(jù)顏色變化共收集到16個流分,進行薄層層析,將Rf值相近的流分合并,得到4個流分,分別編號7～10號流分。將各流分進行真空濃縮(條件為65 ℃,濃縮至10 mL),再在溫度為-80 ℃、壓強為30 kPa的條件下冷凍干燥3 d后得到晶體,并調(diào)制成濃度為0.2 g/mL的流分液,進行抑菌試驗,得出最佳抑菌流分。

1.2.1.5 結(jié)構(gòu)鑒定 將1.2.1.4得到的最佳抑菌流分進行真空冷凍干燥,干燥物用甲醇溶解,溶液澄清透明,流動性很好,無氣泡,滿足結(jié)構(gòu)鑒定的要求,本實驗采用500 M超導(dǎo)核磁波譜儀進行單體結(jié)構(gòu)鑒定。

1.2.2 作用機制初步分析

1.2.2.1 掃描電鏡觀察 參照王慧[19]的方法,稍作改動。將1.2.1.4確定的單體物質(zhì)(鞣酸)晶體加入到孢子懸液中,使其濃度為0.2 g/mL,處理6 h后離心(3000 r/min、15 min)得到處理組菌體,以未加單體物質(zhì)(鞣酸)晶體的孢子懸液為對照,分別加入2.5%戊二醛室溫固定4 h后PBS緩沖液漂洗3次,再用1%鋨酸固定6 h用PBS緩沖液漂洗3次。將固定好的菌泥用乙醇(乙醇濃度分別為30%、50%、70%、85%、95%)梯度洗脫各一次,100%乙醇洗脫2次,每次20 min。然后用乙酸異戊酯置換2次,每次20 min,然后結(jié)晶用真空管鍍膜儀抽低真空干燥,噴碳鍍膜,在掃描電鏡下觀察。

1.2.2.2 透射電鏡觀察 參照周立琴等[20]的方法,稍作改動。將1.2.1.4確定的單體物質(zhì)(鞣酸)晶體加入菌懸液,使其濃度為0.2 g/mL,處理6 h后離心(3000 r/min、15 min)得到處理組菌體,以未用抑菌單體處理的菌體為對照組,分別加入2.5%戊二醛室溫固定4 h后PBS緩沖液漂洗3次,3000 r/min下離心15 min),濾渣用1%鋨酸固定6 h用PBS緩沖液漂洗3次,3000 r/min下離心15 min),棄去上清液,將固定好的菌泥用叔丁醇(叔丁醇濃度分別為30%、50%、70%、85%、95%)梯度洗脫各一次,100%叔丁醇洗脫2次,每次20 min。然后用乙酸異戊酯置換2次,每次20 min。然后用Epon818樹脂包埋固化切片。再用3%醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色,透射電鏡觀察。

1.2.2.3 對番茄晚疫病原菌細胞膜通透性的影響 取1.2.1.4確定的單體物質(zhì)(鞣酸)梯度稀釋。方法為:取15 mL鞣酸溶液濃度梯度,分別加入15 mL PDB培養(yǎng)基,使其終濃度分別為125、62.5、31.2、15.6、7.8、0 mg/mL,再分別加入20 μL番茄晚疫病原菌孢子懸液,在28 ℃的培養(yǎng)箱(150 r/min)中培養(yǎng),分別培養(yǎng)0、1、2、4、8、16 h后取5 mL離心(3000 r/min、15 min),取上清液1 mL加入19 mL超純水,備用。用電導(dǎo)率測定儀測各組電導(dǎo)率。每組試驗做三組平行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)用Excel 2010和SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析和作圖。實驗均重復(fù)三次,以平均值(mean)±標準偏差(standard deviation)來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 醇沉實驗及萃取實驗結(jié)果

通過上述1.2.1.2的方法對五倍子粗提液進行醇沉實驗,得出濃度為0.2 g/mL的醇沉物與醇溶物的抑菌圈直徑分別為(13.8±0.4)、(26.6±0.3) mm,以無水乙醇為空白實驗,得到抑菌圈直徑為(8±0.3) mm。醇溶物抗菌能力顯著(P<0.05)高于醇沉物,這與關(guān)健等[21]文中提到的五倍子醇提液中鞣質(zhì)含量能達6.43%是一致的,因此可斷定五倍子中主要抗番茄晚疫病原菌的物質(zhì)為醇溶性物質(zhì)。將醇溶性物質(zhì)進一步萃取分離,其抑菌結(jié)果如圖1,石油醚萃取相不具有抑菌性,三氯甲烷萃取相、乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相、水相抑菌圈直徑分別為(15.5±0.6)、(33.9±0.4)、(16.6±0.7)、(9.2±0.5) mm。乙酸乙酯萃取相的抗菌效果顯著(P<0.05)高于其它各相。因此醇溶物中主要抑菌物質(zhì)存在與乙酸乙酯萃取相。

圖1 萃取物對提取液抑菌效果的影響Fig.1 Effects of extractant on antifungal substances

2.2 抑菌成分分離

對乙酸乙酯萃取相作為待測的樣品,進行柱層析,并得到六個流分,分別編號1、2、3、4、5、6,對六個流分進行抑菌試驗,結(jié)果如圖2。各流分抑菌圈直徑差異顯著(P<0.05),其中5號流分抗菌能力最強,抑菌圈直徑達到(36±0.2) mm,6號流分不具有抑菌能力,1、2、3、4各組流分抑菌圈直徑均不足(20±0.3) mm。因此認為最佳抑菌成分存在于5號流分中。將5號流分進一步柱層色譜分離純化,得到4種流分分別編號7、8、9、10。對四個流分進行抑菌實驗,結(jié)果如圖2。其中9號流分抑菌能力顯著(P<0.05)高于其它,抑菌圈直徑為(37.3±0.2) mm。

圖2 各流分對提取液抑菌效果Fig.2 Effects of flowing of parts on antifungal substances

2.3 結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

9號流分重結(jié)晶后為單一晶體,將9號結(jié)晶用甲醇溶解,采用500 M超導(dǎo)核磁波譜儀進行結(jié)構(gòu)鑒定,結(jié)果如圖3和圖4。核磁共振是物理檢測方法,它提供的是分子中有關(guān)氫及碳原子的類型、數(shù)目、互相連接方式等信息。氫核磁共振(1H-NMR)信號峰是氫在外加磁場中吸收不同頻率電磁波后產(chǎn)生的共振吸收峰。主要參數(shù)包括:化學(xué)位移,質(zhì)子數(shù);偶合常數(shù)(J)等。根據(jù)俞文勝[22]等的研究可知,碳原子是形成大多數(shù)中藥化學(xué)成分的基本物質(zhì),13C-NMR可以提供碳原子的信息,從而能確定該化合物的基本構(gòu)架。

圖3 9號流分的核磁共振氫譜Fig.3 The extraction of 9 1H-NMR

圖4 9號流分的核磁共振碳譜Fig.4 The extraction of 9 13C-NMR

根據(jù)圖3和圖4可確定出該物質(zhì)是分子式為C11H32O26的五個沒食子?；耙粋€β型吡喃葡萄糖殘基。1H-NMR(500 MHz,Solvent)ppm:6.97,7.00,7.05,7.08,7.14(各2H,S,沒食子酰基氫)。β型吡喃葡萄糖殘基的1H-NMR ppm:6.28(1H,d,J=8.4),5.62(2H,d,J=8.4,9.5),6.01(3H,t,J=9.5),5.66(4H,d,J=9.5),4.57(6H,d,J=1.7,12.8)。13C-NMR(125 MHz,Solvent)ppm:119.6(C-1′),138.9(C-1′),β型吡喃葡萄糖殘基的13C-NMR ppm:C-1:93.4(S),C-2:71.8(S),C-3:73.4(S),C-4:69.5(S),C-5:74(S),C-6:63.1(S)。波普數(shù)據(jù)經(jīng)與標準圖譜[23]圖5對比后可確定此單體為鞣酸。

圖5 中華藥典中鞣酸的結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Tannic acid’s structural formula

2.4 抗菌機理的初步分析結(jié)果

2.4.1 掃描電鏡觀察結(jié)果 從圖6的掃描電鏡結(jié)果可看出,未經(jīng)藥液處理的菌體飽滿且表面光滑層次分明,細胞壁與細胞膜均處于完整狀態(tài);經(jīng)上述分離純化的鞣酸處理后,菌體出現(xiàn)表面被嚴重破壞,細胞壁破損,凹陷,出現(xiàn)了斷裂現(xiàn)象,造成細胞質(zhì)外泄,菌體的嚴重破壞導(dǎo)致細胞不具有了傳代能力。

圖6 鞣酸處理前后的掃描電鏡圖Fig.6 SEM of tomato late blight fungal by tannic acid

圖7 鞣酸處理前后的透射電鏡圖Fig.7 TEM of tomato late blight fungal by tannic acid

2.4.2 透射電鏡觀察結(jié)果 從圖7的透射電鏡結(jié)果可看出,未經(jīng)鞣酸處理的照組菌體狀態(tài),細胞體完整,表面輪廓明顯清晰細胞質(zhì)均勻,細胞內(nèi)核飽滿;經(jīng)過鞣酸處理后菌體輪廓出現(xiàn)模糊狀態(tài),表面有小孔出現(xiàn),細胞內(nèi)容物出現(xiàn)皺縮及外泄現(xiàn)象,看不出完整結(jié)構(gòu)體。

2.4.3 對番茄晚疫病原菌細胞膜通透性的影響結(jié)果 細胞膜作為細胞的自然屏障,必須保持一定的穩(wěn)定狀態(tài)才能生存,當遭受到外界一定干擾刺激時,細胞膜通過改變其通透性來維持這種穩(wěn)定,當刺激超過細胞膜自身耐受性時,細胞膜會遭到嚴重破壞導(dǎo)致細胞質(zhì)大量外流,細胞遭到刺激后,細胞膜通透性改變使得細胞內(nèi)電解質(zhì)釋放進入胞外溶液,通過測定胞外溶液電導(dǎo)率的變化狀況,可判斷藥劑處理后細胞通透性的改變狀況[24-25],孢子懸液的電導(dǎo)率變化越快,表示電解質(zhì)穿過細胞膜的速度越快,細胞膜通透性越大,電導(dǎo)率變化越大,表明細胞受到的干擾與刺激越大[26-27]。

由圖8可看出,鞣酸濃度越大細胞通透性越大。鞣酸濃度為15.6 mg/mL時,1 h后電導(dǎo)率不再有顯著改變,趨于穩(wěn)定,即1 h后鞣酸對細胞通透性的破壞不再擴大,趨于穩(wěn)定;當濃度為31.2 mg/mL時,電導(dǎo)率在1～2 h穩(wěn)定不變,2 h后出現(xiàn)增長,即隨著時間的增長在2 h后細胞膜出現(xiàn)了更大的破壞;當鞣酸濃度為62.5 mg/mL時電導(dǎo)率2 h后趨于穩(wěn)定;當鞣酸濃度達到125 mg/mL時電導(dǎo)率改變速度較快且較大,表明受到刺激與破壞較大。綜上所述,五倍子提取物中的主要成分鞣酸能有效破壞菌絲體細胞膜的通透性,電解質(zhì)大量滲透而使菌體死亡,且濃度達到125 mg/mL時破壞力更強。

圖8 五倍子鞣酸對蕃茄晚疫病菌細胞膜透性的影響Fig.8 Effect of extraction Galla chinensis on themembrane permeability of tomato late blight

3 結(jié)論

綜合實驗結(jié)果可以看出五倍子具有抑番茄晚疫病病原菌的潛在能力。五倍子粗提液醇提萃取后,再經(jīng)柱層色譜分析得出餾分9具有較強抗菌能力,通過核磁共振檢驗出餾分9為鞣酸單體。對五倍子鞣酸進一步抗菌機理的初步研究時,通過掃描電鏡與透射電鏡觀察得出五倍子鞣酸處理使得細胞表面出現(xiàn)凹陷,細胞邊緣輪廓清晰性下降,細胞內(nèi)核皺縮顯著,能夠?qū)毎Y(jié)構(gòu)造成了一定破壞。五倍子鞣酸能夠改變番茄晚疫病病原菌的細胞膜通透性從而起到抑菌效果,并且隨著鞣酸濃度的增大,細胞膜通透性改變不斷加大。五倍子主要抑菌物質(zhì)的初步分析進一步推進了五倍子作為生物防治手段用于抑治番茄晚疫病發(fā)生的可能。