,3,4,5,3,4,5,3,4,5,*

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,福建廈門 361021;2.廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系,福建廈門 361023;3.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門 361021;4.廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心,福建廈門 361021;5.廈門南方海洋研究中心經(jīng)濟(jì)海藻資源化利用與深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門 361021;)

褐藻膠是由α-L-古羅糖醛酸及β-D-甘露糖醛酸聚合而成的線狀聚合物多糖,它是褐藻酸親水衍生物的統(tǒng)稱,從巨藻、海帶和馬尾藻等褐藻中提取而來,是細(xì)胞壁主要組成物質(zhì)[1]。褐藻膠寡糖是經(jīng)褐藻膠降解的一種低分子聚合物,與多糖相比,生物特性更為突出[2-3]。褐藻膠的降解方法主要有化學(xué)法和酶法[4-5]。酶法生產(chǎn)褐藻膠寡糖條件溫和、得率高、不污染環(huán)境、水解產(chǎn)物生物活性不易被破壞,已經(jīng)逐漸取代化學(xué)法降解。

褐藻膠裂解酶能通過β-1,4糖苷鍵的方式進(jìn)行消除反應(yīng),催化褐藻膠的非還原末端C4,5間不飽和雙鍵,降解褐藻膠[6]。游離酶在使用過程中存在許多問題,例如熱穩(wěn)定性差、酶無法回收、易失活、生產(chǎn)成本較高等[7-8],這嚴(yán)重阻礙了酶的廣泛應(yīng)用。固定化酶是將酶利用物理或者化學(xué)手段定位在限定的空間區(qū)域,其保持催化活性,可重復(fù)使用,能較好地解決上述問題[9-11]。酶的固定化方法多種多樣,主要分為非共價(jià)結(jié)合法、化學(xué)結(jié)合法和包埋法。磁性納米粒子可以通過外界磁場(chǎng)的作用,快速分離產(chǎn)物和底物,提升酶的使用效率,因此磁性納米粒子廣泛應(yīng)用于固定化酶領(lǐng)域[12-14]。作為酶固定化的載體,磁性納米粒子具有許多優(yōu)點(diǎn),例如生物相容性良好、比表面積大、顆粒直徑小、擴(kuò)散限制較小、載酶量較高并可在溶液中穩(wěn)定存在。

目前對(duì)于褐藻膠裂解酶的研究多數(shù)集中在制備、表征和發(fā)酵工藝優(yōu)化[15-17],對(duì)其固定化酶活力的研究較少。本文以磁性高分子納米粒子作為載體對(duì)微泡菌褐藻膠裂解酶AlgL17[18]進(jìn)行固定化研究,并對(duì)固定化酶進(jìn)行鑒定及部分酶學(xué)性質(zhì)表征。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

含微泡菌AlgL17基因的E.coliBL21工程菌株[18]由集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保藏;Fe3O4上海阿拉丁;細(xì)菌學(xué)蛋白胨、技術(shù)瓊脂粉 廣東環(huán)凱;四水合酒石酸鉀鈉、單寧酸 西隴科學(xué);3,5-二硝基水楊酸、海藻酸鈉 國藥集團(tuán);其他試劑均為分析純產(chǎn)品。

Avanti J-263xp立式高速冷凍離心機(jī) 貝克曼庫爾特;ZHWY-2102/ZWY-200D雙層全溫度培養(yǎng)搖床 美國Crystal;HH-4/HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器;FE20 pH計(jì) 梅特勒-托利多;Centrifuge 5810 R冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf;JY92-ⅡN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波信儀;Epoch2T微量酶標(biāo)儀 美國伯騰;BioPhotometer 德國Eppendorf;FreeZone 6Plus 真空冷凍干燥機(jī) Labconco;Nicolet iS10傅立葉紅外光譜分析儀 Thermo;KQ-800KDE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Fe3O4磁性納米粒子固定化載體的制備 參照文獻(xiàn)[19]的方法,稱取1.0551 g Fe3O4加入40 mL蒸餾水,超聲(功率400 W,頻率40 KHz)15 min后得到均勻分散的納米粒子,通入氮?dú)?200 r/min、80 ℃攪拌1 h。接著加入2.5%(w/v)單寧酸溶液,混勻,通入氮?dú)狻?00 r/min、40 ℃反應(yīng)2 h,將混合物冷卻至室溫。將制備的單寧酸修飾的Fe3O4納米粒子(tannic acid-functioned magnetic nanoparticles,TA-MNPs)用磁鐵收集,乙醇洗滌,再用去離子水清洗三次,最后將Fe3O4磁性納米粒子放在干燥烘箱中,70 ℃干燥過夜。

1.2.2 重組褐藻膠裂解酶AlgL17在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 從LB平板上(含卡那霉素50 μg/mL)挑取含有AlgL17基因的工程菌單菌落,移至5 mL LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素50 μg/mL),37 ℃搖動(dòng)(180 r/min)培養(yǎng)過夜。將菌液按1%接種量轉(zhuǎn)接到200 mL LB培養(yǎng)基中(含卡那霉素50 μg/mL),在37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6,然后加入25 μL 0.5 mol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),在17 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)20 h。

1.2.3 褐藻膠裂解酶粗酶液的制備 將誘導(dǎo)后的菌液在4 ℃、8000 r/min條件下離心10 min,棄上清;菌體沉淀重懸于20 mL預(yù)冷的緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,15 mmol/L咪唑)。在冰浴條件下,細(xì)胞利用超聲破碎儀破碎,超聲功率300 W,時(shí)間10 min,4 ℃、6000 r/min離心10 min,取上清,獲得粗酶液,取適量樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.4 固定化褐藻膠裂解酶AlgL17的制備

1.2.4.1 制備流程 取25 mg Fe3O4磁性納米粒子置于50 mL磨口具塞錐形瓶中,加入2.7 U褐藻膠裂解酶AlgL17,5 ℃下反應(yīng)5 h。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行磁分離,再將固定化褐藻膠裂解酶AlgL17用去離子水進(jìn)行清洗,最后進(jìn)行冷凍干燥,4 ℃貯藏備用。

1.2.4.2 固定化褐藻膠裂解酶AlgL17的條件優(yōu)化 以固定化酶的活力為指標(biāo),研究不同固定時(shí)間(3、4、5、6、7 h)、不同含量磁性載體(10、15、20、25、30 mg)、不同活力單位的褐藻膠裂解酶(1.8、2.7、3.6、4.5、5.4 U)對(duì)酶固定化的影響。

1.2.4.3 游離酶和固定化褐藻膠裂解酶的活力測(cè)定(DNS法) 利用DNS法[20]測(cè)定褐藻膠裂解酶的活力。其中,游離酶活力測(cè)定具體方法:20 μL褐藻膠裂解酶AlgL17粗酶液加入380 μL 5 mg/mL海藻酸鈉底物溶液(底物溶于50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液,pH8.0),混勻,35 ℃反應(yīng)10 min,加入400 μL DNS,沸水浴10 min,冷卻至室溫后,在540 nm波長測(cè)定OD值。固定化酶活力測(cè)定具體方法:用20 mg固定化褐藻膠裂解酶替代20 μL褐藻膠裂解酶粗酶液,其余操作同游離酶。褐藻膠裂解酶的活力定義:在上述條件下,每分鐘生成1 μmoL還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.5 固定化酶的最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH測(cè)定 以5 mg/mL海藻酸鈉為底物(底物溶于50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液,pH7.0)在不同溫度下(20、25、30、35、40 ℃)測(cè)定固定化酶的活力,研究固定化酶的最適反應(yīng)溫度。固定化酶的最適反應(yīng)pH的測(cè)定在35 ℃下進(jìn)行,在不同pH的緩沖液:50 mmol/L C6H8O7-Na2HPO4緩沖液(pH6.0)、50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(pH7.0～8.0)、50 mmol/L C2H5NO2-NaOH緩沖液(pH8.5～9.0),研究固定化酶的最適反應(yīng)pH。以酶活力最高的固定化酶的活力為100%。

1.2.6 固定化褐藻膠裂解酶的傅里葉紅外光譜檢測(cè) 取凍干的固定化褐藻膠裂解酶、載體和游離褐藻膠裂解酶分別與KBr混合,置于研缽中研勻,加入壓片模具內(nèi),進(jìn)行壓片,取出,然后在4000～500 cm-1的測(cè)試范圍內(nèi)進(jìn)行傅里葉紅外光譜檢測(cè)。每個(gè)樣品取樣5次進(jìn)行測(cè)定,求其平均光譜,再以9點(diǎn)平滑并通過縱坐標(biāo)歸一化處理,獲得一維紅外光譜圖。

1.2.7 固定化褐藻膠裂解酶的掃描電鏡檢測(cè) 將凍干的固定化酶和空載體送往凱美克化工技術(shù)股份有限公司進(jìn)行掃描電鏡檢測(cè)。室溫下,將固定化酶與載體分別加入去離子水,利用超聲進(jìn)行分散處理,然后滴到銅網(wǎng)上,室溫真空干燥12 h,保存?zhèn)溆?觀察形貌,電壓200 kV,在不同的放大倍數(shù)下進(jìn)行觀察,保存照片。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用origin 8.5數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和Microsoft Excel軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐藻膠裂解酶AlgL17基因在E. coli中的表達(dá)和純化

pET-28α(+)表達(dá)質(zhì)粒插入目的基因,轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21培養(yǎng),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,與pET-28α(+)的空載和未誘導(dǎo)的含重組質(zhì)粒的陽性菌相比較,被誘導(dǎo)表達(dá)的含有pET-28α-algl17的陽性菌有明顯的融合蛋白表達(dá)條帶(圖1,道3),重組褐藻膠裂解酶AlgL17的分子量大小在80 kDa左右。

圖1 褐藻膠裂解酶AlgL17基因表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE of the expressedprotein encoded by the alginate lyase AlgL17 gene 注:M:分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白,1:IPTG誘導(dǎo)的pET-28α(+)空載,2:未誘導(dǎo)的含pET-28α-algl17陽性菌,3:IPTG誘導(dǎo)的含pET-28α-algl17陽性菌。

2.2 固定化褐藻膠裂解酶的活力

以海藻酸鈉為底物,利用DNS法測(cè)定得到固定化褐藻膠裂解酶的活力為1.8 U/mg。

2.3 單因素對(duì)褐藻膠裂解酶固定化的影響

2.3.1 固定時(shí)間對(duì)固定化褐藻膠裂解酶的影響 考查不同固定時(shí)間對(duì)褐藻膠裂解酶固定化的影響,結(jié)果如圖2所示。由圖2可見,在3～5 h之間,酶活力呈上升趨勢(shì);在5 h達(dá)到最高峰;5 h之后酶活力呈下降趨勢(shì),可能是因?yàn)楣潭ㄉ先サ拿篙^多時(shí)產(chǎn)生位阻效應(yīng),從而導(dǎo)致固定化酶活力下降,這種現(xiàn)象在其他一些固定化酶研究中也觀察到[21-22]。因此,研究褐藻膠裂解酶在Fe3O4磁性載體上最適的固定時(shí)間為5 h。

圖2 固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響Fig.2 Effect of immobilization timeon activity of immobilized enzyme

2.3.2 載體量對(duì)固定化褐藻膠裂解酶的影響 考查不同載體量對(duì)褐藻膠裂解酶固定化的影響,結(jié)果如圖3所示。由圖3可見,載體量在10～25 mg時(shí),酶活力呈上升趨勢(shì);25 mg時(shí),酶活力最高;25 mg之后呈下降趨勢(shì),可能是載體量過多,減少了酶在載體上的吸附固定,導(dǎo)致酶活力降低。因此,褐藻膠裂解酶在Fe3O4磁性載體上固定的最適載體量為25 mg。

圖3 載體量對(duì)固定化酶活力的影響Fig.3 Effect of carrier amounton activity of immobilized enzyme

2.3.3 加酶量對(duì)固定化褐藻膠裂解酶的影響 考查不同加酶量對(duì)褐藻膠裂解酶固定化的影響,結(jié)果如圖4所示。由圖4中可以看出,加酶量為2.7 U時(shí),酶活力最高;2.7 U之后呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì),可能是因?yàn)檩d體固定的酶量有限,當(dāng)加酶量濃度較低時(shí),隨著酶液濃度的增加,固定到載體上的酶量增加,酶活力也隨之提高;但加酶量過高會(huì)造成部分酶分子相互聚集使其活性中心互相掩埋,影響酶與底物結(jié)合,酶活力反而下降[23]。因此,本研究中褐藻膠裂解酶固定在25 mg Fe3O4磁性載體上最適加酶量為2.7 U。

圖4 加酶量對(duì)固定化酶活力的影響Fig.4 Effect of enzyme additionon activity of immobilized enzyme

圖5 固定化酶的最適反應(yīng)溫度Fig.5 Optimal reaction temperature of immobilized enzyme

2.4 固定化褐藻膠裂解酶的最適反應(yīng)溫度

考查溫度對(duì)固定化酶活力的影響,結(jié)果如圖5所示。由圖5可以得出,固定化褐藻膠裂解酶AlgL17的最適反應(yīng)溫度為35 ℃,與游離褐藻膠裂解酶AlgL17的最適溫度[18]相同,說明固定化不改變其最適溫度。

2.5 固定化褐藻膠裂解酶的最適反應(yīng)pH

從圖6中可以看出,隨著pH增加,酶活力呈上升趨勢(shì);pH為8.5時(shí),酶活力達(dá)到最高;pH超過8.5后,酶活力迅速下降。說明固定化酶在微堿的環(huán)境下酶活力較高,過酸或過堿都會(huì)使酶的活力下降。文獻(xiàn)[18]報(bào)道游離褐藻膠裂解酶AlgL17的最適反應(yīng)pH為8.0,本研究中固定化褐藻膠裂解酶最適反應(yīng)pH為8.5,此時(shí)酶解反應(yīng)最充分,說明固定化改變其最適pH。

圖6 固定化酶的最適反應(yīng)pHFig.6 Optimal pH of immobilized enzyme

2.6 固定化褐藻膠裂解酶的鑒定

2.6.1 傅里葉紅外光譜檢測(cè) 利用傅立葉紅外光譜分析儀對(duì)固定化酶和載體進(jìn)行紅外檢測(cè),結(jié)果如圖7所示。579 cm-1處的紅外吸收峰與Fe3O4的特征峰相符合,在3320 cm-1有O-H的特征吸收峰,在1740 cm-1處有C=O的特征吸收峰,這證實(shí)了錨定單寧酸基團(tuán)的存在,這說明加入單寧酸成功地對(duì)Fe3O4進(jìn)行了功能化修飾。另外,載體固定上褐藻膠裂解酶之后,除了具有Fe3O4的特征峰外,還出現(xiàn)新的吸收峰,1325 cm-1處為-CH3S伸縮振動(dòng)吸收峰,1450 cm-1處為-NH2伸縮振動(dòng)吸收峰,這些結(jié)果顯示了褐藻膠裂解酶成功地固定在磁性載體上。

圖7 載體(a)、固定化褐藻膠裂解酶(b)和游離褐藻膠裂解酶(c)的傅里葉紅外光譜檢測(cè)Fig.7 Fourier transform infrared spectroscopydetection of carrier(a),immobilized alginatelyase(b)and free alginate lyase(c)

2.6.2 掃描電鏡檢測(cè) 掃描電鏡分析顯示,單寧酸修飾的載體顆粒分散均勻,粒徑在20 nm左右(圖8a),固定褐藻膠裂解酶后,顆粒的大小未發(fā)生很大改變,但載體表面變得比未固定前更粗糙(圖8b),這些結(jié)果顯示,酶成功固定在載體表面,對(duì)顆粒結(jié)構(gòu)沒有影響。

圖8 載體(a)與固定化酶(b)的掃描電鏡檢測(cè)(5000×)Fig.8 Transmission electron microscope analysis ofcarrier(a)and immobilized enzyme(b)(5000×)

3 結(jié)論

目前關(guān)于固定化褐藻膠裂解酶的研究報(bào)道非常少,本文研究了基于單寧酸修飾的四氧化三鐵磁性納米粒子固定化微泡菌褐藻膠裂解酶AlgL17,對(duì)AlgL17進(jìn)行固定化條件優(yōu)化,得到最適固定條件為:固定時(shí)間5 h,加載體量25 mg,加酶量2.7 U。固定化酶在最適溫度35 ℃,最適pH8.5的條件下,顯示出最高酶活力。掃描電鏡(SEM)結(jié)果顯示Fe3O4磁性納米粒子分散性良好,形狀呈規(guī)則球狀。傅里葉變換紅外光譜(FTIR)結(jié)果顯示,褐藻膠裂解酶成功地固定在磁性載體上,且對(duì)磁性載體的結(jié)構(gòu)不會(huì)產(chǎn)生影響。本固定化方案具有工業(yè)應(yīng)用的潛力。