慢性非傳染性疾病，包括心腦血管疾病、腫瘤、糖尿病等，現(xiàn)已成為危害當今人類生命健康的頭號殺手之一[1]，據(jù)世界衛(wèi)生組織預估，到2030年，由慢性非傳染性疾病導致的死亡人數(shù)將可能達到5 200萬 人[2]。研究發(fā)現(xiàn)，慢性非傳染性疾病的主要誘因之一為機體產(chǎn)生過多的活性氧簇，無法通過自身代謝排出，長期累積引起氧化應激反應，從而導致疾病的發(fā)生[3-4]。因此，補充抗氧化劑可以作為抑制氧化應激反應的一種手段，用于減少慢性非傳染性疾病的發(fā)生[5-6]。然而由于人工合成的抗氧化劑往往具有一定的毒副作用[7]，因此，安全有效的食源性抗氧化劑成為研究和開發(fā)的熱點[8]。

海洋生物因其生活環(huán)境與陸地生物迥異，來源于海洋生物的活性物質(zhì)往往具有新穎的化學結(jié)構(gòu)、獨特的生理功效以及相對較高的安全性，近年來，海洋生物，特別是海洋食源性生物已經(jīng)成為新型藥物、保健食品、功能食品、功能材料以及化妝品的重要資源，而肽類成分作為海洋生物活性物質(zhì)中研究最多的一類化合物[9-11]，具有廣泛的研究和開發(fā)的潛力。

香螺（Neptunea cumingi）是我國北方沿海主要的經(jīng)濟貝類，屬于海洋底棲性大型腹足類，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，具有較高的食用價值[12]。目前關(guān)于香螺的研究主要集中在系統(tǒng)分布[13]、生殖生態(tài)學[14-15]、資源分布[16]等方面，其化學成分的研究則主要圍繞營養(yǎng)成分[17-18]，關(guān)于香螺的活性成分及其生物功能的研究較少，多見香螺凝集素的提取、分離及純化[19-20]，及降血壓、抗氧化活性多肽的報道[21-22]，鮮見香螺多肽粗提物的脫色工藝及其脫色后生物活性的報道。

本研究采用響應面分析，以脫色率及多肽保留率為綜合評價指標，對香螺多肽粗提物在脫色過程中所涉及的脫色劑種類及用量、脫色溫度及時間等參數(shù)進行優(yōu)選，確定最佳脫色工藝；采用體外1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除實驗及基于斑馬魚的體內(nèi)抗氧化活性評價模型，探討脫色后精制的香螺多肽的抗氧化活性，采用高效液相色譜柱前衍生法，分析脫色后香螺多肽的氨基酸組成，以期為香螺多肽為原料的高附加值的產(chǎn)品研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香螺（產(chǎn)地山東省煙臺市） 山東沃恩生物科技有限公司；DPPH（分析純）、氨基酸混合標準品（分析純，含有L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸） 美國Sigma公司；6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺氨基甲酸酯（分析純，6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimdyl carbamate，AQC） 源葉生物科技有限公司；VC 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；活性炭（分析純） 萊陽市康德化工有限公司；硅藻土（分析純） 天津市大茂化學試劑廠；活性白（分析純） 天津市福晨化學試劑廠；所有提取用有機溶劑均為國產(chǎn)分析純；轉(zhuǎn)基因斑馬魚（krt4-NTR：GFPcy17）由山東省科學院生物研究所繁育。

1.2 儀器與設備

LE204E分析天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限 公司；KQ 2200DV型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；DS-200高速組織搗碎機 江蘇江陰科研器械廠；CS601超級恒溫水浴鍋 上海博迅實業(yè)有限 公司；TOL-5-A臺式離心機 上海安享科學儀器廠 制造；TU1901雙光束紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；HITACHI D-2000 Elite型高效液相色譜系統(tǒng)（配有L-2400型紫外檢測器和L2130色譜工作站） 日本日立公司；SZX16體式熒光顯微鏡 日本Olympus公司；DNP-9082恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香螺粗多肽提取

基于課題組已建立的酸醇浸提法[21]，制備香螺粗多肽，即取香螺組織，磨碎、勻漿，加入10 倍量的酸性稀乙醇溶液（冰醋酸調(diào)整溶液pH值至5），室溫攪拌提取3 h，離心，取上層清液，減壓濃縮至無醇味，濃縮液冷凍保存，即得。

1.3.2 香螺多肽保留率的測定

采用福林-酚法，測定香螺樣品脫色前后總多肽含量，按式（1）計算樣品多肽保留率[23]：

式中：A1為脫色前樣品中多肽含量/mg；A2為脫色后樣品中多肽含量/mg。

1.3.3 香螺多肽脫色率的測定

采用紫外-可見分光光度法，確定香螺多肽的最大吸光度波長為410 nm，以最大波長為脫色率檢測波長[24]，按式（2）計算脫色率：

式中：B1為脫色前樣品吸光度；B2為脫色后樣品吸光度。

1.3.4 香螺粗多肽脫色工藝參數(shù)的單因素考察

以多肽保留率及脫色率為考察指標，采用超聲波處理方法，分別對脫色劑種類、脫色劑用量、脫色溫度、脫色時間及溶液pH值進行單因素考察，確定脫色工藝的主要影響因素和水平。

1.3.5 響應面分析優(yōu)化香螺粗多肽脫色工藝

以多肽保留率及脫色率為響應值，在單因素考察的基礎上，確定脫色工藝的主要影響因素和水平，采用Design-Expert V8.0.6軟件，進行3因素3水平的 Box-Behnken試驗設計[25]，并對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。試驗設計因素與水平如表1所示。

表 1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.3.6 多肽氨基酸組成的測定

表 2 梯度洗脫條件Table 2 Gradient elution conditions

脫色后香螺多肽提取物經(jīng)12 mol/L鹽酸于105 ℃條件下，密封水解24 h，水解液回收至干，水洗至中性，減壓濃縮后過0.45 μm濾膜，采用AQC柱前衍生法，測定氨基酸組成[22,26]。色譜條件為YMC C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相A為水，B為乙腈，C為醋酸銨緩沖液（10 mmol/L，pH 5.10），梯度洗脫條件見表2，檢測波長260 nm，進樣量10 μL，流速0.8 mL/min，柱溫室溫。

1.3.7 DPPH自由基清除率的測定

以VC為陽性對照，分別配制質(zhì)量濃度為1、10、100、200、500、1 000和2 000 μg/mL的脫色后香螺多肽溶液和VC溶液，采用Lee等[27]的方法，計算各樣品的DPPH自由基清除率，繪制質(zhì)量濃度-清除率曲線，計算清除率為50%時樣品的質(zhì)量濃度（EC50），測定香螺多肽和VC的DPPH自由基清除能力。

1.3.8 體內(nèi)抗氧化活性的測定

以角質(zhì)細胞標記熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚krt4-NTR：GFPcy17為模式動物，采用甲硝唑誘導氧化損傷模型，以VC為陽性對照（質(zhì)量濃度為20 μg/mL），根據(jù)張軒銘等[28]的方法，測定高（200 μg/mL）、中 （100 μg/mL）、低（50 μg/mL）3 個質(zhì)量濃度的香螺多肽的體內(nèi)抗氧化活性，按式（3）計算多肽的相對抗氧化能力：

式中：C0為空白組熒光細胞數(shù)量；C1為給藥組熒光細胞數(shù)量；C2為甲硝唑誘導模型組熒光細胞數(shù)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

綜合考慮多肽保留率和脫色率對香螺多肽脫色工藝的貢獻率，確定指標權(quán)重系數(shù)各為0.5，采用各指標的最高值作為參考，進行數(shù)據(jù)歸一化處理[29]，制定綜合評價計算方法，按式（4）計算。所有實驗均重復3 次，實驗結(jié)果用±s表示。采用SPSS 16.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析， P＜0.05，差異顯著。采用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫色工藝的單因素考察結(jié)果

圖 1 脫色劑種類對脫色工藝的影響Fig. 1 Effect of different decolorizing agents on the decolorization efficiency of peptides from N. cumingi

2.1.1 脫色劑種類對脫色工藝的影響

在脫色劑用量1%、脫色溫度40 ℃、pH 7.4、超聲脫色40 min條件下，測定脫色劑為活性炭、活性白及硅藻土時，對香螺多肽的保留率及脫色率的影響。如圖1所示，不同種類脫色劑對香螺多肽的保留率影響較大，但其脫色效果相差不大。采用活性炭脫色，香螺多肽損失相對較少。因此，選擇活性炭作為脫色工藝進一步優(yōu)選的脫色劑。

2.1.2 脫色劑用量對脫色工藝的影響

圖 2 脫色劑用量對脫色工藝的影響Fig. 2 Effect of decolorizing agent amount on the decolorization efficiency of peptides from N. cumingi

在脫色劑為活性炭、脫色溫度40 ℃、pH 7.4、超聲脫色40 min條件下，分別考察脫色劑用量為0.25%、0.5%、1%、2%、3%、4%和5%時，香螺多肽的保留率及脫色率的變化。如圖2所示，隨著脫色劑用量的逐漸增多，多肽的保留率逐漸降低，脫色率逐漸增大，且當脫色劑用量為2%時，脫色率基本不再變化。因此，綜合保留率及脫色率結(jié)果，脫色劑最佳用量確定為0.5%。

2.1.3 脫色溫度對脫色工藝的影響

圖 3 脫色溫度對脫色工藝的影響Fig. 3 Effect of temperature on the decolorization efficiency of peptides from N. cumingi

在脫色劑為活性炭、脫色劑用量1%、pH 7.4、超聲脫色40 min條件下，分別考察脫色溫度為20、30、40、50 ℃和60 ℃時，香螺多肽的保留率及脫色率的變化。如圖3所示，溫度越高活性炭脫色效果越好。而活性炭對多肽的吸附效果則處于一種變化狀態(tài)，在一定溫度范圍內(nèi)，溫度升高有利于多肽從活性炭中脫附出來，但當溫度超過50 ℃時，保留率明顯降低，可能原因是高溫可使多肽降解變性。因此，綜合保留率及脫色率結(jié)果，脫色的最佳溫度確定為50 ℃。

2.1.4 脫色時間對脫色工藝的影響

圖 4 脫色時間對脫色工藝的影響Fig. 4 Effect of decolorization time on the decoloriation efficiency of peptides from N. cumingi

在脫色劑為活性炭、脫色劑用量1%、脫色溫度40 ℃、pH 7.4條件下，分別考察脫色時間20、30、40、50 min和60 min時，香螺多肽的保留率及脫色率的變化。如圖4所示，活性炭脫色率與脫色時間呈正相關(guān)，在一定時間范圍內(nèi)，多肽保留率隨著時間的延長而增大，但超過40 min后，多肽保留率明顯降低，表明超聲處理在一定程度上可以促進多肽從活性炭上脫吸附。因此，綜合保留率及脫色率結(jié)果，脫色的最佳時間確定為40 min。

2.1.5 脫色體系pH值對脫色工藝的影響

圖 5 脫色體系pH值對脫色工藝的影響Fig. 5 Effect of pH on the decolorization efficiency of peptides from N. cumingi

在脫色劑為活性炭、脫色劑用量1%、脫色溫度40 ℃、超聲脫色40 min條件下，分別用稀鹽酸及稀氫氧化鈉溶液調(diào)整反應體系pH值，比較反應體系pH值分別為2.4、3.4、4.4、5.4、6.4和7.4時對香螺多肽脫色效果的影響。如圖5所示，酸性條件有利于活性炭對色素的吸附，當pH值大于5.5后，脫色率明顯降低，但反應體系處于酸性環(huán)境，不利于多肽成分的保留，因此，綜合保留率及脫色率結(jié)果，確定反應體系的最佳pH值為7.4。

2.2 響應面試驗結(jié)果

響應面試驗設計與結(jié)果如表3所示，得各因素與綜合評價指標回歸方程為：Y=85.88-7.13A-2.89B+2.02C-1.06AB-2.72AC+3.42BC-12.25A2-1.72B2-1.24C2。二次多項式模型R2為0.988 1，校正系數(shù)R2Adj為0.972 7，表明回歸模型擬合良好。由表4可知，模型具有極顯著差異（P＜0.01），失擬項無顯著性差異（P＞0.05）， 表明模型正確。3 個因素對成分保留率及脫色率都有極顯著影響（P＜0.01），影響效果從小到大依次為脫色時間＜脫色溫度＜活性炭用量，且活性炭用量與脫色時間的交互作用以及脫色溫度與脫色時間的交互作用對脫色效率也具有極顯著差異（P＜0.01）。如圖6所示，活性炭用量和脫色溫度對香螺多肽脫色工藝綜合評分的交互作用較弱；脫色溫度和脫色時間對綜合評分的交互作用較強；活性炭用量和脫色時間對綜合評分的交互作用較強。優(yōu)選的最佳脫色工藝為活性炭用量0.42%、脫色溫度52.79 ℃、脫色時間50.00 min，預測綜合評分為88.78%。根據(jù)實際操作的可行性，確定最佳工藝為活性炭用量0.42%，脫色溫度52 ℃、脫色時間50 min、反應體系pH 7.4。按上述提取條件進行3 次驗證實驗，樣品的成分保留率為（67.63±0.80）%，脫色率為（68.70±0.54）%，綜合評分為（86.47±0.26）%，與預測值相對標準偏差為1.85%，表明該模型準確度良好，所優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可行。

表 3 響應面試驗設計與結(jié)果Table 3 Program and experimental results of Box-Behnken design

表 4 模型方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance of quadratic polynomial regression model

圖 6 各因素交互作用對香螺多肽脫色工藝的綜合評分影響的響應面圖Fig. 6 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on comprehensive evaluation

2.3 香螺多肽的氨基酸組成

表 5 香螺多肽氨基酸組成及其含量Table 5 Amino acid composition of peptides from N. cumingi

如表5所示，脫色后香螺多肽的總氨基酸含量為853.46 mg/g，共檢出17 種氨基酸，由于樣品前處理需經(jīng)酸水解，而色氨酸在酸性環(huán)境結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定[30]，因此樣品中未檢出色氨酸。其中，精氨酸、丙氨酸和脯氨酸為香螺中含量最高的3 種氨基酸，占其氨基酸總量的63.43%。香螺多肽中的堿性氨基酸及疏水性氨基酸的比例也相對較高，均超過35%以上。

2.4 香螺多肽體外DPPH自由基清除活性評價結(jié)果

圖 7 香螺多肽DPPH自由基清除能力Fig. 7 DPPH radical scavenging activity of peptides from N. cumingi

如圖7所示，在樣品及VC的供試質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，香螺多肽的清除DPPH自由基EC50值為170.041 μg/mL，陽性對照VC的清除DPPH自由基EC50值為15.569 μg/mL。雖然與VC相比，在1～1 000 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，香螺多肽的DPPH自由基清除能力相對較弱，但香螺多肽的DPPH自由基清除能力與其質(zhì)量濃度呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，隨著樣品質(zhì)量濃度越高，DPPH自由基清除能力明顯增強，當樣品質(zhì)量濃度大于1 000 μg/mL時，其DPPH自由基清除能力趨于穩(wěn)定，1 000 μg/mL的香螺多肽可達到與500 μg/mL的VC相似的清除效果，當樣品質(zhì)量濃度達到2 000 μg/mL時，其DPPH自由基清除能力與質(zhì)量濃度為2 000 μg/mL的VC相當。

2.5 香螺多肽體內(nèi)抗氧化活性評價結(jié)果

圖 8 香螺多肽體內(nèi)抗氧化活性評價結(jié)果Fig. 8 Antioxidant activity in vivo of peptides from N. cumingi

圖 9 樣品的體內(nèi)抗氧化活性統(tǒng)計結(jié)果Fig. 9 Statistical results of in vivo antioxidant activity of peptides

雖然DPPH為一種經(jīng)典的抗氧化及篩選模型，但因生物體內(nèi)不存在DPPH自由基，其結(jié)果的準確性仍需要生物實驗進一步驗證。常見的體內(nèi)抗氧化活性評價模型包括大鼠、小鼠等，但具有實驗周期長、成本高的確定，而斑馬魚作為一種新型的模式生物，具有多種獨特的優(yōu)勢，如實驗周期短、樣品用量少、成本低、可實現(xiàn)活性物質(zhì)的快速高通量篩選，近年來，已被廣泛應用于天然藥物活性成分的篩選[31]。本研究基于斑馬魚皮膚熒光氧化損傷模型，探討香螺多肽的體內(nèi)抗氧化活性。如圖8所示，斑馬魚經(jīng)甲硝唑處理后，機體出現(xiàn)氧化應激狀態(tài)，導致其皮膚角質(zhì)細胞發(fā)生損傷，細胞凋亡[32]，從而使斑馬魚熒光斑點數(shù)量顯著減少（圖8C），加入抗氧化劑后，可減少角質(zhì)細胞損傷的發(fā)生率，避免熒光斑點數(shù)的過度減少（圖8B、D～F），藥物抗氧化活性越強，其皮膚熒光斑點數(shù)越接近正常組（圖8A）。由圖9可知，香螺多肽的相對抗氧化能力與其給藥質(zhì)量濃度呈現(xiàn)明顯的計量依賴性，隨著藥物質(zhì)量濃度升高，其抗氧化能力明顯增高，當質(zhì)量濃度在50～100 μg/mL范圍內(nèi)，香螺多肽的抗氧化能力與20 μg/mL的VC相當（P＞0.05），當香螺多肽質(zhì)量濃度達到200 μg/mL時，其熒光斑點數(shù)接近于未用甲硝唑處理的正常組（P＞0.05）。在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，斑馬魚幼魚形態(tài)未見任何畸形及死亡。實驗結(jié)果表明，香螺多肽具有較好的抗氧化能力，可以抑制由甲硝唑?qū)е碌慕琴|(zhì)細胞凋亡。與體外DPPH自由基清除實驗結(jié)果相比，香螺多肽在基于斑馬魚模式生物的體內(nèi)抗氧化活性評價中，表現(xiàn)出相對更強的抗氧化能力，產(chǎn)生此結(jié)果的原因可能為，脫色后的香螺多肽藥液，經(jīng)斑馬魚皮膚滲透吸收后，分布于斑馬魚幼魚的機體中，隨后香螺多肽在消化系統(tǒng)中經(jīng)過代謝，發(fā)生降解，生成抗氧化活性更強的次級代謝產(chǎn)物，從而表現(xiàn)出更強的抗氧化活性，另一方面，生物體內(nèi)的氧化應激是一種復雜狀態(tài)，與氧化應激相關(guān)的自由基種類多樣，因此，香螺多肽可能是可同時作用于多種由氧化應激所產(chǎn)生的活性氧自由基，表現(xiàn)出較強的體內(nèi)抗氧化活性。本實驗結(jié)果表明，香螺多肽具有潛在的抗氧化功能，其作用機制仍需要進一步研究。

3 結(jié) 論

香螺多肽脫色工藝為活性炭用量0.42%、脫色溫度52 ℃、脫色時間50 min、反應體系pH值為7.4。香螺多肽的成分保留率為（67.63±0.80）%，脫色率為（68.70±0.54）%。香螺多肽總氨基酸含量為853.46 mg/g，堿性氨基酸及酸性氨基酸總量占比約為80%，且精氨酸、丙氨酸、脯氨酸含量高。香螺多肽對DPPH自由基清除活性的EC50值為170.041 μg/mL，抗氧化活性較強，在200 μg/mL質(zhì)量濃度下可抑制斑馬魚氧化損傷，香螺多肽的抗氧化活性可能與其高比例的疏水性氨基酸及堿性氨基酸有關(guān)[33]。