韓 偉，孫 博，苗海江，莊緒會，羅小紅，鄒海杰，陳紅娟，謝嫣琪

大豆乳清中分離干酪乳桿菌GJ00412的種子培養(yǎng)基優(yōu)化

韓 偉，孫 博，苗海江，莊緒會，羅小紅，鄒海杰，陳紅娟，謝嫣琪

（國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院，北京 100037）

從大豆乳清中分離得到一株菌GJ00412，經(jīng)16S rRNA基因測序、比對，初步鑒定為干酪乳桿菌，為降低種子培養(yǎng)基成本并提高其生物量，以便進(jìn)一步應(yīng)用，在傳統(tǒng)乳酸桿菌(MRS)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化。首先通過Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，從葡萄糖、大豆蛋白胨、酵母浸粉、胰蛋白胨、MgSO4、MnSO4、吐溫80、pH等因素中，篩選出葡萄糖、酵母浸粉、MgSO4，吐溫80和pH等5個對菌體生物量有顯著影響的因子。采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對上述5個因素進(jìn)一步優(yōu)化。優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成（w/v）如下：2.5%葡萄糖，1.8%大豆蛋白胨，0.4%酵母浸粉，0.08%MgSO4，0.04%MnSO4，0.08%吐溫80，pH7.17。優(yōu)化后的培養(yǎng)基與MRS培養(yǎng)基相比，降低成本，生物量無顯著差異。

大豆乳清；干酪乳桿菌；響應(yīng)面；Plackett-Burman設(shè)計(jì)

我國是大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）的重要生產(chǎn)國，大豆乳清（soy whey）是其主要副產(chǎn)物。大豆乳清中的化學(xué)需要量（COD）超過10 000 mg/L，直接排放會造成環(huán)境污染，且通過絮凝、厭氧污泥、好氧污泥等方式處理的成本相對較高。然而，它含有蛋白質(zhì)、低聚糖、胰蛋白酶抑制劑、異黃酮類化合物、大豆皂甙、植酸、植酸鹽、酚酸等多種成分[1-3]，微生物，尤其是乳酸菌，可利用大豆乳清中營養(yǎng)成分，達(dá)到增殖或獲得代謝產(chǎn)物的目的[4-5]。

干酪乳桿菌是一種具有很高工業(yè)價值的微生物，也是易從大豆乳清中分離的乳酸菌，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健、發(fā)酵食品、飼料添加劑等領(lǐng)域。干酪乳桿菌的益生性能也得到越來越多的研究支持。Pablo等[6]臨床試驗(yàn)證實(shí)干酪乳桿菌對纖維肌痛患者的認(rèn)知、情緒產(chǎn)生影響。陸文偉等[7]建立小鼠模型，認(rèn)為干酪乳桿菌對小鼠腸道菌群具有一定的調(diào)節(jié)作用，并且對腸道轉(zhuǎn)運(yùn)有良好的促進(jìn)作用。王四新等[8]在飼糧中添加干酪乳桿菌可改善北京黑豬育肥階段的生長性能和飼料利用率，而對其肌肉中營養(yǎng)成分含量無顯著影響。如果干酪乳桿菌能利用大豆乳清營養(yǎng)并大量增殖，將為大豆乳清的利用提供新的思路。

對于很多實(shí)驗(yàn)室或者中試發(fā)酵平臺，MRS培養(yǎng)基被常用作乳酸菌的種子培養(yǎng)基，但是MRS培養(yǎng)基成分復(fù)雜、配制工作繁瑣，且牛肉膏等成分的成本相對較高，不適用于工業(yè)生產(chǎn)線使用。因此，優(yōu)化干酪乳桿菌的種子培養(yǎng)基，是一項(xiàng)不可忽視的工作。在關(guān)于培養(yǎng)基優(yōu)化的統(tǒng)計(jì)學(xué)工具中，響應(yīng)面（RSM）方法功能強(qiáng)大，并早已成功運(yùn)用于發(fā)酵工藝過程的優(yōu)化，其中即包括生物量培養(yǎng)方面[9]。

在本研究中，通過16S rRNA基因測序方法鑒定一株大豆乳清中分離的菌株，即GJ00412。采用響應(yīng)面法優(yōu)化干酪乳桿菌GJ00412的種子培養(yǎng)基，以期增加GJ00412生物量并降低發(fā)酵成本。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

GJ00412，GenBank登錄號為MN650243。實(shí)驗(yàn)中采用的所有試劑均為國產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基，即：20 g葡萄糖，10 g牛肉膏，5 g酵母粉，5 g乙酸鈉，2 g磷酸氫二鉀，2 g檸檬酸二銨，0.58 g硫酸鎂，0.25 g硫酸錳，8 mL吐溫80，1 000 mL去離子水，初始pH7.0。

1.2 16S rRNA基因測序

方法參見參考文獻(xiàn)[10]。正向（上游）引物： 5′-GAG TTT GAT CCT GGC TCA GGA CGA-3′，反向（下游）引物：5′-CGC ACC TTC CGA TAC GGG CTA CCT-3′由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。上游引物（24 bp）1 μL，下游引物（24 bp）1 μL，10×Buffer 5 μL，Mg2+4 μL，dNTP2 μL，Ex Taq 酶1 μL，模板3 μL，ddH2O 35 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃，5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物加入2 μL溴酚藍(lán)染色液，混勻加在1%瓊脂糖凝膠（含goldview 1 μL），1×TAE緩沖液中恒壓80 V電泳40 min，用凝膠成像儀觀察結(jié)果。將PCR產(chǎn)物與T載體連接，擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，測序。

1.3 活菌數(shù)量檢測

活菌數(shù)檢測，參照參考文獻(xiàn)[11]。

1.4 Plackett-Burman設(shè)計(jì)

在Plackett-Burman設(shè)計(jì)[12-13]中，每一個變量均有高（+）和低（–）兩個水平。高的水平值約是低水平值的1.25倍。其是基于一階多項(xiàng)式模型：

是響應(yīng)值（生物量），0是模型的截距，是線性系數(shù)，是自變量的水平。采用JMP軟件包進(jìn)行PB設(shè)計(jì)。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，共考慮了8個因素，分別是葡萄糖（1）、大豆蛋白胨（2）、酵母浸粉（3）、胰蛋白胨（4）、硫酸鎂（5）、硫酸錳（6）、吐溫80（7）、初始pH值（8）。根據(jù)這一實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，共包括8因素的12次實(shí)驗(yàn)。

1.5 Box-Behnken設(shè)計(jì)

通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)[14-15]發(fā)現(xiàn)葡萄糖、酵母浸粉、MgSO4，吐溫80和pH五個因素對生物量影響顯著，因此選取這五個因素，進(jìn)一步采用響應(yīng)面優(yōu)化以確定最優(yōu)條件。根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原則，用于預(yù)測最優(yōu)點(diǎn)的二項(xiàng)式模型如下：

是預(yù)測的響應(yīng)值，0、a和b分別是常量、線性及二次回歸系數(shù)。響應(yīng)面設(shè)計(jì)在Design- Expert Version 6.0.5軟件中進(jìn)行，每個因素選擇三個水平，生物量作為響應(yīng)值，具體因素編碼及水平見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用回歸分析和方差分析來確定模型的回歸系數(shù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)的因素水平和編碼值

注：單因素實(shí)驗(yàn)確定水平和中心點(diǎn)，數(shù)據(jù)略。

1.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按1%(v/v)的接種量將GJ00412分別接種至50 mL MRS液體培養(yǎng)基和50 mL優(yōu)化后的培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基裝于250 mL搖瓶），于搖床上150 rpm、37 ℃培養(yǎng)18 h，按1.3所述方法進(jìn)行活菌數(shù)檢測。

2 結(jié)果和討論

2.1 菌株初步鑒定

GJ00412的16S rRNA基因序列見圖1。經(jīng)PCR，GJ00412在1 000~2 000 bp間有一個明顯的條帶，大約1.5 Kb左右，這表明PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了預(yù)期長度的16S rDNA序列。再將測得的基因序列應(yīng)用于BLAST程序、在Genebank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性比較，得出16S rRNA基因鑒定結(jié)果：GJ00412與干酪乳桿菌（M15-1）的同源性為100%。

2.2 影響生物量的主效因素篩選

Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2和表3。采用分布檢驗(yàn)對每個變量的顯著性進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。從表4和表5可看出，初始pH（< 0.01）、硫酸鎂、酵母浸粉、吐溫80、葡萄糖（< 0.05）對GJ00412的生物量有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性影響。因此對這五個因素采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化。大豆蛋白胨和硫酸錳對生物量貢獻(xiàn)不顯著，但是作為主要的氮源和無機(jī)鹽離子，又是培養(yǎng)基不可或缺的，所以根據(jù)Plackett-Burman設(shè)計(jì)的結(jié)果對這兩個因素分別選取1.8%和0.04%。此外，根據(jù)模型的回歸系數(shù)得出胰蛋白胨對生物量的貢獻(xiàn)小于0.664%，因此胰蛋白胨未被考慮在最終的培養(yǎng)基配方中。

圖1 GJ00412的16S rRNA基因序列

表2 通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)的不同變量水平

表3 通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析

注：2（擬合值）=0.982 4;2adj（調(diào)整后的擬合值）=0.961 2。

2.3 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

響應(yīng)面設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的均方差分析見表6。從上述2表的結(jié)論得到生物量和各因素的二次回歸方程為：

=67.33–1.88–27.31+0.56–1.44+0.063– 12.442+22.812–1.192–2.692–13.522–9–5.5+2.5+0.5–1.25+5.25–0.25– 3.5+1.5–4.5

表7列出了二項(xiàng)式模型的方差分析結(jié)果。模型值為11.28，<0.000 1，表明該擬合模型具有很高的顯著性。2為0.900 3，表明生物量的90.03%是由培養(yǎng)基成分貢獻(xiàn)的，只有9.97%未在本模型中體現(xiàn)出來，說明此方程適合于響應(yīng)值（生物量）的預(yù)測。另外從表6還可以得出，因素（酵母浸粉）對生物量的線性效應(yīng)顯著，2（葡萄糖），2，2（初始pH）對生物量的曲面效應(yīng)顯著。

圖2中，實(shí)驗(yàn)建立三維響應(yīng)面繪圖，預(yù)測不同變量值下的生物量并對不同因素間相互作用進(jìn)行分析。三維響應(yīng)面立體圖以z-軸為響應(yīng)值來表示兩個變量的交互作用，同時保持其他變量的最優(yōu)水平。另外，運(yùn)用迭代法計(jì)算出各個變量的最優(yōu)水平，并對回歸方程的最大值進(jìn)行計(jì)算。用相應(yīng)因素的編碼的濃度水平代入回歸方程，計(jì)算出生物量的最大預(yù)測響應(yīng)值。五個因素的最優(yōu)水平見表8。因此，得到優(yōu)化后培養(yǎng)基配方（w/v）：2.5%葡萄糖，1.8%大豆蛋白胨，0.4%酵母浸粉，0.08% MgSO4，0.04% MnSO4，0.08%吐溫80，pH 7.17。

表5 Box-Behnken設(shè)計(jì)和結(jié)果

表6 試驗(yàn)結(jié)果的均方差分析

表7 二項(xiàng)式模型的方差分析

注：2=0.900 3;2adj=0.820 5。

從左至右：A和B，B和C，A和D，A和E，C和E，D和E交互作用。

表8 響應(yīng)面試驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果

2.4 優(yōu)化后的培養(yǎng)基的驗(yàn)證

在優(yōu)化后的培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基分別培養(yǎng)GJ00412，經(jīng)過37 ℃下培養(yǎng)18 h，其生物量比較如表9，GJ00412在2種培養(yǎng)基中得到的生物量并無顯著性差異（<0.01）。

表9 優(yōu)化后培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)GJ00412的對比實(shí)驗(yàn)

注：培養(yǎng)時間為18 h。

3 結(jié)論

在本研究中，通過Plackett-Burman和Box- Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對干酪乳桿菌GJ00412的傳統(tǒng)MRS培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。得到優(yōu)化后的種子培養(yǎng)基配方（w/v）如下：2.5%葡萄糖，1.8%大豆蛋白胨，0.4%酵母浸粉，0.08% MgSO4，0.04% MnSO4，0.08%吐溫80，pH 7.17。優(yōu)化后的培養(yǎng)基與MRS培養(yǎng)基相比，減少4個培養(yǎng)基成分且降低成本。通過同等條件下實(shí)驗(yàn)對比，GJ00412在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中生物量相對MRS培養(yǎng)基并無顯著差異（<0.01）。以上結(jié)果表明，優(yōu)化后的培養(yǎng)基可應(yīng)用于干酪乳桿菌GJ00412工業(yè)化種子擴(kuò)培。

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Optimization of the seed medium ofGJ00412 isolated from soy whey

HAN Wei, SUN Bo, MIAO Hai-jiang, ZHUANG Xu-hui, Luo Xiao-hong, Zou Hai-jie, Chen Hong-juan, Xie Yan-qi

(Academy of National Food and Strategic Reserves Administration, Beijing 100037, China)

Soy whey (SW) is generated as a process waste during soy isolate protein preparation. SW has low content of soluble sugar and high content of oligosaccharide, which is suitable for the growth of lactic acid bacteria (LAB). In this study, a strain ofGJ00412 (by 16S rRNA genesequencing and identification) was isolated from soy whey. In order to reduce the cost of culture medium, improve its biomass, and facilitate the next utilization, Response surface methodology (RSM) was employed to optimize the composition of seed medium ofBy Plackett-Burman design, sucrose, yeast power, MgSO4, Tween80 and pH value were found to have significant effects on biomass, and were further analyzed by Box-behnken design, an application of response surface. The optimized medium was as follows (w/v): 2.5% sucrose, 1.8% soy peptone, 0.4% yeast powder, 0.08% MgSO4, 0.04% MnSO4, 0.08% Tween80, pH 7.17. The results showed that the cost of the optimized medium was decreased and the biomass ofhas no significant difference when compared with MRS medium.

soy whey;; response surface; Plackett-Burman design

TS214；Q939.97

A

1007-7561(2020)02-0108-07

2019-11-19

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金課題（ZX1712）

10.16210/j.cnki.1007-7561.2020.02.018

韓偉，1983年出生，男，副研究員，研究方向?yàn)榧Z油食品檢驗(yàn)與質(zhì)量控制.