?？∧?田曉清 樊成奇 黃金昌 陸亞男 韓清華

研究論文

兩株南極枝孢霉屬真菌spNJF4和NJF6的次級代謝產(chǎn)物研究

?？∧?, 2田曉清2樊成奇2黃金昌2陸亞男2韓清華2

(1上海海洋大學(xué), 上海 201306;2中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海與遠(yuǎn)洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200090)

南極因其獨(dú)特的自然環(huán)境成為潛在、重要的微生物資源庫, 是產(chǎn)生新型生物活性物質(zhì)和先導(dǎo)化合物菌株的潛在種源地, 南極微生物正在成為創(chuàng)新藥物研究新的重要資源。雖然近年來對南極微生物次級代謝產(chǎn)物的研究逐漸增加, 但與溫帶和熱帶微生物研究相比仍處于初級階段。對從南極普里茲灣海洋沉積物中獲得的兩株枝孢霉屬真菌spNJF4 和 NJF6進(jìn)行次級代謝產(chǎn)物分離及結(jié)構(gòu)鑒定, 獲得20個(gè)化合物?；衔锝Y(jié)構(gòu)類型包括甾醇(1)、倍半萜類(7—8)、生物堿類(9—14)、二酮哌嗪(2—5、15—17)、芳香酸(6、18—19)等, 其中倍半萜類(7—8)為首次從枝孢霉屬真菌中分離得到, 以上研究將為豐富南極微生物次級代謝產(chǎn)物庫奠定一定的研究基礎(chǔ)。

南極真菌 次級代謝產(chǎn)物 分離純化 結(jié)構(gòu)鑒定

0 引言

南極被人們稱為第七大陸, 是地球上最后一個(gè)被發(fā)現(xiàn)、唯一沒有人員定居的大陸。南極大陸極端的氣候條件使其成為了地球上最嚴(yán)苛的生境之一, 它大部分地區(qū)常年被冰雪覆蓋, 永久無冰區(qū)面積僅為其總面積的0.4%左右, 氣候酷寒干燥、強(qiáng)光輻射, 雖然在一定程度上限制了微生物的生存及繁衍, 但也使得南極地區(qū)的微生物資源的種類和性質(zhì)有別于世界其他地區(qū), 具有耐低溫、耐高鹽、抗輻射等特點(diǎn)。由于長時(shí)間的沉淀和積累, 使得極地區(qū)域海洋沉積物成為一個(gè)成分復(fù)雜且巨大的微生物棲息地。海洋沉積物中有機(jī)質(zhì)含量是海水的104—105倍, 充足的營養(yǎng)物質(zhì)中蘊(yùn)藏了大量的微生物, 并且這些微生物往往具有適應(yīng)其特殊環(huán)境的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)上的特異性, 有很好的產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的潛力[1]。自從1986年P(guān)ugh首次對南極海洋真菌報(bào)道以來, 最近幾十年, 各國科學(xué)家對南極大陸、附近海域以及近南極地區(qū)不同基底的真菌資源多樣性進(jìn)行了相關(guān)的考察, 發(fā)現(xiàn)了100多種非地衣型真菌, 新的分類群也通過分子生物學(xué)方法不斷被發(fā)現(xiàn), 這表明南極地區(qū)真菌的多樣性及其重要生態(tài)學(xué)意義有待深入的探索和研究[2]。

在關(guān)于南極真菌的研究中, 林文翰教授團(tuán)隊(duì)于2009年從南極企鵝島附近海域沉積物來源的1株真菌中分離得到6個(gè)哌鉑霉素類化合物Asperelines A–F[3]; 顧謙群教授團(tuán)隊(duì)對南極真菌多樣性及代謝產(chǎn)物進(jìn)行了系統(tǒng)研究, 建立了基于微生物-化學(xué)-生物活性相結(jié)合的系統(tǒng)性研究平臺, 從近南極長城站地衣下土壤來源的真菌GW3-13, 普里茲灣深海沉積物來源的真菌PRB-2、sp. PR19N-1, 以及苔蘚來源的真菌GWT2-?24中獲得多種類型的新化合物, 如二酮哌嗪類、聚酮類、倍半萜烯類及混源萜類化合物等, 其中部分化合物具有顯著的細(xì)胞毒及抗病毒活性[4-8]; 劉永宏團(tuán)隊(duì)從南極土生真菌SCSIO 05702中得到高氧化度的-吡喃酮型倍半萜類化合物, 部分化合物對流感病毒H1N1和H3N2具有抑制作用[9]。以上研究結(jié)果表明南極真菌具有極大的物種資源和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的潛力, 有待進(jìn)一步研究。本課題組前期從南極普里茲灣海洋沉積物中分離并鑒定了4株真菌菌株, 其中2株為枝孢霉sp. NJF4和NJF6, 對其開展了蛋白磷酸酶含量和大田軟海綿酸OA對該酶的抑制作用測試, 并分析了菌株提取物中的脂肪酸類成分[10], 本文報(bào)道了sp. NJF4和NJF6中次級代謝產(chǎn)物分離與結(jié)構(gòu)鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

色譜填料和試劑: HP-20大孔吸附樹脂(Mitsubishi Chemical Ltd, Japan); 凝膠 Sephadex LH-20(Pharmacia Biotech, Sweden); 凝膠Sepha-dex G-25(Pharmacia Biotech, Sweden); 預(yù)制GF254 TLC硅膠板(青島海洋化學(xué)公司); 液相用乙腈、甲醇(色譜級, Tedia, USA); 其余溶劑均為分析純(AR, 上海國藥集團(tuán))。

1.2 NJF4和NJF6菌株中代謝產(chǎn)物的分離純化

1.2.1 菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

配制2瓶800 mL YPD(酵母膏胨葡萄糖)液體培養(yǎng)基, 分別置于2 L三角瓶中, 121°C高溫滅菌30 min, 再接入經(jīng)過活化培養(yǎng)的NJF4和NJF6菌株, 24°C、180 rpm進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng), 10 d后得到種子發(fā)酵液。將種子液按一定比例接種于含有0.75 L YPD液體培養(yǎng)基的2 L三角瓶中, 在24°C、180 rpm分3批進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng), 每批發(fā)酵培養(yǎng)10—15 d, 每株菌共得到約60 L發(fā)酵液。

1.2.2 NJF4 單體化合物的提取與分離

減壓抽濾發(fā)酵液, 得50 L上清液和若干菌絲體。上清液濃縮冷卻后經(jīng)大孔吸附樹脂柱分離, 用甲醇-水溶液(20%、60%、100%)依次洗脫, 每個(gè)梯度洗脫3—5個(gè)柱體積, 收集洗脫液并蒸干得A、B、C三部分。菌絲體經(jīng)超低溫冰箱(–80°C)冷凍12 h后取出, 剪碎后分別加入丙酮和甲醇, 超聲提取3次, 每次0.5 h, 合并萃取液并蒸干(5.6 g)。經(jīng)MCI柱層析分離, 用甲醇-水溶液(20%、60%、100%)依次洗脫, 每個(gè)梯度洗脫3—5個(gè)柱體積, 收集洗脫液并蒸干得D、E、F三部分。合并A和D, 得20% 甲醇洗脫部位NJF4 I(2.5 g); 合并B和E, 得60%甲醇洗脫部位NJF4 II(4.0 g); 合并C和F, 得100%甲醇洗脫部位NJF4 III(3.7 g)。NJF4 I經(jīng)正相硅膠柱層析分離, 氯仿-甲醇(10∶1→4∶1)依次洗脫, 得化合物1—5; NJF4 II經(jīng)Sephadex LH-20和正相硅膠柱分離, 合并主要成分段并使用半制備液相手段進(jìn)一步分離, 得單體化合物6(10.51 min)。

1.2.3 NJF6 單體化合物的提取與分離

減壓抽濾發(fā)酵液, 得50 L上清液和若干菌絲體。菌絲體經(jīng)超低溫冰箱冷凍取出, 剪碎后分別加入丙酮和甲醇, 超聲提取3次, 每次0.5 h, 合并萃取液并蒸干。濃縮后的浸膏加2.4 L純水溶解充分, 然后分別用石油醚、氯仿、正丁醇各萃取3 次, 得到相應(yīng)的石油醚(0.24 g)、氯仿(3.44 g)和正丁醇萃取物(75.1 g)。

NJF6的石油醚和氯仿部分分別用少量的MeOH溶解后合并, 用正相硅膠柱進(jìn)行分離, 分別用氯仿∶甲醇=60∶1、40∶1、30∶1、20∶1、10∶1的梯度洗脫, 得到I—IX九部分。將主要成分段IV、V合并經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析分離, 100%乙醇洗脫, 得到四部分命名為a、b、c、d, 將a部分經(jīng)過Sephadex LH-20凝膠柱層析分離, 100%乙醇洗脫, 得到化合物9和17。對VI部分用Sephadex LH-20凝膠柱層析分離, 100% 乙醇洗脫, 得到六部分命名為VI a、VI b、VI c、VI d、VI e、VI f; VI b經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析分離(氯仿︰甲醇=1︰1), 得VI b-1—VI b-3 共3個(gè)組分, VI b-1經(jīng)HPLC(高效液相色譜)反復(fù)進(jìn)樣制備(流動相: 乙腈-0.1%三氟乙酸-水), 得到化合物18(25.38 min)、7(26.34 min)、8(27.88 min); VI b-2經(jīng)HPLC反復(fù)進(jìn)樣制備(流動相: 乙腈-0.1%三氟乙酸-水), 得到化合物15(8.12 min); VIb-3經(jīng)HPLC反復(fù)進(jìn)樣制備(流動相: 乙腈-0.1%三氟乙酸-水), 得到化合物11(18.08 min)和化合物12(21.80 min)。VI f經(jīng)過硅膠分離得到化合物16和20。

正丁醇部分用水充分溶解后經(jīng)MCI(吸附樹脂)柱進(jìn)行分離, 依次用MeOH∶H2O(20∶80→ 40∶60→ 60∶40→ 80∶20→ 100∶0, 每一個(gè)梯度1—1.5 L)進(jìn)行梯度洗脫, 得到相應(yīng)的20%、40%、60%和80%洗脫液, 60%部分甲醇-水洗脫液濃縮后用甲醇充分溶解, 經(jīng)反相柱進(jìn)行分離, 依次用MeOH∶H2O(30∶70→ 45∶55→ 60∶40 → 80∶20→ 100∶0)進(jìn)行梯度洗脫, 得到30%、45%、60% 和80%四部分。用Sephadex LH-20凝膠柱層析法對45%部分甲醇-水濃縮液進(jìn)行分離, 得到a、b、c、d、e五部分; c和d部分經(jīng)HPLC反復(fù)進(jìn)樣制備, 得到化合物19(19.51 min)和13(18.62 min); e部分經(jīng)硅膠柱色譜分離得到化合物10, 30% 部分甲醇-水洗脫液經(jīng)硅膠柱色譜分離得到化合物14。

2 研究結(jié)果

2.1 NJF4次級代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1: 白色無定型粉末, 該化合物的1H-NMR(CDCl3, 400MHz)數(shù)據(jù)如下:H5.35(1H, m), 5.14—5.24(2H, m), 4.07(1H, m), 3.61(1H, m), 2.35(1H, m), 1.07(3H, s), 1.02(3H, d,=6.5 Hz), 0.91(3H, d,=6.6 Hz), 0.83(3H, d,=6.7 Hz), 0.82(3H, d,=6.7 Hz), 0.59(3H, s),13C NMR (125 MHz, CDCl3) 數(shù)據(jù)如下:C144.0, 135.4, 132.2, 117.6, 76.0, 73.7, 67.8, 56.0, 54.8, 43.8, 43.5, 42.9, 40.4, 39.5, 39.2, 37.2, 33.1, 33.0, 30.9, 27.9, 22.9, 22.1, 21.1, 19.9, 19.7, 18.8, 17.6, 12.3。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致, 鑒定為已知化合物5, 22-二烯-麥角甾-3, 7, 8-三醇(結(jié)構(gòu)式見圖1)。

化合物2: 淺褐色無定型粉末, HR-ESI-MS譜給出準(zhǔn)分子離子峰245.0923 [M+H-H2O]+, 對應(yīng)分子式為C13H14N2O4。該化合物的1H-NMR (CD3OD, 400 MHz)數(shù)據(jù)如下:H2.53—2.64(2H, m), 3.00(1H, m), 3.17(1H, m), 3.23(1H, m), 4.29 (1H, m), 7.19—7.28 (5H, m)。該化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致, 鑒定為已知化合物環(huán)(苯丙氨酸-天冬氨酸)(結(jié)構(gòu)式見圖1)。

化合物3: 淺褐色無定型粉末, HR-ESI-MS譜給出準(zhǔn)分子離子峰284.1039 [M+H-H2O]+和301.1290 [M+NH4-H2O]+, 結(jié)合氫譜碳譜數(shù)據(jù)確定其分子式為C15H15N3O4。該化合物的1H-NMR (CD3OD, 400 MHz)數(shù)據(jù)如下:H0.71(1H, m), 2.00 (1H, m), 3.15(1H, dd,=4.1, 0.6 Hz), 3.47(1H, dd,=4.1, 0.6 Hz), 4.01(1H, m), 4.27(1H, m), 7.03(1H, m), 7.08—7.14(2H, m), 7.37(1H, d,=8.1 Hz), 7.62 (1H, d,= 8.1 Hz)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz) 數(shù)據(jù)如下:C172.8, 168.3, 167.5, 136.1, 127.8, 124.8, 121.2, 119.1, 118.7, 111.0, 108.2, 55.8, 51.6, 38.5, 29.5。該化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致, 鑒定為已知化合物環(huán)(色氨酸-天冬氨酸) (結(jié)構(gòu)式見圖1)。

化合物4: 淺褐色無定型粉末, HR-ESI-MS譜給出準(zhǔn)分子離子峰274.1186 [M+H]+和547.2296 [2M+H]+, 對應(yīng)分子式為C14H15N3O3。該化合物的1H-NMR(CD3OD, 400 MHz)數(shù)據(jù)如下:H2.88(1H, m), 3.31—3.38(2H, m), 3.48(1H, m), 3.80(1H, m), 4.21(1H, m), 7.01(1H, m), 7.08—7.11 (2H, m), 7.32(1H, d,=8.0 Hz), 7.61(1H, d,=8.0 Hz)。該化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致, 鑒定為化合物環(huán)(苯丙氨酸-絲氨酸)(結(jié)構(gòu)式見圖1)。

化合物5: 淺褐色無定型粉末,1H-NMR (CD3OD, 400MHz)數(shù)據(jù)如下:H0.12(1H, m), 0.72 (3H, d,=6.7 Hz), 0.86(1H, m), 1.21—1.38(1H, m), 2.80(1H, m), 3.18(1H, m), 3.65(1H, m), 4.21(1H, m), 6.69(2H, d,=7.8 Hz), 6.97(2H, d,=7.8 Hz)。該化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致, 鑒定為已知化合物4￠-羥基苯丙氨酸-亮氨酸(結(jié)構(gòu)式見圖1)。

化合物6: 白色固體, 該化合物的1H-NMR (CD3OD, 400 MHz)數(shù)據(jù)如下:H2.52(2H, t,=7.6 Hz), 2.78(2H, t,=7.6 Hz), 6.67(2H, d,=8.0 Hz), 7.02(2H, d,=7.9 Hz)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)數(shù)據(jù)如下:C177.0, 156.6, 133.0, 130.1, 116.3, 37.1, 31.2。該化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致, 鑒定為已知化合物對羥基苯丙酸(結(jié)構(gòu)式見圖1)。

2.2 NJF6次級代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物7: 淺黃色粉末, HR-ESI-MS譜給出準(zhǔn)分子離子峰/249.1488([M+H]+, 計(jì)算值為249.1485), 結(jié)合氫譜碳譜數(shù)據(jù)確定其分子式為C15H20O3。該化合物的1H-NMR(CD3OD, 400 MHz) 數(shù)據(jù)如下:H7.42(1H, d,=7.2 Hz), 7.06(1H, d,=6.8 Hz), 5.47(1H, t,=6.6 Hz), 2.20(2H, dd,= 7.6, 14.8 Hz), 1.98(3H, s), 1.35(2H, dd,=7.0, 15.0 Hz), 0.95(6H, d,=6.4 Hz),13C-NMR(CD3OD, 100 MHz)數(shù)據(jù)如下:C155.9(C-1), 117.4(C-2), 121.9 (C-3), 130.2(C-3), 121.9(C-4), 130.2(C-5), 138.3 (C-6), 131.7(C-7), 135.4(C-8), 27.2(C-9), 39.9 (C-10), 28.9(C-11), 23.0(C-12), 23.0(C-13), 16.6 (C-14), 172.5(C-15), 該化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致, 鑒定為7-deoxy-7,8-didehydrosydonic acid (結(jié)構(gòu)式見圖1)。

化合物8: 淺黃色粉末, HR-ESI-MS譜給出準(zhǔn)分子離子峰267.1596([M+H]+, 計(jì)算值為267.1552),結(jié)合氫譜碳譜數(shù)據(jù)確定其分子式為C15H22O4。1H-NMR(CD3OD, 400 MHz)數(shù)據(jù)如下:H7.45(1H, dd,=1.6, 8.0 Hz), 7.37(1H, d,=1.6 Hz), 7.27(1H, d,=8.0 Hz),1.60(3H, s), 0.95(2H, d,=6.4 Hz),13C-NMR(CD3OD, 100 MHz)數(shù)據(jù)如下:C169.9, 156.9, 138.0, 131.6, 127.8, 121.5, 118.6, 77.9, 43.6, 40.5, 29.0, 28.8, 23.0, 22.9, 22.9。該化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致, 鑒定為sydonic acid(結(jié)構(gòu)式見圖1)。

化合物9: 無色固體, HR-ESI-MS譜給出準(zhǔn)分子離子峰164.1069([M+H]+, 計(jì)算值為164.1031), 提示其分子式為C10H13NO。1H-NMR(Pyr, 400 MHz)數(shù)據(jù)如下:H7.26(5H, m), 3.67(2H, dd,= 13.4, 7.2 Hz), 2.92 (2H, t,=7.2 Hz), 2.05(3H, s)。該化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]基本一致, 鑒定為N-乙酰苯乙胺(結(jié)構(gòu)式見圖1)。

化合物10: 白色無定形粉末, HR-ESI-MS譜給出準(zhǔn)分子離子峰176.0694([M+H]+, 計(jì)算值為176.0706), 提示其分子式為C10H9NO2。1H- NMR(CD3OD, 400 MHz)數(shù)據(jù)如下:H7.54(1H, d,=8.0 Hz), 7.33(1H, d,=8.0 Hz), 7.15(1H, s), 7.09(1H, t,=7.6 Hz), 7.01(1H, t,=7.4 Hz), 3.73 (2H, s),13C-NMR(CD3OD, 100 MHz)數(shù)據(jù)如下:C119.4(C-2), 128.6(C-3), 108.9(C-3a), 119.8(C-4), 122.4(C-5), 124.6(C-6), 112.2(C-7), 138.0(C-7a), 31.9(C-8), 176.5(C-9)。該化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致, 鑒定為3-吲哚乙酸(結(jié)構(gòu)式見圖1)。

化合物11: 黃色無定形粉末, HR-ESI-MS譜給出準(zhǔn)分子離子峰203.1123([M+H]+, 計(jì)算值為203.1179), 提示其分子式為C12H14N2O。1H-NMR(CD3OD, 400 MHz)數(shù)據(jù)如下:H7.55 (1H, d,=8.0 Hz), 7.32(1H, d,=8.4 Hz), 7.08(1H, t,= 6.2 Hz), 7.60(1H, s), 6.99(1H, t,=7.0 Hz), 3.46 (2H, t,=7.4 Hz), 2.94(2H, t,=7.2 Hz), 1.91 (3H, s)。該化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本一致, 鑒定為N-乙?；?結(jié)構(gòu)式見圖1)。

化合物12: 黃色油狀物, HR-ESI-MS譜給出準(zhǔn)分子離子峰122.0966([M+H]+, 計(jì)算值為122.0964), 提示其分子式為C8H11N。1H-NMR (CD3OD, 400 MHz)數(shù)據(jù)如下:H7.24(4H, m), 7.16 (1H, t,=7.0 Hz), 2.91(2H, t,=7.8 Hz), 2.56(2H, t,=7.8 Hz)。該化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道基本一致, 鑒定為苯乙胺(結(jié)構(gòu)式見圖1)。

化合物13: 白色粉末, HR-ESI-MS譜給出準(zhǔn)分子離子峰146.0599([M+H]+, 計(jì)算值為146.0600), 提示其分子式為C9H7NO。1H-NMR (CD3OD, 400 MHz) 數(shù)據(jù)如下:H9.88(1H, s), 8.15 (1H, d,=8.0 Hz), 8.10(1H, s), 7.47(1H, d,=8.0 Hz), 7.25(2H, m)。該化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道基本一致, 鑒定為3-醛基吲哚(結(jié)構(gòu)式見圖1)。

化合物14: 黃色無定形粉末, HR-ESI-MS譜給出準(zhǔn)分子離子峰138.0899([M+H]+, 計(jì)算值為138.0913), 提示其分子式為C8H11NO。1H-NMR(Pyr, 400 MHz)數(shù)據(jù)如下:H7.31(2H, d,=8.4 Hz), 7.16 (2H, d,=8.4 Hz), 3.13(2H, t,=7.6 Hz), 2.87(2H, t,=7.6 Hz)。該化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道基本一致, 鑒定為對羥基苯乙胺(結(jié)構(gòu)式見圖1)。

化合物15: 淺黃色粉末, HR-ESI-MS譜給出準(zhǔn)分子離子峰261.1177([M+H]+, 計(jì)算值為261.1161), 提示其分子式為C14H16N2O3。1H-NMR (CD3OD, 400 MHz) 數(shù)據(jù)如下:H7.04(1H, d,= 8.4 Hz), 6.70(1H, d,=8.8 Hz), 4.36(1H,like), 4.04(1H, dd,=11.0, 7.4 Hz), 3.54(1H, m), 3.36 (1H, m), 3.06(2H, m), 2.19(1H, m), 1.80(2H, m), 1.21(1H, m)。該化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道基本一致, 鑒定為環(huán)(脯氨酸-酪氨酸)(結(jié)構(gòu)式見圖1)。

化合物16: 綠色固體, HR-ESI-MS譜給出準(zhǔn)分子離子峰334.1501([M+H]+, 計(jì)算值為334.1511), 提示其分子式為C20H19N3O2。1H-NMR (Pyr, 400 MHz)數(shù)據(jù)如下:H8.07(1H, d,=8.0 Hz), 7.53(1H, d,=8.0 Hz), 7.31(1H, d,=8.8 Hz), 7.08—7.28(6H, m), 4.64(1H, m), 4.47(1H, m), 3.58(1H, dd,=14.4, 3.6 Hz), 3.23(1H, dd,=13.0, 3.4 Hz), 3.04(1H, q), 2.46(1H, dd,=13.4, 7.8 Hz),該化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報(bào)道基本一致, 鑒定為環(huán)(苯丙氨酸-色氨酸)(結(jié)構(gòu)式見圖1)。

化合物17: 白色粉末, HR-ESI-MS譜給出準(zhǔn)分子離子峰211.1435([M+H]+, 計(jì)算值為211.1441), 提示其分子式為C11H18N2O2。1H- NMR(Pyr, 400 MHz)數(shù)據(jù)如下:H4.22(2H, m), 3.53(2H, m), 2.28(2H, m), 2.17(2H, m), 1.79(1H, m), 1.67(2H, m), 0.95(3H, d,=4.8 Hz), 0.93(3H, d,=4.4 Hz)。該化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道基本一致, 鑒定為環(huán)(纈氨酸-脯氨酸)(結(jié)構(gòu)式見圖1)。

化合物18: 白色無定形粉末, HR-ESI-MS譜給出準(zhǔn)分子離子峰245.0773([M+Na]+, 計(jì)算值為245.0784), 提示其分子式為C12H14O4。1H-NMR(CD3OD, 400 MHz)數(shù)據(jù)如下:H7.67(2H, q), 7.54(1H, t,=7.4 Hz), 7.46(1H, t,=7.2Hz), 4.07(2H, d,=6.4 Hz), 2.06(1H, m), 1.01(6H, d,=6.4 Hz)。該化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]報(bào)道基本一致, 鑒定為1,2-Benzenedicarboxylic acid(結(jié)構(gòu)式見圖1)。

化合物19: 黃色無定形粉末, HR-ESI-MS譜給出準(zhǔn)分子離子峰123.0441([M+H]+, 計(jì)算值為123.0441), 提示其分子式為C7H6O2。1H-NMR (CD3OD, 400 MHz)數(shù)據(jù)如下:H8.02(1H, d,=7.2 Hz), 7.55(1H, t,=7.2 Hz), 7.44(1H, t,=7.6 Hz)。該化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26]報(bào)道基本一致, 鑒定為苯甲酸(結(jié)構(gòu)式見圖1)。

化合物20: 無色固體。HR-ESI-MS譜給出準(zhǔn)分子離子峰255.0646([M+H]+, 計(jì)算值為255.0613), 提示其分子式為C15H10O4。1H-NMR (Pyr, 400 MHz) 數(shù)據(jù)如下:H8.47(1H, d,=8.4 Hz), 8.17(1H, s), 7.86(1H, d,=8.4 Hz), 7.82(2H, d,=8.4 Hz), 7.29(2H, d,=8.4 Hz), 7.12(1H, d,=2.4 Hz)。該化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[27]報(bào)道基本一致, 鑒定為異黃酮類化合物7,4￠-二羥基異黃酮, 應(yīng)是培養(yǎng)基成分(結(jié)構(gòu)式見圖1)。

圖1 從兩株南極真菌中分離得到的化合物結(jié)構(gòu)式. 1—6為NJF4中分離得到的化合物, 7—20為NJF6中分離得到的化合物

Fig.1. Structural formulas of compounds isolated from two Antarctic fungi NJF4 and NJF6. Compounds 1—6 were isolated from NJF4 and 7—20 were isolated from NJF6

3 結(jié)論與展望

近年來, 有多名學(xué)者對不同環(huán)境來源的枝孢霉屬真菌的化學(xué)成分及活性進(jìn)行研究, 并從中獲得多種類型的化合物, Li等[28]前期從一株海藻內(nèi)生菌EN-399中獲得多個(gè)新的枝孢菌素, 該類化合物多具有抗菌及細(xì)胞毒活性, Wu等[29]從太平洋深海沉積物來源的一株真菌中獲得5個(gè)新的聚酮類化合物cladosins A—E。Yu等[30]從南海燈芯柳珊瑚內(nèi)生真菌中獲得6個(gè)甾體及1個(gè)甾體皂苷, 其中新的孕甾烷3-hydroxy-7-ene-6, 20-dione具有潛在的抗病毒活性, Zhang等[31]從海南島紅樹林木欖屬植物的內(nèi)生真菌.MA-299中獲得4個(gè)12元大環(huán)內(nèi)酯類新化合物, 該類化合物對水生菌及植物病原體均具有較好的抑制作用, 此外, 也有學(xué)者通過代謝調(diào)控的方法, 如給培養(yǎng)基中加入組蛋白去乙?；敢种苿﹣砀淖兙甑拇x途徑, 進(jìn)而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的化合物, 李德海課題組利用此方法從馬里亞納海溝沉積物來源的L3P3中獲得了4個(gè)特胺酸類化合物cladosins H—K, 其中一個(gè)化合物具有潛在的細(xì)胞毒活性[32]。本研究對南極普里茲灣海洋沉積物中獲得的兩株枝孢霉屬真菌spNJF4和NJF6的次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究, 獲得20個(gè)化合物?；衔锝Y(jié)構(gòu)類型包括甾醇(1)、倍半萜類(7—8)、生物堿類(9—14)、二酮哌嗪(2—5、15—17)、芳香酸(6、18—19)等, 其中倍半萜類(7—8)首次從枝孢霉屬真菌中分離得到, 化合物12為苯乙胺, 是一種內(nèi)源性神經(jīng)胺, 被認(rèn)為是人體的天然安非他明(PEA), PEA被認(rèn)為在偏頭痛、頭痛和攻擊性的病因中起著一定的作用[33]。化合物13為3-醛基吲哚, 對恰加斯病的病原體克氏錐蟲起抑制作用, 顯示出一定的抑制活性(IC50=26.9 μmol·L–1), 對Vero細(xì)胞具有中等的細(xì)胞毒性[34]?；衔?4具有提升血壓和興奮子宮等藥效作用 , 經(jīng)過加工處理, 可用于治療偏頭痛和診斷嗜鉻細(xì)胞瘤, 目前主要用于制做降低血脂藥品Bezafibrate[35]。本研究雖然為豐富南極微生物次級代謝產(chǎn)物庫奠定了一定的研究基礎(chǔ), 但兩株菌株次級代謝產(chǎn)物種類較少, 獲得的化合物結(jié)構(gòu)類型與其他研究結(jié)果相比也較為簡單, 猜測可能為單一的YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)、且培養(yǎng)條件較為簡單的緣故。雖然本課題組在前期也嘗試過利用5種不同培養(yǎng)基對NJF6的代謝產(chǎn)物多樣性進(jìn)行分析, 并選擇了代謝產(chǎn)物多樣性最為豐富的YPD培養(yǎng)基作為發(fā)酵條件, 但是從研究結(jié)果來看, 仍然未得到較為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。后期將進(jìn)一步優(yōu)化真菌的發(fā)酵條件, 嘗試使用不同的海洋真菌培養(yǎng)基, 嘗試適合的代謝調(diào)控方法, 擴(kuò)大發(fā)酵規(guī)模并富集微量成分, 以期獲得較為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)新穎性化合物。

綜上所述, 對南極海洋來源真菌多樣性及活性次級代謝產(chǎn)物的研究雖然取得了一定進(jìn)展, 但與溫帶和熱帶真菌研究相比仍處于初級階段, 缺少系統(tǒng)性和持續(xù)性。這可能是由于南極海洋極端的環(huán)境、樣品采集困難等因素使南極海洋真菌多樣性、次級代謝產(chǎn)物以及生態(tài)功能的研究受到了極大的限制。但已有的研究結(jié)果顯示南極海洋真菌具有極大的物種資源和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的潛力, 因此有必要繼續(xù)探索菌株分離的新方法, 同時(shí)采用新技術(shù)在物種多樣性、功能基因挖掘和代謝產(chǎn)物調(diào)控等方面開展相關(guān)研究, 從而為南極海洋真菌資源的利用做出貢獻(xiàn)。

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SECONDARY METABOLITES from THE Antarctic FunGIsp. NJF4 AND NJF6

Chang Junnan1,2, Tian Xiaoqing2, Fan Chengqi2, Huang Jinchang2, Lu Yanan2, Han Qinghua2

(1Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;2Key Laboratory of East China Sea & Oceanic Fishery Resources Exploitation and Utilization, Ministry of Agriculture, East China Sea Fisheries Research Institute, Shanghai 200090, China)

Antarctic microorganisms exhibit considerable uniqueness and biodiversity because of their harsh and special habitat. Their secondary metabolites have become an important source of bioactive substances. Research on polar microbial secondary metabolites has gradually increased in recent years, but still lags behind temperate and tropical microbial research. We conducted chemical analyses on two fungi (sp. NJF4 and NJF6) in marine sediments from Prydz Bay, Antarctica. Twenty compounds were isolated, including sterol (1), sesquiterpenes (7—8), alkaloids (9—14), diketopiperazines (2—5, 15—17), and aromatic acids (6, 18—19). The sesquiterpenoids (7—8) were isolated from this genus for the first time. This study provides a new theoretical basis to fully exploit the metabolic potential of the Antarctic microorganisms, and will play an important role in promoting research on the medicinal value of polar microbial resources.

Antarctic fungi, secondary metabolites, isolation and purification, structural identification

2019 年4 月收到來稿, 2019 年5 月收到修改稿

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(2012AA092105)資助

常俊男, 女, 1990 年生。碩士研究生, 研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail: 13262601452@163.com

韓清華, E-mail: qh.han@outlook.com

10. 13679/j.jdyj.20190020