范 欣 肖 盟 張延海 張 戈 楊 洋 段思蒙 張京家 康 巍 徐英春*

臨床微生物檢驗在感染性疾病診斷、用藥指導以及抗菌藥物管理等方面都扮演著非常重要的角色。近年來，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(matrixassisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)在臨床病原微生物鑒定方面的應用，極大提高了微生物檢驗報告的時效性，給該領域帶來了革命性的改變[1-2]。目前，國內(nèi)大型醫(yī)療機構在用的MALDI-TOF MS系統(tǒng)多以法國梅里埃公司的Vitek MS和德國布魯克公司的質(zhì)譜儀為主，臨床對于國產(chǎn)質(zhì)譜儀性能的認知還存在一定的欠缺。為此，本研究將對國產(chǎn)Clin-TOF-Ⅱ型MALDI-TOF MS系統(tǒng)及其搭載的BioExplorer V2.3臨床微生物菌種鑒定數(shù)據(jù)庫(Clin-TOF質(zhì)譜系統(tǒng))在酵母菌的鑒定效能方面進行評估，以期為臨床使用提供一定的指導。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

國產(chǎn)MALDI-TOF MS系統(tǒng)：Clin-TOF-Ⅱ型儀器(北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司)；臨床微生物菌種鑒定數(shù)據(jù)庫BioExplorer V2.3(北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司)。

1.2 菌株來源

研究菌株選自中國侵襲性真菌監(jiān)測網(wǎng)(China Hospital Invasive Fungal surveillance Net，CHIFNET)全國24家醫(yī)療機構臨床常分離的的侵襲性感染酵母菌。納入25個菌種，總計156株菌株。其中，念珠菌屬14個菌種，共126株，新型隱球菌11株；其他9個菌種，共19株(表1)。所有入組菌株復蘇后，接種至科馬嘉念珠菌顯色平板，于35 ℃孵育48～72 h后，選取單菌落再次轉種至賽保羅平板于35 ℃，孵育48～72 h純培養(yǎng)。

1.3 研究設計

所有菌株采用玻璃珠震蕩煮沸法提取總DNA[3]。內(nèi)轉錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)擴增并測序，準確鑒定至種水平[4]。并以此結果為“金標準”，評估Clin-TOF質(zhì)譜系統(tǒng)的鑒定效能。

Clin-TOF質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定采用直接涂抹法，選取少量純培養(yǎng)菌直接涂抹于靶板，滴加1μl配套試劑I，其主要成分為乙腈、甲酸和三氟乙酸；室溫干燥后滴加1μl配套試劑Ⅱ，其主要成分為乙腈、三氟乙酸和α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)。室溫干燥后上機檢測分析。根據(jù)產(chǎn)品使用說明，Clin-TOF質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定分值≥25.00為鑒定結果可信；分值在20.00～24.99之間建議重新檢測或補充實驗幫助鑒定；分值＜20.00為結果不可信。

1.4 術語定義

(1)準確鑒定：系統(tǒng)鑒定結果可信，并與分子方法鑒定結果種水平一致。

(2)無鑒定結果：Clin-TOF質(zhì)譜系統(tǒng)重復兩次，鑒定結果分值均＜25.00。

(3)顯著錯誤(major error)：Clin-TOF質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定結果與參考方法鑒定結果不一致。

(4)小錯誤(minor error)：指無法區(qū)分種復合體內(nèi)的菌種，本次評估涉及白念珠菌(Candida albicans)，都柏林念珠菌(Candida dubliniensis)鑒定為白念珠菌復合體(Candida albicans complex)。

(5)可接受結果：鑒于臨床需要，評估準確鑒定、小錯誤以及不在庫菌種無鑒定結果被視為“可接受的結果”。

2 結果

經(jīng)與測序結果比較，本次評估中Clin-TOF質(zhì)譜系統(tǒng)對酵母菌準確鑒定率達到95.5%(149/156)。其中，念珠菌屬鑒定準確率為96.8%(122/126)；11株新型隱球菌中有1株錯誤鑒定為“季也蒙念珠菌”，鑒定準確率為90.9%(10/11)；其他19株少見酵母菌中，僅有1株Pichia caribbica鑒定錯誤，鑒定準確率為94.7%(18/19)。白念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠的5種臨床最常見念珠菌(菌)的鑒定準確率為97.2%(105/108)。菌種數(shù)量及鑒定準確率評估見表1。

表1 菌種數(shù)量及鑒定準確率評估

在評估納入的菌種中，都柏林念珠菌、橡樹念珠菌及P.caribbica均不在Clin-TOF質(zhì)譜系統(tǒng)可鑒定菌種數(shù)據(jù)庫中。都柏林念珠菌被鑒定為“白念珠菌復合體”；橡樹念珠菌經(jīng)兩次上機，均無法鑒定。但Pichia caribbica被錯誤鑒定為“季也蒙念珠菌”。因此，總體可接受結果96.8%(151/156)。此外，評估納入的近平滑念珠菌復合體中的2株似平滑念珠菌(C.metapsilosis)以及光滑念珠菌復合體中的1株Candida nivariensis都準確鑒定到了種水平。

3 討論

MALDI-TOF MS技術對于臨床微生物鑒定的成功率會受到菌株蛋白質(zhì)提取難易程度的影響。相比于細菌，酵母菌細胞壁成分更加復雜，更難裂解，因此鑒定也更加困難[5-6]。此次評估中，對于五種臨床最常見的念珠菌，Clin-TOF質(zhì)譜系統(tǒng)的鑒定準確率能夠達到97.2%，其中熱帶念珠菌、光滑念珠菌和近平滑念珠菌的準確率能夠達到100%。但仍然有1株白念珠菌和2株近平滑念珠菌鑒定錯誤。與VITEK質(zhì)譜相比，Clin-TOF質(zhì)譜系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫包含了近平滑念珠菌復合群中的似平滑念珠菌(C.metapsilosis)和擬平滑念珠菌(C.orthopsilosis)[7]以及光滑念珠菌復合群中的C.nivariensis[8]。雖然在本次評估納入的2株似平滑念珠菌及1株C.nivariensis均準確鑒定到了種水平。但是有1株近平滑念珠菌被錯誤鑒定為“似平滑念珠菌”，因此，Clin-TOF質(zhì)譜系統(tǒng)對于近平滑念珠菌復合群和光滑念珠菌復合群中菌種的鑒定效能還要更大樣本量進行評估。都柏林念珠菌與白念珠菌在科馬嘉顯色培養(yǎng)基上非常相似，均為淺綠色[9]。但是Clin-TOF質(zhì)譜系統(tǒng)菌種數(shù)據(jù)庫中并不包含都柏林念珠菌。因此，本次評估納入的唯一1株都柏林念珠菌被鑒定為“白念珠菌復合體”。

新型隱球菌復合體，包括新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)和格特隱球菌(Cryptococcus gattii)，是臨床上重要的致病真菌，常侵襲中樞神經(jīng)系統(tǒng)，因此，有著非常重要的臨床意義[10]。目前，Clin-TOF質(zhì)譜系統(tǒng)改版本數(shù)據(jù)庫并不包含格特隱球菌，而且本次評估也并未納入格特隱球菌，僅納入的11株新型隱球菌中有1株出現(xiàn)了顯著錯誤。新型隱球菌復合體內(nèi)菌種的準確鑒定對于進口產(chǎn)品Vitek MS同樣存在無法區(qū)分的問題，因此對于少見隱球菌數(shù)據(jù)庫圖譜的建設和完善尤為重要。

4 結論

國產(chǎn)的Clin-TOF質(zhì)譜系統(tǒng)相比于進口的Vitek MS系統(tǒng)，搭載的菌種鑒定數(shù)據(jù)庫BioExplorer的后續(xù)建設及完善更加積極、主動；其鑒定數(shù)據(jù)庫涵蓋的真菌菌種也更加符合國內(nèi)臨床分離真菌的流行病學分布。此外，Clin-TOF質(zhì)譜系統(tǒng)采用的是不銹鋼制的靶板，使得后續(xù)臨床應用的耗材成本顯著降低。

本研究的評估結果表明，Clin-TOF質(zhì)譜系統(tǒng)在酵母樣真菌鑒定方面已經(jīng)可以基本滿足臨床需求，然而對于一些菌種復合體中的菌種指紋圖譜仍然需要進一步的優(yōu)化和完善。