李飛飛， 魏 悅， 范 毅， 宋夢嬌， 王學(xué)方， 李自紅

（1.河南省生物技術(shù)開發(fā)中心，鄭州 450002； 2.河南科高中標(biāo)檢測技術(shù)有限公司，鄭州 450002）

柏樹（Platycladus orientalis（L.）Franco.）為柏科側(cè)柏屬的一種常綠喬木，在中國分布極廣，北起內(nèi)蒙古、吉林，南至廣東及廣西北部［1］. 柏樹果殼是柏樹結(jié)的果實(shí)外殼，柏樹葉中富含葉綠素、黃酮、精油等活性成分，其中柏葉油可用于香皂、洗滌劑和其他日用化學(xué)品的加香. 黃酮類成分有明顯的抗?jié)?、止血、解痙、抗菌、抗炎、降血脂、鎮(zhèn)痛、提高雌性激素等生物活性和生理活性作用［2-7］，是一類具有廣泛開發(fā)前景的天然抗氧劑. 研究發(fā)現(xiàn)3-蒈烯［7］具有殺菌抗炎作用，蛇麻烯已發(fā)現(xiàn)具有抗炎作用，并有可能成為一種有效的治療炎癥性疾病或工具. β-水芹烯對儲糧常見害蟲具有明顯的殺滅和抑制作用. 研究表明，柏樹葉揮發(fā)油研究得比較多，而對柏樹果殼的研究頗少，本課題組以柏樹果殼（干殼）為原料，經(jīng)過提取、干燥、濃縮得到柏樹果殼揮發(fā)油，采用氣質(zhì)聯(lián)用對其揮發(fā)油成分進(jìn)行分析，并對其揮發(fā)油成分進(jìn)行抗菌活性研究.

1 試驗材料

1.1 原料與試劑

柏樹果殼（干殼）采自安陽林州太行山脈；蒸餾水；無水硫酸鈉（分析純，650 ℃灼燒5 h）；甲醇（分析純）；固體試劑干燥處理冷卻后均于干燥器中密閉保存. 標(biāo)準(zhǔn)菌株鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311（批號14030301），肺炎鏈球菌ATCC49619（批號14040201），大腸埃希菌ATCC 25922（批號14030301），化膿性鏈球菌ATCC19615（批號14031401），金黃色葡萄球菌ATCC 29213（批號14030701），均購自南京便診生物科技有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀GCMS-QP2010Ultra（日本島津公司）；98-1-C電熱套（天津泰斯特儀器有限公司）；JJ5000A電子天平（常熟市測試儀器有限公司）；ME204萬分一天平（梅特勒-多利多國際股份有限公司）；超聲波提取儀KQ-500E（昆山舒美超聲儀器有限公司）.

2 實(shí)驗方法

2.1 揮發(fā)油的提取

2.1.1 水蒸氣蒸餾法 按照2015版中國藥典第四部2204揮發(fā)油測定法測定［8］，將樣品烘干、粉碎、過篩，稱取100 g，用干凈紗布分包置于2000 mL 圓底蒸餾燒瓶中，加入1500 mL 蒸餾水，浸泡過夜. 水蒸氣蒸餾7 h至揮發(fā)油量不再增加為止，收集樣品，用甲醇溶解揮發(fā)油，無水硫酸鈉干燥過夜，次日用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀常壓濃縮，得淡黃色透明油狀液體. 揮發(fā)油含量按式（1）計算，

2.1.2 超聲波提取法 超聲波法提取柏樹果殼中石油醚效果最佳，因此選作石油醚提取溶劑. 稱取10 g柏樹果殼粉末置于三角瓶中，加入200 mL石油醚，40 ℃下提取1 h，提取液過濾，濾液減壓蒸餾除去溶劑，得柏樹果殼油.

2.1.3 索氏提取法 索氏提取法提取柏樹果殼中石油醚效果最佳，因此選作石油醚提取溶劑. 稱取10 g柏樹果殼粉末用濾紙包好后放入索氏提取裝置中，瓶內(nèi)加入200 mL石油醚，100 ℃下提取3 h，提取液過濾，濾液減壓蒸餾除去溶劑，得柏樹果殼油.

2.2 揮發(fā)油的測定

2.2.1 氣相色譜及質(zhì)譜條件 Rxi-5ms色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；電離方式：EI；離子源溫度：230 ℃；接口溫度：270 ℃；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；程序升溫：40 ℃保持1 min，以5 ℃/min升至130 ℃，保持0.5 min，然后以5 ℃/min升至250 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升至290 ℃；分流比：15∶1；吹掃流量：3.0 mL/min；溶劑延遲時間：5.0 min；質(zhì)量掃描范圍m/z：30～600 amu；電子能量：70 eV；進(jìn)樣量：1.0 μL；載氣：氦氣.

2.2.2 揮發(fā)油成分分析 取柏樹果殼（干殼）揮發(fā)油的甲醇溶液1.0 μL，采用2.2.1中GC-MS 條件進(jìn)行分析鑒定，得出總離子流色譜圖. 對總離子流中的各色譜峰進(jìn)行質(zhì)譜掃描，通過NIST14標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫，并核對有關(guān)文獻(xiàn)［9-13］，確定其化學(xué)成分. 采用峰面積歸一化法進(jìn)行定量分析，得出各化學(xué)成分在揮發(fā)油中的相對含量，化學(xué)分子式及化學(xué)名稱.

2.3 體外抗菌活性的測定

2.3.1 菌株的復(fù)蘇 將5種供試菌先進(jìn)行斜面復(fù)蘇，復(fù)蘇后接種于固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12～24 h［14-16］.

2.3.2 菌懸液的制備 從固體平板上挑取單個菌落接種到液體培養(yǎng)基中，制成濃度為1×106～1×108CFU·mL-1的菌懸液［17-20］，備用.

2.3.3 抑菌圈的測定利用管碟法 測定索氏提取方法提取柏樹果殼揮發(fā)油的抑菌圈活性. 其中，配制樣品的質(zhì)量濃度為50、100、200 mg/L，陽性藥物阿莫西林的濃度為100 mg/L，每個平板涂布的菌液量為25 μL，每個牛津杯中添加的溶液量為200 μL. 之后將各平板于37 ℃培養(yǎng)24 h［15-16］，觀察并測量抑菌結(jié)果.

3 結(jié)果與分析

3.1 不同提取方法揮發(fā)油含量的比較

本文采用3種不同的提取方法提取柏樹果殼揮發(fā)油，分別按照式（1）進(jìn)行計算，水蒸氣蒸餾法、超聲提取法和索氏提取法得到的揮發(fā)油含量分別為：2.7%、2.5%和3.0%. 根據(jù)含量選擇采用索氏提取法，以石油醚做溶劑提取柏樹果殼揮發(fā)油.

3.2 揮發(fā)油成分分析

根據(jù)2.2 項下的方法對柏樹果殼油進(jìn)行氣質(zhì)定性分析，總離子流色譜圖見圖1，確定了26 種化學(xué)成分，其化合物組成及相對含量見表1，從表中可知α-蒎烯相對含量三種提取方法都在55%以上，β-水芹烯和3-蒈烯相對含量在5%以上.

圖1 柏樹果殼（干殼）索氏提取揮發(fā)油的GC/MS總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of the soxhlet extraction volatile oil from the cypress nut shell（dry nut shell）

表1 柏樹果殼（干殼）揮發(fā)油的化學(xué)成分Tab.1 Chemical constituents of the volatile oil from the cypress nut shell（dry nut shell）

續(xù)表

3.3 抑菌實(shí)驗結(jié)果

采用2.3項下抑菌實(shí)驗方法進(jìn)行試驗，結(jié)果見表2，柏樹果殼揮發(fā)油在100 mg/L濃度下對金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌抑菌效果較好，抑菌圈表明其顯示高度敏感性.

表2 柏樹果殼（干殼）揮發(fā)油對5種供試菌的抑菌圈檢測Tab.2 Bacteriostatic circle detection of five test strains by the volatile oil from the cypress nut shell（dry nut shell）

4 結(jié)論

本實(shí)驗采用水蒸氣蒸餾、索氏提取和超聲波提取3種方法提取柏樹果殼油，比較了不同方法提取物的揮發(fā)油含量，結(jié)果表明，索氏提取揮發(fā)油含量較高，化學(xué)組成成分最多. 水蒸氣蒸餾、超聲提取和索氏提取物分別可鑒定出19、19、26種組分，占總含量的95%以上. 通過分析比較得出，柏樹果殼（干殼）的揮發(fā)性化學(xué)成分主要有不飽和烯烴成分、酯類和甾醇類. 通過抑菌實(shí)驗表明，柏樹果殼揮發(fā)油在不同濃度下，對5種供試菌表現(xiàn)出不同程度的敏感性，相同濃度條件下，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈大于對照藥劑阿莫西林，化膿性鏈球菌和鼠傷寒沙門氏菌的抑菌圈與對照藥阿莫西林相當(dāng)，柏樹果殼揮發(fā)油的抑菌效果較好，為下一步研究開發(fā)奠定基礎(chǔ). 其中，揮發(fā)油中不飽和烯烴大部分可以用于香料制作的中間體，柏樹葉、柏果和柏樹果殼的化學(xué)成分是不相同的. 以往人們對柏樹的研究只局限在柏葉和柏果，忽略了柏樹果殼，沒能充分認(rèn)識柏樹的完整價值，柏樹果殼（干殼）的化學(xué)成分和產(chǎn)品開發(fā)研究還有待進(jìn)一步的深入.