李啟艷，于海英，胡德福，孫德軍，崔基煒

(1 山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101；2 山東大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山東 濟南 250100)

喹諾酮類(quinolones,QNs)藥物是一類人工合成的含 4-喹諾酮母核的藥物，是近年來迅速發(fā)展起來的新一代高效、廣譜抗菌藥物。這類藥物的基本結(jié)構(gòu)為 1,4-二氫-4-氧代吡啶-3-羧酸，其結(jié)構(gòu)見圖 1。在母核結(jié)構(gòu)的 1、5、6、7、8 位加上不同的基團，即構(gòu)成不同的 QNs。且母環(huán)兩個環(huán)基本上處于同一個平面。

喹諾酮類主要用于細菌治療所致的呼吸道、咽喉、皮膚及軟組織的急、慢性感染，使用含有喹諾酮類的化妝品，短期內(nèi)會產(chǎn)生祛痘、抗粉刺的作用，如果長期使用，會引起接觸性皮炎、抗生素過敏等癥狀，易產(chǎn)生耐藥性；藥物殘留還可能導(dǎo)致全身過敏反應(yīng)等，原國家食品藥品監(jiān)督管理總局已將氧氟沙星列為化妝品中禁止添加成分。

對喹諾酮類的殘留檢測一直是研究人員關(guān)注的重點，目前對喹諾酮類的檢測技術(shù)較多，主要是快速檢測和儀器檢測技術(shù)。其中快速檢測技術(shù)主要是酶免疫分析技術(shù)[1-3]，儀器檢測技術(shù)主要包括高效液相色譜(HPLC)[4-5]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)[6-8]，儀器檢測技術(shù)具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，通常作為氟喹諾酮類抗生素的確證檢測技術(shù)而廣泛應(yīng)用。然而儀器檢測技術(shù)需要昂貴、精密的儀器設(shè)備，而且對樣品的預(yù)處理和操作人員的要求較高，不利于用于大量樣品的檢測和現(xiàn)場的快速檢測。基于抗壓抗體特異性識別的快速檢測技術(shù)則不受這些條件的限制，尤其是酶免疫分析技術(shù)以其快速、高通量等優(yōu)點被廣泛用于氟喹諾酮類抗生素的快速篩查研究。

基于抗體的酶聯(lián)免疫分析與化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)相結(jié)合建立化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)(Chemiluminiscence enzyme-linked immunosorbent assay，CL-ELISA)，該方法能夠大大地提高檢測方法的靈敏度，目前主要用于檢測水產(chǎn)品以及動物源性食品中的氟喹諾酮類抗生素，而在化妝品中的檢測尚未見相關(guān)報道。本研究建立了基于氧氟沙星包被原、酶標(biāo)抗氧氟沙星族特異性單克隆抗體的檢測祛痘化妝品中氟喹諾酮類抗生素的高特異性直接競爭CL-ELISA檢測技術(shù)，樣品提取采用超聲輔助磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)提取，提取技術(shù)簡便，易于操作。采用直接競爭CL-ELISA方法進行檢測，一方面反應(yīng)過程無需加入酶標(biāo)二抗的反應(yīng)步驟，節(jié)省了反應(yīng)時間，另一方面，采用化學(xué)發(fā)光底物進行檢測，提高反應(yīng)的靈敏度。本方法快速、靈敏、重復(fù)性好，可用于祛痘類化妝品中氟喹諾酮類抗生素的檢測。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑 氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星均購于美國Sigma公司；氧氟沙星包被原、酶標(biāo)抗氧氟沙星單克隆抗體由北京澤揚生物科技有限公司提供；SuperSignal化學(xué)發(fā)光底物購于美國Pierce公司；其他試劑均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

微量可調(diào)移液器購于德國Eppendorf公司；不透明化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板購于美國Costar公司；Veritas微孔板發(fā)光檢測儀購于美國Turnet Biosysterm公司；恒溫培養(yǎng)箱購于上海精密試驗設(shè)備有限公司。

1.2 制備抗體標(biāo)記物

1.2.1 使用高碘酸鈉(NaIO4)對辣根過氧化物酶(HRP)進行活化。

1.2.2 將活化后的辣根過氧化物酶與氧氟沙星抗體IgG進行偶聯(lián)反應(yīng)。

1.2.3 加入NaBH4飽和甲醇溶液中進行還原反應(yīng)，獲得辣根過氧化物酶-氧氟沙星抗體標(biāo)記物。

1.3 直接競爭CL-ELISA程序

1.3.1 包被：每孔加入按一定比例包被緩沖液(0.05 mol·L-1,pH 9.6 的碳酸鹽緩沖液)稀釋好的包被原100 μL，37 ℃包被 2 h，倒出孔內(nèi)液體，用洗滌液(含0.05%磷酸鹽緩沖液)洗滌3遍，拍干。

1.3.2 封閉：每孔加入封閉液(5%小牛血清) 200 μL，37 ℃孵育 1 h，倒出孔內(nèi)液體，洗滌液洗3遍，拍干備用。

1.3.3 競爭反應(yīng)：每孔加入 50 μL 氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品(或前處理后的樣品)，再加入50 μL PBS稀釋的酶標(biāo)氧氟沙星單克隆抗體混勻后室溫孵育 60 min，倒出孔內(nèi)液體，洗滌液洗5遍，拍干。

1.3.4 測定：每孔加入 100 μL 發(fā)光底物SuperSignal(發(fā)光底物現(xiàn)用現(xiàn)配)，搖動使之均勻孵育 2 min后用化學(xué)發(fā)光測定儀測定化學(xué)發(fā)光強度(relative light units,RLU)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)儲備液及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，儲備液終濃度為1 mg·mL-1，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取儲備液100 μL，加PBS稀釋至1 000 ng·mL-1作為起始濃度，依次做3倍稀釋，配置標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，共10個濃度，按照“1.2”進行操作，繪制氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線。

每個濃度對應(yīng)的發(fā)光值除以最大的發(fā)光值(未加入標(biāo)準(zhǔn)品時)(B/B0)所得到的值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，用軟件 Origin8.0 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立四參數(shù)回歸方程?；貧w方程為：

Y={(A-D)/[1+(X/C)B]}+D

其中A和D分別代表無藥物和本底分別對應(yīng)的值，B為曲線拐點處的斜率，C 為半數(shù)抑制率，即IC50，是方法的主要參考參數(shù)，方法以IC10作為檢測限(limit of detection,LOD)，IC20～IC80為方法的檢測范圍。

1.5 特異性試驗 選擇氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星等氟喹諾酮類似物作為競爭物，參照上述方法進行直接競爭CL-ELISA檢測，分別計算IC50值，計算交叉反應(yīng)率(cross reactivity,CR)。

交叉反應(yīng)率(%)=(抑制50%氧氟沙星的濃度/抑制50%的氧氟沙星類似物濃度)×100%

1.6 待測樣品的前處理 稱取祛痘化妝品試樣1.00 g(精確至 0.01 g)于 50 mL離心管中，加入10 mL PBS，渦旋震蕩30 s，然后在超聲清洗儀中超聲3 min充分提取，靜置后取部分溶液置于 2 mL離心管中，4 ℃ 12 000 g·min-1離心10 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜待測。

1.7 準(zhǔn)確度精密度研究 向空白樣品中添加氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品至終濃度為 5、20和100 ng·mL-1。每個濃度添加的樣品做5個平行，連續(xù)做3 d，樣品按上述方法操作測定發(fā)光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中氧氟沙星含量，并計算添加回收率，計算日內(nèi)和日間變異系數(shù)。

2 結(jié)果和討論

2.1 最佳包被原和酶標(biāo)抗體稀釋度確定 采用方陣法測定，將包被抗原倍比稀釋成不同的濃度進行包被酶標(biāo)板，每孔 100 μL，酶標(biāo)氧氟沙星 單克隆抗體倍比稀釋成不同濃度加入酶標(biāo)板，不加入包被原作為空白對照，按照上述直接競爭CL-ELISA方法進行測定，結(jié)果見表1。

表1 包被原和抗體最佳稀釋倍數(shù)研究

注：表中數(shù)據(jù)均是科學(xué)計數(shù)法省略的表示，如 3.88 原型為 3.88×106，為了簡便且便于比較，只保留整數(shù)部分

由表可知，包被原濃度較高時，其濃度降低對發(fā)光值的影響不大。當(dāng)包被原稀釋度為 1∶8 000時的發(fā)光值讀數(shù)穩(wěn)定，當(dāng)稀釋倍數(shù)大于8 000，發(fā)光值下降幅度較大，表明包被原在1∶8 000 稀釋度下可以與抗體進行充分的反應(yīng)，因此選擇1∶8 000為包被原最佳稀釋度?？贵w稀釋倍數(shù)過小會導(dǎo)致發(fā)光值過大，不利于競爭反應(yīng)，而抗體稀釋倍數(shù)過大則會導(dǎo)致發(fā)光值偏小，讀數(shù)波動大，結(jié)果不穩(wěn)定。綜合以上各種因素，確定包被原的稀釋度為 1∶8 000，抗體的最佳稀釋度為 1∶100 000。

2.2 競爭反應(yīng)中標(biāo)準(zhǔn)品與抗體的比例的確定 分別設(shè)定不同的標(biāo)準(zhǔn)品與抗體比例進行競爭反應(yīng)，比例設(shè)定為 30∶70、50∶50、70∶30 三組，按照上述程序進行檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計算 IC50值及RLU max/IC50比值，結(jié)果見表2。由表可知標(biāo)準(zhǔn)品與抗體體積比為 50∶50 時，靈敏度最高，3組RLU max /IC50值差別不大，因此選擇標(biāo)準(zhǔn)品與抗體比例為50∶50。

表2 標(biāo)準(zhǔn)品與抗體比例研究

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限和檢測范圍 按照“1.3”項下的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2，曲線方程為：

Y={(0.936 2-0.051 3)/[1+(X/18.652 3)0.9214]}+0.051 3

本方法的IC50為18.652 3 ng·mL-1，檢測限LOD(IC10)為2.0 ng·mL-1，檢測范圍(IC20～IC80)為4.1～104.6 ng·mL-1。

2.4 特異性 選取與氧氟沙星結(jié)構(gòu)相似的恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星等其他化合物進行方法特異性研究(結(jié)果見表3)。由表可知，本方法對氟喹諾酮類抗生素有較好的交叉反應(yīng)12.5%～128.6%，可用于氟喹諾酮類的檢測。

表3 交叉反應(yīng)率測定結(jié)果

2.5 準(zhǔn)確度和精密度 準(zhǔn)確稱取空白化妝品1.00 g，添加氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品至終濃度為 10、20和100 ng·g-1，渦旋震蕩混勻，按照所建立的CL-ELISA方法進行檢測，結(jié)果見表4。平均回收率范圍在82.7%～99.6%，日內(nèi)變異系數(shù)低于9.8%，日間變異系數(shù)低于8.2%。

表4 祛痘化妝品中氧氟沙星準(zhǔn)確度精密度測定

2.6 實測樣本 采集當(dāng)?shù)仂疃活惢瘖y品20份，樣品經(jīng)本研究所建立的方法進行檢測，結(jié)果共檢測到3個樣品氟喹諾酮類抗生素呈陽性，濃度分別為14 ng·mL-1，18 ng·mL-1和11 ng·g-1，陽性率15%。

3 結(jié)論

本方法中改良的高碘酸鈉法采用飽和NaBH4甲醇溶液進行還原反應(yīng)，克服了NaBH4水溶液極易被氧化、不能長期保存的缺點，從而避免了該溶液現(xiàn)用現(xiàn)配的限制；直接競爭化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)提高了檢測效率和檢測的靈敏度；采用高靈敏的魯米諾化學(xué)發(fā)光底物替代傳統(tǒng)的TMB底物，極大程度地提高了反應(yīng)的靈敏度；通過建立工作曲線可以快速、準(zhǔn)確地得到氟喹諾酮類抗生素殘留的濃度，降低了檢測和計算的復(fù)雜程度，適用于廣泛的基層檢測工作的應(yīng)用。