丁亞茹 陳玉藍(lán) 林正全 拓陽陽 李斌 李紅麗 王巖

摘? 要：為有效防治土傳病害，利用16S rRNA和18S rRNA基因測序分析了成熟期健康與易感病煙田根際土壤微生物群落組成差異，并研究了微生物與理化性質(zhì)，酶活性之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，norank_p_Saccharibacteria、norank_o_Gaiellales、Nocardioides、norank_o_Sordariales和Pseudallescheria是造成健康與易感病煙田根際土壤微生物群落組成差異的關(guān)鍵物種。土壤有機(jī)質(zhì)、全磷、全氮、有效磷、堿解氮、蛋白酶、脲酶、過氧化氫酶和磷酸酶在健康與易感病煙田中差異極顯著。煙田根際微生物與土壤性質(zhì)之間的相關(guān)性表現(xiàn)為，Nocardioides與有機(jī)質(zhì)（r=0.943）和磷酸酶（r=0.941）極顯著正相關(guān)，與過氧化氫酶（r=?0.880）和蛋白酶（r=?0.829）顯著負(fù)相關(guān)，norank_o_Sordariales與有機(jī)質(zhì)（r=0.829）、全磷（r=0.943）、堿解氮（r=0.943）和脲酶（r=0.943）極顯著正相關(guān)，與過氧化氫酶（r=?0.941）極顯著負(fù)相關(guān)。研究結(jié)果為通過調(diào)控微生物群落結(jié)構(gòu)防治煙草土傳病害提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：根際土壤;群落組成;理化性質(zhì);酶活性;相關(guān)性

Study on Microbial Community Composition in Rhizosphere Soil of Tobacco Fields with Different Disease Incidence Rates

DING Yaru¹， CHEN Yulan²， LIN Zhengquan³， TUO Yangyang⁴， LI Bin^4*， LI Hongli^1*， WANG Yan¹

（1.College of Chemical Engineering and Energy， Zhengzhou University， Zhengzhou 450001， China; 2. Liangshan Prefecture Company of Sichuan Tobacco Company， Xichang， Sichuan 615000， China; 3. Ningnan Branch of Liangshan Prefecture Company of Sichuan Tobacco Company， Ningnan， Sichuan 615400， China; 4. Sichuan Provincial Tobacco Company Liangshan Company Dechang Branch， Dechang， Sichuan 615500， China）

Abstract： To effectively prevent the occurrence of soil-borne diseases， 16S rRNA and 18S rRNA gene sequences were used to analyze the differences in microbial community composition between rhizosphere soils of healthy and susceptible tobacco fields during the mature period， and the correlations between physicochemical properties， enzyme activity and microorganisms were studied. The results showed thatnorank_p_Saccharibacteria，norank_o_Gaiellales，Nocardioides， norank_o_Sordariales and Pseudallescheriawere the key genus causing differences in microbial community composition between healthy and susceptible tobacco fields. There were significant differences in organic matter， total phosphorus， total nitrogen， available phosphorus， alkaline nitrogen， protease， urease， catalase and phosphatase in the soils of healthy and susceptible tobacco fields. And the correlations between rhizosphere microbial and soil properties in tobacco fields are the following：Nocardioideswas significantly positively correlated with organic matter （r=0.943）， phosphatase （r=0.941）， was significantly negatively correlated with catalase （r=?0.880） and protease （r=?0.829）.norank_o_Sordarialeswas significantly positively correlated with organic matter （r=0.829）， total phosphorus （r=0.943）， alkaline nitrogen （r=0.943）， urease （r=0.943）， and extremely significantly negative correlation with catalase （r=?0.941）. The results provide a theoretical basis for controlling soil-borne diseases of tobacco by regulating the structure of microbial communities.

Keywords： rhizosphere soil; community composition; physicochemical properties; enzyme activity; correlation

煙草作為四川省涼山州的支柱性產(chǎn)業(yè)，越來越受到重視。但近年來由于長期連作，煙田土傳病害越發(fā)嚴(yán)重，特別是黑脛病、青枯病、根腐病和根結(jié)線蟲，直接影響煙葉品質(zhì)及農(nóng)民收入^[1]。雖有大量關(guān)于煙田土傳病害的研究，但以往關(guān)注點(diǎn)主要在種植方式、烤煙品種、有益菌篩選等方面^[2-4]，而病害的發(fā)生受多因素的影響，關(guān)鍵還是土壤。

土壤是微生物生存的大本營，健康土壤中微生物可增加養(yǎng)分利用率、產(chǎn)生生長激素和抗病因子，進(jìn)而促進(jìn)植物生長，提高植物抗病性^[5]。但微生物群落結(jié)構(gòu)受土壤環(huán)境因素的影響較大^[6-7]，了解土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征及其與環(huán)境之間的關(guān)系顯得尤為重要。為此，本研究通過對比健康煙田（未發(fā)病或零星發(fā)?。┡c易感病煙田（以黑脛病為主的土傳病害，前兩年發(fā)病率分別為52%和50%）根際土壤微生物群落組成特征，分析其與環(huán)境因子之間的關(guān)系，探討土壤微生物群落與土傳病害的內(nèi)在聯(lián)系，為定向調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和提高土壤質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 煙田概況與取樣

取樣地點(diǎn)為四川涼山州德昌縣，經(jīng)度102°11'17''，緯度27°25'40''，海拔1560 m，烤煙品種為云煙87。2016—2017年發(fā)病率如表1所示，根據(jù)發(fā)病率，健康煙田和易感病煙田編號分別為H和S，每塊煙田面積約220 m²，土質(zhì)為砂土，2018年前茬為油菜，于2018年3月26日（移栽前），在每塊煙田隨機(jī)選5個點(diǎn)，取0～20 cm土樣，基本理化性狀如表2所示。于2018年7月26日取成熟期土樣，并按5點(diǎn)取樣法選取煙株，抖土法采集根際土壤，將土樣混勻，裝袋編號，每塊煙田3個平行樣。部分土壤裝離心管，?20 ℃保存，送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行微生物多樣性基因測序，部分土壤風(fēng)干研磨后過不同孔徑篩，用于理化性狀及酶活性的測定。

1.2? 測定方法

1.2.1? 土壤理化性質(zhì) ?土壤pH、有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、速效鉀、有效磷和堿解氮含量參照文獻(xiàn)[8]的方法測定。

1.2.2? 土壤酶活性? 土壤蛋白酶活性的測定采用福林試劑比色法^[9];蔗糖酶活性測定采用3，5-二硝基水楊酸比色法^[10];脲酶活性的測定方法為靛酚藍(lán)比色法^[10];過氧化氫酶活性測定采用容量法^[9];磷酸酶活性采用對硝基苯磷酸二鈉比色法測定^[11]。

1.2.3? 微生物基因測序 ?土壤微生物基因測序采用第二代高通量測序技術(shù)，利用多樣性基因測序?qū)熤晖寥罉颖具M(jìn)行細(xì)菌（16S rRNA）^[12]和真菌（18S rRNA）^[13]序列檢測。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用WPS 2019進(jìn)行計算處理，利用SPSS 22軟件進(jìn)行方差分析，顯著性檢驗(yàn)采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)?；驕y序利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司平臺軟件進(jìn)行分析。

2? 結(jié)? 果

2.1? 健康與易感病煙田根際土壤理化性質(zhì)及酶活性

健康與易感病煙田根際土壤理化性質(zhì)和酶活性如表3所示，從表3可看出，健康與易感病煙田根際土壤酶活性和理化性質(zhì)存在差異，其中極顯著性差異（p<0.01）有蛋白酶、脲酶、過氧化氫酶、磷酸酶活性，有機(jī)質(zhì)、全磷、全氮、有效磷和堿解氮含量，且結(jié)果顯示，除蛋白酶、過氧化氫酶活性及全鉀含量以外，其余都是易感病煙田高于健康煙田。

2.2? 根際土壤微生物在門水平上的群落組成分析

土壤微生物群落組成分析主要反映分類學(xué)水平上的群落結(jié)構(gòu)及相對豐度，圖1為健康與易感病煙田根際土壤細(xì)菌1（a）和真菌1（b）在門水平上的群落組成。由圖1（a）可知，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和綠彎菌門（Chloroflexi）總豐度在健康煙田與易感煙田分別占細(xì)菌總量的72.65%、71.59%，而厚壁菌門（Firmicutes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、糖化菌門（Saccharibacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）所占比例較低，其中健康煙田根際土壤中糖化菌門相對豐度比易感病煙田高62.75%，而厚壁菌門和芽單胞菌門在易感病煙田相對豐度分別比健康煙田高31.89%和46.23%。

由圖1（b）可知，健康與易感病煙田根際土壤真菌在門水平上有6種優(yōu)勢菌種，相對豐度最高的子囊菌門（Ascomycota），在健康與易感病煙田根際土壤相對豐度分別為77.03%和82.03%，健康煙田中擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、norank_k_Fungi、unclassified_k_Fungi和壺菌門（Chytridiomycota）相對豐度依次比易感病煙田高20.50%、65.41%、29.41%、和8.29%，易感病煙田的纖毛門（Ciliophora）比健康煙田高8.04%。

2.3? 根際土壤微生物在屬水平上的群落組成分析

屬水平上，健康與易感病煙田根際土壤微生物群落組成如圖2所示，由圖2（a）可知，健康煙田中細(xì)菌相對豐度超過2%的有鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、norank_p_Saccharibacteria、芽孢桿菌屬（Bacillus）、unclassified_f_Micrococcacea、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）和寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas），其中norank_p_ Saccharibacteria、unclassified_f_Micrococcacea和Stenotrophomonas在易感病煙田根際土壤相對含量分別比健康煙田低38.56%、61.28%和97.01%，而Sphingomonas和Bacillus分別比健康煙田高27.31%和42.91%。值得注意的是，norank_o_Gaiellales和類諾卡氏菌屬（Nocardioides）在健康煙田僅為1.94%和0.64%，而在易感病煙田中其含量為3.56%和2.42%。

2.3.1? 根際土壤微生物在屬水平上組間差異性檢驗(yàn)? 屬水平上，根腐病與青枯病的病原菌在健康和易感病煙田的相對豐度：Fusarium（5.23%，6.59%）和勞爾氏屬（Ralstonia）（0.05%，0.07%），以上兩種菌在健康煙田與易感病煙田中并不存在顯著差異。同時發(fā)現(xiàn)，移栽前，健康煙田與易感病煙田青枯病病原菌數(shù)量幾乎相同，根腐病病原菌屬則表現(xiàn)出極顯著性差異（表4）。

為找出細(xì)菌和真菌在健康與易感病土壤之間的差異性物種，將細(xì)菌和真菌在屬水平上的相對豐度數(shù)據(jù)運(yùn)用Student's T檢驗(yàn)進(jìn)行差異分析，獲取顯著性差異物種。按物種豐度降序，列出了在健康與易感病土壤之間存在顯著差異的前5種菌屬（圖3）。前5種具有顯著差異的細(xì)菌分別是norank_p_Saccharibacteria、Bacillus、norank_o_Gaiellales、Nocardioides和norank_o_Acidimicrobiales（圖3a）。其中，健康煙田中norank_p_Saccharibacteria相對豐度顯著高于易感病煙田，而Nocardioides相對豐度在健康與易感病煙田差異明顯，norank_o_Gaiellales顯著性差異最大（p≤0.001），其可能是造成健康與易感病煙田群落組成差異的關(guān)鍵物種。真菌在屬水平上，具有顯著差異的前5種菌屬分別是norank_o_Sordariales、norank_o_Tremellales、norank_p_Ascomycota、假霉樣真菌屬（Pseudallescheria）和norank_o_Chaetothyriales（圖3b）。其中，norank_o_Sordariales在易感病煙田占據(jù)顯著優(yōu)勢，Pseudallescheria相對豐度雖不高，但達(dá)到了極顯著差異。

2.3.2? 根際土壤微生物差異物種與理化性質(zhì)、酶活性之間的相關(guān)性? 為探討影響健康與易感病煙田根際土壤微生物群落組成差異的因素，將顯著差異物種與表現(xiàn)出極顯著差異的土壤環(huán)境因子進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析（表5和6）。發(fā)現(xiàn)，norank_p_Saccharibacteria與全氮和有效磷極顯著負(fù)相關(guān)，與蛋白酶顯著正相關(guān)。norank_o_Gaiellales與有機(jī)質(zhì)和磷酸酶極顯著正相關(guān)，與過氧化氫酶極顯著負(fù)相關(guān)。Nocardioides與有機(jī)質(zhì)和磷酸酶極顯著正相關(guān)，與過氧化氫酶和蛋白酶顯著負(fù)相關(guān)。norank_o_Sordariales與有機(jī)質(zhì)、全磷、堿解氮和脲酶極顯著正相關(guān)，與過氧化氫酶極顯著負(fù)相關(guān)。Pseudallescheria與磷酸酶顯著正相關(guān)，與蛋白酶顯著負(fù)相關(guān)，表明土壤環(huán)境與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)之間存在一定關(guān)系。

3 ?討? 論

本研究結(jié)果表明，健康與易感病煙田根際土壤細(xì)菌在門水平優(yōu)勢菌組成基本相似。變形菌門、放線菌門和綠彎菌門為優(yōu)勢菌群，這與前人測定的煙田土壤中優(yōu)勢菌一致^[14-15]。放線菌，大多為腐生細(xì)菌，能夠?qū)又参餁埡「癄€，但少數(shù)寄生性放線菌則能引起某些動植物病害^[16-17]，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與健康煙田相比，放線菌門中的norank_o_Gaiellales和Nocardioides在易感病煙田占顯著優(yōu)勢，且都與有機(jī)質(zhì)有極強(qiáng)的正相關(guān)性，李盼盼等^[18]研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)質(zhì)含量過高，可能會影響煙株的生長，有機(jī)質(zhì)含量越高，可能越有利于潛在病原菌的生長，導(dǎo)致有益菌相對豐度下降，進(jìn)而影響植株的正常生長，例如，糖化細(xì)菌門中norank_p_Saccharibacteria相對豐度在易感病煙田顯著下降，糖化細(xì)菌可利用微生物處理的植物源碳為自身提供能量，通過與有害微生物競爭改善土壤質(zhì)量^[19-21]。真菌中子囊菌門在易感病煙田中占據(jù)明顯優(yōu)勢，其中，易感病煙田中norank_o_Sordariales相對豐度較健康煙田高54.62%，與全磷和堿解氮有極強(qiáng)的相關(guān)性，該菌屬于子囊菌門糞殼菌綱（Sordariomycetes），糞殼菌綱中含有較多植物病原菌，能夠侵染植物根系，引發(fā)植物病害^[22]，從側(cè)面反映出合理控制土壤養(yǎng)分對于減少潛在病原菌的富集至關(guān)重要。陳乾錦等^[14]在研究青枯病時發(fā)現(xiàn)，Pseudallescheria在發(fā)病土壤中豐度較高，且是健康土壤的2倍，而本研究結(jié)果顯示，Pseudallescheria雖在健康與易感病煙田表現(xiàn)出極顯著性差異，但相對豐度較低，考慮到易感病煙田未出現(xiàn)發(fā)病情況，推測Pseudallescheria的豐度與青枯病的發(fā)生存在一定的聯(lián)系。2018年易感病煙田未發(fā)病，但易感病煙田青枯病病原菌屬Ralstonia及根腐病病原菌屬Fusarium含量均高于健康煙田（雖未達(dá)到顯著水平）。總之，易感病煙田中含有較多的潛在病原菌，雖未產(chǎn)生病害，但并不能說明其已向健康煙田轉(zhuǎn)化，可能與氣候有一定的關(guān)系，需進(jìn)一步分析。

同時，在健康煙田根際土壤中存在較多的有益菌，比如unclassified_f_Micrococcacea和Bradyrhizobium，這兩種菌雖未達(dá)到顯著水平，但其相對豐度較易感病煙田高。相關(guān)研究證實(shí)，unclassified_f_Micrococcacea，放線菌門下的微球菌科，感染青枯病的土壤中unclassified_f_

Micrococcacea相對豐度顯著低于健康土壤^[14];Bradyrhizobium，一種固氮菌，在患青枯病煙株根際土壤中占據(jù)顯著優(yōu)勢^[23]，與本研究結(jié)論相悖，但說明這兩種菌同樣與青枯病存在一定的關(guān)系，具體關(guān)系有待進(jìn)一步探討。易感病煙田根際土壤中也含有有益菌，比如厚壁菌門下的Bacillus。眾多文獻(xiàn)中提到Bacillus對黑脛病及根腐病有較好的防治作用^{[15，24-26]}。同時，它還是高效的解磷微生物，為植物提供磷素營養(yǎng)^[27-28]，從側(cè)面證實(shí)了易感病煙田根際土壤中有效磷和磷酸酶活性較高的原因。

眾所周知，土傳病害的發(fā)生需滿足高溫高濕的條件，比如，黑脛病最適宜溫度為24～25 ℃，當(dāng)相對濕度達(dá)到80%以上且保持3～5 d，才會出現(xiàn)發(fā)病高峰期;青枯病，30～35 ℃為最適宜溫度，相對濕度達(dá)90%以上且保持7～10 d，煙株才會出現(xiàn)典型癥狀^[29]。而2018年四川涼山州德昌縣并未出現(xiàn)高熱高濕氣候，有益菌占領(lǐng)主要生態(tài)位，抑制了病原菌繁殖，潛在病原菌沒有適宜的生長環(huán)境，易感病煙田土壤微生物達(dá)到了動態(tài)平衡，減輕了潛在病原菌對煙株的影響，最終使易感病煙田幾乎沒有發(fā)病。今后應(yīng)持續(xù)跟進(jìn)調(diào)查，進(jìn)一步研究煙田發(fā)病程度與土壤微生物菌群的關(guān)系。

4? 結(jié)? 論

健康與易感病煙田根際土壤微生物群落組成存在差異，易感病煙田中存在較多潛在病原菌。土壤性質(zhì)會影響微生物的群落結(jié)構(gòu)，可通過調(diào)控措施改善土壤性質(zhì)及微生物群落結(jié)構(gòu)，減少病原菌定殖，有效防控?zé)熖锿羵鞑『?，?shí)現(xiàn)易感病煙田向健康煙田轉(zhuǎn)化的目的。

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