張疏雨 馮 敏 李劍梅 柴林山 徐 沖 郭玲玲 關(guān)艷麗 馬征遠(yuǎn)

（遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧朝陽122000）

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）[1-2]在傳統(tǒng)栽培模式中的二級菌種往往采用固體枝條培養(yǎng)，這已經(jīng)遠(yuǎn)不能滿足杏鮑菇產(chǎn)業(yè)日益增長的需要。液體發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)菌絲體周期短、成本低、產(chǎn)量大，具有廣闊的生產(chǎn)前景[3]。

不同的微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的要求不盡相同，一般微生物發(fā)酵培養(yǎng)基包括碳源、氮源、無機鹽離子、微量元素和生長素等[4]。培養(yǎng)基中碳源、氮源等營養(yǎng)因子是微生物生長和代謝物合成所需營養(yǎng)物質(zhì)的主要來源，它的種類、濃度等與細(xì)胞生長及其代謝物合成直接相關(guān)[5]。筆者前期研究了9種碳源（乳糖、甘油、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、果糖、麩皮、淀粉）和10種氮源（酵母膏、尿素、玉米粉、牛肉膏、牛肉蛋白胨、牛肉浸膏、磷酸二氫銨、蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸銨）對杏鮑菇發(fā)酵液菌絲干重的影響，篩選出葡萄糖、麩皮、蛋白胨、酵母膏為液體培養(yǎng)杏鮑菇較好碳氮源。試驗以雜交育種選育得到的優(yōu)良杏鮑菇1號菌株為模式菌株，以進一步提升試驗菌株液體發(fā)酵能力、建立杏鮑菇高產(chǎn)菌株培養(yǎng)技術(shù)模型為目標(biāo)，采用單因子及正交試驗的方法，考察葡萄糖、麩皮、蛋白胨、酵母膏對發(fā)酵液菌絲體干重的影響，并獲得初步結(jié)果，為建立杏鮑菇二級菌種培養(yǎng)技術(shù)模型提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

試驗菌株為杏鮑菇1號，由遼寧省微生物科學(xué)研究院提供。

1.2 培養(yǎng)材料及配方

培養(yǎng)原材料：葡萄糖、蛋白胨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、酵母膏、麩皮、玉米粉、蔗糖、麥芽糖、氫氧化鈉、鹽酸、瓊脂等。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，玉米粉2 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，瓊脂粉12 g，加水至1000 mL（pH7.0）。

搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，麩皮20 g，玉米粉 5 g，酵母膏 3 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂 0.5 g，加水至1000 mL（pH7.0）。

1.3 儀器

HF Safe-1200生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司），LDZX-75KBS立式高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械有限公司），SPH-2102立式雙層恒溫?fù)u床（上海世平實驗設(shè)備有限公司），BCD-649WAD冰箱（青島海爾股份有限公司），SPX-450生化培養(yǎng)箱[中儀國科（北京）科技有限公司）]。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種活化

制備PDA平板培養(yǎng)基，在平板培養(yǎng)基中央接入杏鮑菇斜面菌種，在（25±1）℃條件下避光培養(yǎng)7 d，獲得F1代試驗菌株斜面培養(yǎng)物；無菌挑取新鮮斜面培養(yǎng)物于無菌水中，振蕩處理成菌懸液，無菌涂布于預(yù)制好的PDA綜合培養(yǎng)基上，18℃避光培養(yǎng)至平板上均勻布滿菌絲為止，備用。

1.4.2 一級液體菌種的制備

制備搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分裝在250 mL三角瓶中，裝入量為100 mL，121℃滅菌30 min。待培養(yǎng)基冷卻后，無菌條件下，用經(jīng)滅菌的直徑6 mm打孔器打取已活化平板菌塊，接種到搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，每瓶4塊。在搖床（140 r/min），恒溫（25±1）℃，避光培養(yǎng)96 h，待瓶內(nèi)產(chǎn)生細(xì)小均勻的菌球時終止培養(yǎng)，獲得一級搖瓶菌種。

1.4.3 菌絲體搖瓶培養(yǎng)

將葡萄糖（g/L）、麩皮（g/L）分別按10，20，30，40，50，60，70，80；玉米粉（g/L）、酵母膏（g/L）分別按1，2，3，4，5，6，7，8，9加入搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶分裝100 mL，滅菌冷卻后每瓶接入10%一級搖瓶種，搖床（140 r/min）恒溫（25±1）℃培養(yǎng)96 h。分別考察不同質(zhì)量濃度的葡萄糖、麩皮、玉米粉、酵母膏對杏鮑菇發(fā)酵液菌絲體干重的影響，以確定碳、氮源優(yōu)化質(zhì)量濃度范圍。每個處理重復(fù)3次。

1.4.4 菌絲生物量測定

將培養(yǎng)好的杏鮑菇發(fā)酵液用80目的篩網(wǎng)過濾，收集菌絲體，用水沖洗，于55℃烘干至恒重、稱量。

1.4.5 杏鮑菇液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

設(shè)計4因素3水平L9（34）的正交試驗，通過測定杏鮑菇發(fā)酵液菌絲體干重來確定影響杏鮑菇生長的最佳葡萄糖、麩皮、玉米粉、酵母膏的配比。正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平

圖1 葡萄糖質(zhì)量濃度對杏鮑菇發(fā)酵液菌絲干重的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 適宜葡萄糖質(zhì)量濃度

由圖1可知，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的上升，杏鮑菇發(fā)酵液菌絲體干重呈先升高再降低的趨勢。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為30 g/L時，菌絲體干重最高，葡萄糖質(zhì)量濃度超過50 g/L時，菌絲體干重下降加速?？傮w來看，葡萄糖質(zhì)量濃度為30～40 g/L時，杏鮑菇發(fā)酵液的菌絲體干重最大。由此看出，碳源過量使發(fā)酵液的pH與黏度均發(fā)生改變，影響菌絲體的生長和代謝；碳源不足容易引起菌絲體的衰老和自溶。因此確定葡萄糖的適宜質(zhì)量濃度為30～40 g/L。經(jīng)計算，得菌絲體干重（y）與葡萄糖質(zhì)量濃度（x）的函數(shù)關(guān)系式：y=1×10-5x3-0.002x2+0.0944x+1.3518，R2=0.9958，模型擬合較好。

2.2 適宜麩皮質(zhì)量濃度

由圖2可知，隨著麩皮質(zhì)量濃度的增加，杏鮑菇發(fā)酵液的菌絲體干重呈先升高再降低的趨勢，麩皮適宜質(zhì)量濃度為40～50 g/L。經(jīng)計算，得菌絲體干重（y）與麩皮質(zhì)量濃度（x）的函數(shù)關(guān)系式：y=2×10-7x4-4×10-5x3+0.0022x2-0.0325x+2.2205，R2=0.9936，模型擬合較好。

圖2 麩皮質(zhì)量濃度對杏鮑菇發(fā)酵液菌絲干重的影響

圖3 玉米粉質(zhì)量濃度對杏鮑菇發(fā)酵液菌絲干重的影響

2.3 適宜玉米粉質(zhì)量濃度

如圖3所示，玉米粉質(zhì)量濃度從1 g/L增加到5 g/L時，隨其質(zhì)量濃度的增加，杏鮑菇發(fā)酵液的菌絲體干重呈明顯上升趨勢；當(dāng)玉米粉質(zhì)量濃度從5 g/L增加到6 g/L時，菌絲體干重下降，但下降幅度不大；當(dāng)玉米粉質(zhì)量濃度從6 g/L上升到8 g/L時，菌絲體干重下降明顯。由此確定玉米粉的適宜質(zhì)量濃度為4～6 g/L。經(jīng)計算，得菌絲體干重（y）與玉米粉質(zhì)量濃度（x）的函數(shù)關(guān)系式：y=0.0025x3-0.0485x2+0.2952x+1.9525，R2=0.9934模型擬合較好。

2.4 適宜酵母膏質(zhì)量濃度

由圖4可知，隨著酵母膏質(zhì)量濃度的增加，杏鮑菇發(fā)酵液菌絲體干重呈現(xiàn)快速升高后緩慢下降的趨勢，在酵母膏質(zhì)量濃度為4 g/L時菌絲體干重達到最高值。由此確定酵母膏的適宜質(zhì)量濃度為3～5 g/L。經(jīng)計算，得菌絲體干重（y）與酵母膏質(zhì)量濃度（x）的 函 數(shù) 關(guān) 系 式 ：y=-0.001x4+0.0247x3-0.2131x2+0.7807x+1.5621，R2=0.9998模型擬合較好。

圖4 酵母膏質(zhì)量濃度對杏鮑菇發(fā)酵液菌絲干重的影響

2.5 杏鮑菇液體培養(yǎng)基優(yōu)化

以葡萄糖、麩皮、玉米粉、酵母膏為試驗因素，分別設(shè)3個水平，設(shè)計L9（34）正交表，進行杏鮑菇液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗，正交試驗結(jié)果見表2、3。

表2 正交試驗結(jié)果

從表2、表3可以看出，4個試驗因素對杏鮑菇發(fā)酵菌絲體干重的影響程度依次為A（葡萄糖）＞B（麩皮）＞C（玉米粉）＞D（酵母膏），葡萄糖對菌絲體干重的影響最大，且存在顯著性差異（P＜0.05），其次為麩皮。

表3 正交試驗方差分析

試驗最佳組合為A3B2C3D1，即最佳培養(yǎng)基配方為葡萄糖35 g，麩皮50 g，玉米粉6 g，酵母膏3 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂 0.5 g，加水至1000 mL（pH7.0）。為了驗證上述結(jié)果的可靠性，在最佳工藝條件下進行杏鮑菇液體發(fā)酵驗證試驗，重復(fù)3次，菌絲體干 重分別為 2.756 g/100 mL、2.737 g/100 mL、2.748 g/100 mL，平均為2.747 g/100 mL，3次結(jié)果差異較小，表明優(yōu)化獲得的工藝條件重復(fù)性好，穩(wěn)定可靠。

3 小結(jié)

在單因素試驗基礎(chǔ)上進行多因素正交試驗表明，對菌絲體（杏鮑菇1號）干重的影響程度依次為葡萄糖＞麩皮＞玉米粉＞酵母膏，葡萄糖對發(fā)酵液菌絲干重影響最大，且存在顯著性差異（P＜0.05），其次為麩皮，獲得了有利于杏鮑菇1號液體發(fā)酵的培養(yǎng)基基礎(chǔ)配方。

相對于傳統(tǒng)的枝條菌種來說，液體發(fā)酵具有周期短、產(chǎn)量大、操作簡單等優(yōu)勢，隨著對其研究的不斷深入，工廠化大量生產(chǎn)發(fā)酵液菌絲體將成為可能，并將廣泛應(yīng)用于制作杏鮑菇二級菌種；同時發(fā)酵液菌絲體也可作為菌體蛋白應(yīng)用在動物飼料或食品添加劑中。因此，液體發(fā)酵技術(shù)在杏鮑菇等食藥用菌的生產(chǎn)中具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>